CC BY
23
УДК 635-342: 631-527-56
DOI 10.34677/0021-342X-2019-2-136-141
Известия ТСХА, выпуск 2, 2019
ВОЗНИКНОВЕНИЕ OGURA-ПОДОБНОЙ ЦМС В РАСТЕНИЯХ BRASSICA ПРИ ОТДАЛЕННОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
О.Н. ЗУБКО1, С.Г. МОНАХОС1, Г.Ф. МОНАХОС2
(1 Кафедра ботаники, селекции и семеноводства садовых растений РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2 ООО «Селекционная станция имени Н.Н. Тимофеева»)
В ранее нами проведенном исследовании в потомстве BC1 от межвидового скрещивания тетраплоидной фертильной B. oleracea с аллотетраплоидной фертильной B. carinata было обнаружено одно растение с мужской стерильностью, БКБюЗ. Мужская стерильность проявлялась в формировании аномально развитых тычинок и отсутствии фертильной пыльцы, остальные части цветка развивались и функционировали нормально. Единообразное проявление мужской стерильности у растений второго беккроссного поколения (BC2) от скрещивания растения BC1 с фертильной линией диплоидной капусты белокочанной указывало на стабильность проявления и цитоплазматический характер ее наследования. Для установления типа спонтанно возникшей цитоплазматической мужской стерильности потомства BC1 и BC2 проведен молекулярно-генетический анализ с использованием or/138-маркера и установлено, что данная ЦМС является ogura-подобной. В результате ПЦР-анализа фер-тильных линий B. carinata, B. oleracea, а также фертильных растений BC2-потомства и частично фертильного межвидового гибрида (B. oleracea х B. carinata) выявлено наличие амплифицируемого фрагмента размером около 600 п.н. Присутствие данного фрагмента у фертильных генотипов может свидетельствовать о химерности их митохондриальных геномов и сопряжено с появлением ogura-подобной ЦМС в цитоплазме С генома B. oleracea потомства от межвидовой гибридизации.
Ключевые слова: цитоплазматическая мужская стерильность, ЦМС, Оgura, межвидовая гибридизация, Brassica, ПЦР-анализ
Введение
Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) - это более надежная и эффективная, по сравнению с самонесовместимостью, система биологического контроля опыления в производстве Fl-гибридов капусты белокочанной. В семействе Brassicace-ae известны три основных типа цитоплазмы, обуславливающих цитоплазматическую мужскую стерильность - ogura polima, и napus [6]. Наиболее изученной, стабильной в своем проявлении и широко распространенной в селекции и семеноводстве капустных культур является аллоплазматическая ogura-ЦМС. Ogura-ЦМС интродуцирована в основные экономически значимые виды Brassica, в том числе в капусту белокочанную (B. oleracea L.), посредством отдаленной гибридизации и технологии спасения зародышей из дайкона (Raphanus sativus L. ssp. acanthiformis (Morel) Stankev), в котором она впервые была обнаружена [6]. Молекулярно-генетическое изучение факторов, вызывающих ogura-ЦМС, показало, что она сопряжена с наличием химерного митохон-дриального гена orf138, который в настоящее время секвенирован и маркирован [7].
В литературе, кроме работ, описывающих процесс интродукции ЦМС посредством отдаленной гибридизации и совершенствования ogura-ЦМС-системы посредством слияния протопластов, встречаются работы, описывающие возникновение ogura-подобной ЦМС, выявляемой соответствующими ДНК-маркерами, в по-томствах от межвидовой и межродовой гибридизации Brassica при использовании
фертильных отцовских и материнских растений, о^ига-ЦМС которых не выявляется молекулярными маркерами [3, 4].
Нами в ранее проведенных исследованиях был получен частично фертильный (фертильность пыльцы 33,3%) межвидовой гибрид (БК) от скрещивания фертильной тетраплоидной линии Бю-1 капусты белокочанной (В. о1егасеа, 2п = 36, геномная формула СССС) и фертильной инбредной линии Р1199947 аллотетраплоидной горчицы эфиопской (В. carinata, 2п = 34, геномная формула ВВСС) [1]. В беккроссном потомстве этого гибрида при опылении диплоидной фертильной инбредной линией Бю3 капусты белокочанной (В. о1егасеа, 2п = 18, геномная формула СС) обнаружено одно растение, обозначенное БКБю3, с мужской стерильностью.
С целью изучения типа цитоплазматической мужской стерильности, обнаруженной у потомств от отдаленной гибридизации капусты белокочанной (В. о1егасеа) и горчицы эфиопской (В. carinata), нами проведен молекулярно-генетический анализ растений этих потомств с использованием ДНК-маркера ogura-цитоплазмы ог/138.
Материалы и методы
Растительный материал: фертильные инбредные линии Цв9, Пр3 и Тен капусты белокочанной (В. о1егасеа); фертильная инбредная линия Р1199947 горчицы эфиопской (В. cаrinаtа)^; частично фертильный (33%) межвидовой гибрид БК от скрещивания В. о1егасеа (учетверенногаплоидной, 2п = 4х, линии Бю-1, произведенной в культуре изолированных микроспор) и В. carinata (аллотетраплоидная, 2п = 4х, инбредная линия Р1199947); фертильные растения ВС1 БюБК1, БКБю9, БКЗм10; линии капусты белокочанной с ogura-ЦМС Зму7мс и Гэс2мс ^ига-ЦМС передана из коммерческих гибридов капусты белокочанной французского происхождения); ВС1-растение БКБю3 со спонтанно возникшей мужской стерильностью, обнаруженное в первом беккроссном потомстве межвидового гибрида БК; 4 растения ВС2-потомства (БКБю3)*Цв9 (1-4), унаследовавших спонтанно возникшую в ВС1 мужскую стерильность.
Общую ДНК выделяли из молодых листьев каждого растения СТАВ-методом [5]. Митохондриальный ген ог/138 амплифицировали с использованием праймеров огШ8-5' 5'^ТСШТАТС^АССТСЖ:ААС-3' и огШ8-3' 5'-CAATTGGGTTCA-CAAAGCAT-3' [4]. Реакционную смесь для ПЦР готовили как описано в [2], амплификацию проводили по следующей программе: начальная денатурация - 94°С в течение 4 минут, далее 30 циклов: денатурация - 94°С, 1 мин; отжиг праймеров - 60°С, 1 мин; элонгация - 72°С, 1 мин; и завершающая элонгация - 72°С, 5 мин. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,5%-м агарозном геле. Визуализировали в проходящем УФ-свете трансиллюминатора при окрашивании ДНК флуоресцирующим красителем GelRed.
Результаты
В беккроссном потомстве ВС1 при опылении межвидового гибрида БК (В. о1-егасеа х В. carinata) диплоидной фертильной инбредной линией Бю3 капусты белокочанной (В. о1егасеа) наблюдали широкое разнообразие по морфологическим признакам и числу хромосом, которое варьировало от 18 до 26 (рис. 1).
При этом было обнаружено одно растение, обозначенное БКБю3, с мужской стерильностью. Стерильность проявлялась в виде редукции и некротизации пыльников, отсутствия фертильной пыльцы, при этом морфология и функциональность остальных элементов цветка, включая выработку нектара и завязываемость семян при перекрестном опылении, соответствовали цветкам фертильных растений (рис. 2).
А
Б
Рис. 1. Метафазные пластинки клеток корневых меристем растений первого беккроссного потомства (BC1) (B.oleracea, CCCC х B.carinata, BBCC) х B.oleracea, CC: А) БКБюЗ (2n = 18), Б) БКБю2 (2n = 26)
Растение имело фенотип капусты белокочанной и обладало характерным для данного вида числом хромосом, 2n = 18.
Наследование мужской стерильности всеми растениями второго беккроссного поколения (BC2) от скрещивания растения BC1 БКБюЗ с инбредной линией Цв9 диплоидной капусты белокочанной указывало на стабильность проявления и цитоплазматический характер ее наследования. Хромосомные аберрации как возможная причина проявления стерильности потомства при отдаленной гибридизации у 3-х выборочно проанализированных растений BC2 отсутствовали. В связи с известными фактами обнаружения мужской стерильности в потомствах от отдаленной гибридизации фертильных представителей Brassica других исследователей данная спонтанная мужская стерильность в беккроссном потомстве межвидового гибрида (B.oleracea, CCCC * B.carinata, BBCC) была принята нами за новый тип стерильности.
Скрининг стерильного BCl-растения БКБюЗ со спонтанно возникшей мужской стерильностью и четырех растений BC2-потомства (БКБю3)*Цв9 (1-4), унаследовавших данную мужскую стерильность, частично фертильного межвидового гибрида БК (B. oleracea х B. carinata), его родительской линии PI199947 (B. carinata), а также коллекции фертильных инбредных линий и мужскистерильных линий капусты белокочанной с известным ogura-типом цитоплазмы с использованием праймер-комбинации (orf138-5', orf138-3') на участок мтДНК, содержащий ген orf138 [4], дал следующие результаты: амплификация ожидаемого фрагмента (~500 пар нукле-отидов) у образцов с ogura-цитоплазмой Зму7мс и Гэс2мс (№ 3 и 4 на рис. 3) и его отсутствие у фертильных линий капусты Цв9, Пр3 и Тен (№ 1, 2 и 15 на рис. 3) свидетельствовали об адекватности используемой маркерной системы для дифференциации стерильных и фертильных образцов капусты.
BO-растение БКБю3 (№ 10 на рис. 3) со спонтанно возникшей мужской стерильностью и четыре проанализированных растения BC2-потомства (БКБю3) *Цв9 (№ 11-14 на рис. 3) содержали амплифицированный фрагмент, свидетельствующий
Рис. 2. Редуцированные, некротизированные пыльники растения второго беккроссного поколения (ВС2)
БКБю3Цв9 ((В.о1егасеа, СССС х X В.саппаГа, ВВСС) х В.о1егасеа, СС)) х х В.о1егасеа, СС с мужской стерильностью
о наличии в них митохондриальной ДНК химерного гена ogura-ЦМС orf138. На основании данных результатов можно сделать заключение о том, что данные стерильные растения BC1 и ВС2-потомства содержат ogura-подобную ЦМС. В то же время ПЦР-анализ фертильных растений потомства BC1 БюБК1, БКБю9, БКЗм10 (№ 7, 8 и 9 на рис. 3), частично фертильного межвидового гибрида БК (№ 6 на рис. 3) и его отцовской родительской линии PI199947 (№ 5 на рис. 3) выявил слабо проявляющийся на электрофореграмме фрагмент размером около 600 п.н., при ожидаемом отсутствии маркера ogura-ЦМС. Какую нуклеотидную последовательность содержит в себе этот фрагмент, может показать только его секвенирование. Но вопрос о том, каким образом и на каком этапе сформировался выявляемый используемым маркером ген orf138 в мтДНК потомств межвидовых гибридов, остается открытым. Неотчетливо проявляющийся на электрофореграмме фрагмент ~600 п.н. у фертильных растений межвидового гибрида БК (B. oleracea х B. carinata), отцовской родительской линии PI199947 (B. carinata), потомства BC1 (БюБК1, БКБю9, БКЗм10) и в том числе у ин-бредной линии капусты белокочанной Цв9 может свидетельствовать о наличии у вышеперечисленных образцов в незначительном количестве мтДНК с геном orf138 или вариантом этого гена, т.е. о химерности цитоплазмы проанализированных растений. Соответственно, появление растений с мужской стерильностью в потомстве от межвидовой гибридизации в условиях нарушений нормального хода митотического деления клеток спорофита и мейотического деления при формировании мегаспор возможно в результате случайного расхимеривания цитоплазмы и формирования растений-потомков, у которых преобладают митохондрии, содержащие мтДНК с геном orf138.
Рис. 3. ПЦР-анализ наличия/отсутствия специфичного для ogura-ЦМС ог/138-гена с использованием пары праймеров огЛ38-5' и огЛ38-3': линия 1 - Цв9, 2 - Пр3, 3 - Зму7мс, 4 - Гэс2мс, 5 - Р1199947, 6 - БК, 7 - БюБК1, 8 - БКБю9, 9 - БКЗм10, 10 - БКБюЗ, 11-14 (БКБю3хЦв9) (1-4 растения), 15 - Тен, 16 - контроль Н20, 17 - маркер размера ДНК-фрагментов «Ш0 Ьр», п.н. - пар нуклеотидов
Заключение
Обнаруженная нами у беккроссного потомства (ВС1) межвидового гибрида (В.о1егасеа х B.carinata) ogura-подобная ЦМС не передавалась из известных доноров, но возникла спонтанно. Эту ogura-подобную ЦМС рекомендуем использовать в селекционных программах по созданию F1-гибридов капусты.
Библиографический список
1. Зубко О.Н., Монахос С.Г. Отдаленная гибридизация для передачи устойчивости к сосудистому бактериозу // Картофель и овощи, 2016, № 11. С. 39-40.
2. Нгуен М.Л., Монахос Г.Ф., Комахин Р.А., Монахос С.Г. Новый локус устойчивости к киле в хромосоме А05 капусты пекинской (Brassica rapa L.) // Генетика, 2018, т. 54, № 3. С. 306-315.
3. Hirata Y, Motegi T, Takeda Y, Moriwaki K. Induction of sterility in the seed progeny derived from artificially synthesized interspecific chimera in Brassica // Euphytica, 2001, № 117. P. 143-149.
4. Motegi T., Nou I., Zhou J., Kanno J., Kameya A., Hirata Y. Obtaining an Ogura-type CMS line from asymmetrical protoplast fusion between cabbage (fertile) and radish (fertile) // Euphytica, 2003, № 129. P. 319-323.
5. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research, 1980, № 19. P. 4321-4325.
6. Yamagishi H., Bhat S.R. Cytoplasmic male sterility in Brassicaceae crops // Breeding Science, 2014, № 64. P. 38-47.
7. Yamagishi H., Terachi T. Molecular and biological studies on male sterile cytoplasm in the Cruciferae. III. Distribution of Ogura-cytoplasm among Japanese wild radishes and Asian radish cultivars // Theor Appl Genet, 1996, № 93. P. 325-332.
INTERSPECIFIC HYBRIDIZATION AS AN INDUCING FACTOR OF OGURA-TYPE CMS IN BRASSICA PLANTS
O.N. ZUBKO1, S.G. MONAKHOS1, G.F. MONAKHOS2
(1 Department of Botany, Breeding and Seed Production of Horticultural Crops,
Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy, 2 LLC "Breeding station after N.N. Timofeev")
Abstract. In our recent study the one male sterile plant BKBu3 has been found in BCl-progeny from interspecific crossing of tetraploid fertile B. oleracea and allotetraploid fertile B. carinata lines. The flowers of male sterile plant had reduced, necrotic anthers, and no fertile pollen was observed. However, other organs of flowers were phenotypically and functionally normal. No segregation in sterility/fertility morphology of the BC2 progeny plants indicated a cytoplasmic mode of male sterility inheritance. To determine the type of the found cytoplasmic male sterility (CMS), the authors conducted a molecular-genetic analysis using orf138-specific primers. The PCR analysis indicated that the found cytoplasmic male sterility is of an Ogura-type. Screening the fertile lines of B. carinata, diploid B. oleracea, and fertile plants of BC2 progeny of interspecific cross and a partially fertile B. oleracea-carinata hybrid revealed ~600 bp amplicons that are not matched to the orf138-marker fragment. It was suggested that the presence of ~600 bp amplicons could be an outcome of chimeric cytoplasm of male fertile plants, and it could also be a reason why CMS plants are formed in a progeny of interspecific hybrids.
Key words: cytoplasmic male sterility, CMS, Ogura, interspecific hybridization, Brassica, PCR-analysis
References
1. Zubko O.N., Monakhos S.G. Otdalennaya gibridizatsiya dlya peredachi ustoychi-vosti k sosudistomu bakteriozu [Remote hybridization for the transfer of black rot resistance] // Kartofel' i ovoshchi, 2016, No. 11. Pp. 39-40.
2. NguyenM.L., Monakhos G.F., Komakhin R.A., Monakhos S.G. Novyy lokus us-toychivosti k kile v khromosome A05 kapusty pekinskoy (Brassica rapa L.) [New locus of carina resistance in chromosome A05 of Peking cabbage (Brassica rapa L.)] // Genetika, 2018, vol.54, No. 3. Pp. 306-315.
3. Hirata Y, Motegi T, Takeda Y, Moriwaki K. Induction of sterility in the seed progeny derived from artificially synthesized interspecific chimera in Brassica // Euphytica, 2001, No. 117. Pp. 143-149.
4. Motegi T., Nou I., Zhou J., Kanno J., Kameya A., Hirata Y. Obtaining an Ogura-type CMS line from asymmetrical protoplast fusion between cabbage (fertile) and radish (fertile) // Euphytica, 2003, no. 129. Pp. 319-323.
5. Murray M. G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research, 1980, No. 19. Pp. 4321-4325.
6. Yamagishi H., Bhat S.R. Cytoplasmic male sterility in Brassicaceae crops // Breeding Science, 2014, no. 64. Pp. 38-47.
7. Yamagishi H., Terachi T. Molecular and biological studies on male sterile cytoplasm in the Cruciferae. III. Distribution of Ogura-cytoplasm among Japanese wild radishes and Asian radish cultivars // Theor Appl Genet, 1996, no. 93. Pp. 325-332.
Зубко Ольга Николаевна - аспирант кафедры ботаники, селекции и семеноводства садовых растений ФГБОУ ВО «РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева», 127550, Российская Федерация, Москва, Тимирязевская, 49. e-mail: Zubkoolga21@mail.ru., тел.: +7 (968) 354-33-58.
Монахос Сократ Григорьевич - д.с.-х.н., заведующий кафедрой ботаники, селекции и семеноводства садовых растений ФГБОУ ВО «РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева», 127550, Российская Федерация, Москва, Тимирязевская, 49. e-mail: s.monakhos@rgau-msha.ru., тел.: +7 (499) 976-41-71.
Монахос Григорий Федорович - к.с.-х.н., генеральный директор ООО «Селекционная станция имени Н.Н. Тимофеева». 127550, Российская Федерация, Москва, Пасечная, д. 5, стр.2, к.11. e-mail: breedst@mail.ru., тел.: +7 (499) 977-11-74.
Olga N. Zubko- PhD student, the Department of Botany, Breeding and Seed Production of Horticultural Crops, Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy; phone.: +7 (968) 354-33-58; e-mail: Zubkoolga21@mail.ru.
Sokrat G. Monakhos - DSc (Ag), Head of the Department of Botany, Breeding and Seed Production of Horticultural Crops, Russian State Agrarian University - Moscow Timiryazev Agricultural Academy; phone.: +7 (499) 976-41-71; e-mail: s.monakhos@rgau-msha.ru.
Grigoriy F. Monakhos - PhD (Ag), General Manager, Limited company "Breeding station named afterN.N. Timofeyev"; phone.: +7 (499) 977-11-74; e-mail: breedst@mail.ru
