CC BY
24
УДК 616.248-003.233-076
Возможности цитологических и иммуноцитохимичЕских показателей индуцированной мокроты в оценке воспаления дыхательных путей при разных уровнях контроля бронхиальной астмы
С.Н. Поспелова, С.А. Собченко, В.Ю. Кравцов Северо-Западный медицинский университет им. И.И. Мечникова, кафедра пульмонологии,
Санкт-Петербург, РФ
Проанализированы цитологические и иммуноцитохимические показатели индуцированной мокроты, для определения которых использовался метод жидкостной цитологии, у 43 пациентов с разными уровнями контроля бронхиальной астмы. Данные жидкостных цитограмм свидетельствовали о наличии или отсутствии эозинофильного воспаления (относительное число эозинофилов > 3%), однако не позволяли найти отличия в выраженности воспаления дыхательных путей при уровнях неконтролируемой бронхиальной астме и частично контролируемом течении заболевания. Объективным показателем выраженности воспаления в бронхиальном дереве, достоверно коррелирующим с уровнями контроля заболевания, явилось соотношение ИЛ-1РА/ ИЛ-1Р в альвеолярных макрофагах.
ключевые слова: бронхиальная астма, уровни контроля, эозинофильное воспаление, жидкостная цитология, иммуноцитохимический метод, интерлейкин-1р, соотношение ИЛ-1РА/ ИЛ-1р.
Введение
Основной задачей лечения пациентов с бронхиальной астмой (БА) является не излечение, а достижение и поддержание клинического контроля с помощью адекватной терапии. К настоящему времени в международных руководствах по клинической практике ^ША, 2006, 2011) модифицирован ряд позиций в диагностике и терапии БА. В частности, в более ранних изданиях выбор терапии находился только в зависимости от оценки тяжести течения БА, которое в определенной мере оправдано в подборе начального терапевтического комплекса, но достаточно сложно при долгосрочном лечении. В редакции GINA, 2006 для решения вопросов о текущем лечении ведущее место отводится не классификации тяжести течения заболевания, а критериям контроля астмы. Эксперты GINA предлагают три уровня: контролируемая астма, частично контролируемая астма, неконтролируемая астма, оценка которых опирается до настоящего времени на анамнестические данные, астматические симптомы и функциональные показатели. Однако, поскольку БА относится к заболеваниям, основой которых является иммунное воспаление дыхательных путей, особую значимость приобретает определение наличия и выраженности воспаления в дыхательных путях с помощью доступных биологических маркеров, дающее возможность судить о степени контроля течения заболевания и объективизировать уровни контроля [1].
цель исследования: оптимизация оценки воспаления нижних дыхательных путей при контролируемом, частично контролируемом, неконтролируемом течении БА на основе изучения цитологических и иммуноцитохимиче-ских показателей индуцированной мокроты.
материалы и методы
Для достижения поставленной цели было проведено поперечное когортное исследование, в котором участвовали 43 пациента с БА (32 женщины, 11 мужчин) в возрасте от 21 до 78 лет (средний возраст 49,1±1,7 год) с разными уровнями контроля БА.
Уровни контроля БА устанавливались в соответствии с рекомендациями экспертов Глобальной инициативы по бронхиальной астме [3,4] по следующим показателям: количеству ночных симптомов в неделю; количеству дневных симптомов в день и неделю; суточной кратности применения р2-агонистов короткого действия; выраженности нарушений физической активности и сна; значениям объема форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), полученном на спирографе.
Три уровня контроля над астмой [8] предусматривают:
- при неконтролируемой астме обязательное увеличение объема базисной терапии для обеспечения текущего контроля. При этом, согласно определению, неконтролируемое течение астмы на протяжении недели рассматривается
как обострение и требует терапевтических мероприятий для лечения обострения астмы.
- частично контролируемая астма отличается наличием ограниченного числа показателей, неоднозначностью терапевтической тактики: рассматриваются возможности увеличения, или сохранения объема терапии для достижения лучшего контроля;
- при контролируемой астме рассматривается вопрос об уменьшении базисной терапии до минимального объема, обеспечивающего контроль.
Общеклиническое и функциональное обследование больных проводилось на фоне современной стандартной терапии, включающей противовоспалительную, бронхолитическую, симптоматическую терапию, согласно современным рекомендациям по лечению больных БА [3, 4, 7].
Особенности воспалительного процесса в дыхательных путях изучались по данным цитологического и иммуноцитохимического исследований индуцированной мокроты, которые проводились в лаборатории общеклинических и цитологических исследований Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова МЧС России под руководством д.б.н., профессора В.Ю. Кравцова.
Цитологические препараты ИМ получали методом жидкостной цитологии (после разжижения спутолизином и цитоцентрифугиро-вания на предметном стекле) в соответствии с рекомендациями Европейского респираторного общества (ЕРО) [11, 12, 19], рисунок 1. Для сравнения полученных цитограмм использовали показатели цитограмм индуцированной мокроты здоровых людей [10, 14, 21].
Иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных мышиных антител проводилось исследование содержания интерлейкина-1р (ИЛ-1р, IL-1P) и рецепторно-го антагонист ИЛ-1 (ИЛ-1 РА, IL-1 Ra) в альвеолярных макрофагах индуцированной мокроты. Результат иммуноцитохимического окрашивания оценивали полуколичественным методом Histology Score (HScore), рисунок 2.
Рис. 1. Жидкостная цитология. Поля зрения с макрофагами у пациента О с бронхиальной астмой. Окрашивание азур II - эозином по Романовскому. Увеличение х200 (б)
Рис. 2. Жидкостная цитология. Альвеолярные макрофаги с иммуноцитохимическим окрашиванием от 0 до 3 баллов по Жсоге. Увеличение х400
Статистическую обработку полученных результатов проводили c использованием программной системы STATISTICA for Windows (версия 5.5 Лиц. №AXXR402C29502 3FA). Методы описательной (дескриптивной) статистики включали в себя оценку среднего арифметического (М) и средней ошибки среднего значения (m). Сравнение количественных параметров, в исследуемых группах осуществлялось с использованием теста Манна-Уитни и модуля ANOVA [6]. Для выявления связей между исследуемыми параметрами рассчитывался коэффициент ранговой корреляции по Спирмену. Оценка изучаемых показателей в динамике выполнялась с помощью критерия знаков. Критерием статистической достоверности получаемых выводов мы считали общепринятую в медицине величину p<0,05 [2].
Результаты и их обсуждение
Проведено изучение цитограмм индуцированной мокроты, для определения которых использовался метод жидкостной цитологии, у 43 пациентов с бронхиальной астмой. На момент исследования у них диагностировались следующие уровни контроля, согласно критериям, изложенным в GINA-2011: неконтролируемое течение
заболевания (10 пациентов), частично контролируемая БА (12 пациентов) и контролируемая БА (21 пациент). Данные усредненных цитограмм мокроты у пациентов с разными уровнями контроля БА представлены в таблице 1.
Как следует из таблицы 1, на усредненной цитограмме ИМ пациентов с неконтролируемой БА (обострение) преобладали макрофаги. Доля макрофагов превысила половину всего клеточного состава и составила 59,6±6,2%. Ней-трофилы в долевом соотношении составили 29,0±7,1%. Что касается эозинофилов, то они обнаруживались достаточно часто, и в среднем на их долю пришлось, 6,2±2,0% от клеточного состава мокроты. Наконец, доля лимфоцитов составила - 3,8±0,8%, а базофилов - 0,2±0,1.
При частично контролируемой астме, по сравнению с неконтролируемым течением, выявлено достоверное изменение цитограммы в сторону нормализации ее показателей (доля макрофагов 70,3±5,5%, доля нейтрофилов 17,5±5,2%, р<0,05 в обоих случаях). Однако в содержании относительного числа эозинофилов (8,2±2,1%) не было найдено существенных отличий от доли эозино-филов у пациентов с неконтролируемым течением заболевания (р > 0,05, по и-критерию Вил-коксона-Манна-Уитни).
В цитограмме ИМ пациентов с контролируемой БА все лабораторные показатели соответствовали норме: число макрофагов 80,9±3,7%, число нейтрофилов 9,1±2,9%, эозинофилов 1,0±0,3%, что, безусловно, свидетельствовало об отсутствии воспаления в нижних дыхательных путях у пациентов этой группы. Нами выявлены достоверные отличия по содержанию клеток мокроты у пациентов, контролирующих БА, от пациентов с частично контролируемым и неконтролируемым течением заболевания (р<0,05 во всех случаях). Обращало на себя внимание
6-кратное снижение числа эозинофилов у пациентов, достигших контроля БА, по сравнению с неконтролируемым течением болезни.
Полученные данные, по сравнению с референтными цитограммами здоровых доноров, также полученными методом жидкостной цитологии, указывают на то, что содержание макрофагов было несколько снижено (59,6±6,2) по сравнению с нормой только в цитограммах ИМ пациентов с неконтролируемой БА. У здоровых доноров доля макрофагов в мокроте составляет 60-70% [14]. При сравнительном анализе цито-грамм пациентов с разными уровнями контроля БА обнаружено, что по мере уменьшения доли эозинофилов и нейтрофилов в мокроте повышалась до нормальных колебаний доля макрофагов. В свою очередь, доля нейтрофилов при всех уровнях контроля БА не отличалась от нормы. Так, по данным Gorska К и соавт. (2008), у здоровых доноров нейтрофилы составляют 30-40% и 37,5% - по данным ВеИа J и соавт. (2000). Существенно повышенный процент в усредненных цитограммах пациентов с неконтролируемым и частично контролируемым течением БА относительно нормы составили эозинофилы. Известно, что в цитограммах здоровых людей эозинофилы не превышают 3% [9, 10, 13-15, 18, 20, 21].
Таким образом, наши результаты изучения ци-тограмм, для определения которых использовался метод жидкостной цитологии, как и результаты других исследователей [1, 16] показали, что эози-нофилы являются важными провоспалительны-ми клетками при бронхиальной астме. В нашем исследовании эозинофилия мокроты отражает наличие воспаления в дыхательных путях как при неконтролируемом течении БА (обострении), так и при частично контролируемой БА на фоне проводимой терапии. Только по достижении пациентами полного контроля БА, когда нормализуют-
Таблица 1
исследование цитограмм цитоцентрифугатов мокроты при разных уровнях контроля БА, M±m
Показатели Уровни контроля п=43 р<0,05
1. Неконтролируемая астма п=10 2.Частично контролируемая п=12 3. Контролируемая астма п=21
Макрофаги, % 59,6±6,2 70,3±5,5 80,9±3,7 1-2, 1-3, 2-3
Лимфоциты, % 4,9±1,8 4,0±1,2 8,7±2,5
Нейтрофилы, % 29,0±7,1 17,5±5,2 9,1±2,9 1-2, 1-3
Эозинофилы, % 6,2±2,0 8,2±2,1 1,0±0,3 1-3, 2-3,
Базофилы, % 0,3±0,2 0,1±0,0 0,3±0,1
ся клинические и функциональные параметры и требуется минимальная поддерживающая терапия, либо ее отсутствие, наблюдается снижение относительного эозинофильного числа мокроты до нормальных значений.
Вместе с тем, остается неясным, как по данным жидкостных цитограмм пациентов отличить периоды слабого контроля БА (частично контролируемое течение) от обострений заболевания (неконтролируемое течение), то есть не только качественно, но и количественно определить выраженность воспаления в дыхательных путях.
До настоящего времени в мире не существует единого мнения в отношении значимых показателей, количественно определяющих уровень воспаления воздухоносных путей [9, 17, 20].
Нами проведено иммуноцитохимическое исследование цитокинов ^-1р и ИЛ-1РА (РАИЛ) в альвеолярных макрофагах индуцированной мокроты у обследуемых пациентов. Эту пару цито-кинов мы выбрали для исследования, поскольку именно она наиболее адекватна для оценки развития активности воспаления ИЛ-1Р и его завершения ИЛ-1РА (РАИЛ). Оба цитокина участвуют в воспалении: ИЛ-1Р является провоспалительным цитокином, запускающим воспалительный процесс и поддерживающим его активность, а ИЛ-1РА, как показали исследования, является естественным противовоспалительным агентом [5], цитокином - антагонистом ИЛ-1Р и блокирует его действие. Таким образом, соотношение ИЛ-1РА / ИЛ-1р является объективным общепризнанным показателем завершения воспаления и поэтому в нашей работе он может служить идеальным показателем оценки активности воспаления.
При изучении индуцированной мокроты в группах пациентов с разным уровнем контроля (рис. 6) самое высокое содержание ИЛ-1р наблюдалось у пациентов с неконтролируемым течением БА, оно в среднем составило 243,8±8,2 Шсоге. У пациентов с частично контролируемой БА в среднем уровень этого цитокина составил 102,8±18,7 Шсоге, существенно отличаясь по этому показателю от групп пациентов с неконтролируемой БА (р< 0,05). В группе пациентов с полным контролем БА наблюдалась минимальная концентрация провоспалительного цитокина, в среднем уровень цитокина ИЛ-1р составил 29,4±6,4 Шсоге, что достоверно отличало его от уровня этого цитокина при неконтролируемом и частично контролируемом течении БА (р< 0,05 в обоих случаях).
Результаты исследования свидетельствовали, что при неконтролируемой БА цитокин ИЛ-1р вырабатывается альвеолярными макрофагами в значительном количестве, уровень выработки его уменьшался в 2,4 крат в период слабого контроля (частично контролируемая БА) и резко снижался в 8,3 крат при достижении пациентами контроля БА.
Распределение уровня цитокина ИЛ-1РА альвеолярных макрофагах у этих же пациентов, в зависимости от уровня контроля представлено на рис. 4.
рис. 3. Содержание цитокина ИЛ-1Р в альвеолярных макрофагах индуцированной мокроты при разных уровнях контроля БА
рис. 4. Содержание ИЛ-1РА (РАИЛ) в альвеолярных макрофагах индуцированной мокроты при разных уровнях контроля бронхиальной астмы
Как видно на рис. 4, у большинства пациентов с неконтролируемым течением заболевания в среднем уровень ИЛ-1РА был равен 107,9±12,6 Шсоге, у пациентов с частично контролируемым течением в среднем уровень ИЛ-1РА составил 75,6±21,1 Шсоге, а у пациентов с полным контролем БА в среднем уровень содержания ИЛ-1РА был равен 92,7±17,1 Шсоге. Таким образом, содержание цитокина ИЛ-1 РА в альвеолярных макрофагах индуцированной мокроты у пациен-
тов с разными уровнями контроля БА не имело статистически значимых различий во всех случаях (р>0,05). Подобные данные получены другими исследователями, изучающими экспрессию цитокинов бронхиальным эпителием (в образцах бронхиальной биопсии) при астме [5].
У пациентов, достигших полного контроля БА на завершающем этапе исследования в среднем показатель отношения ИЛ-1 РА / ИЛ-1р был максимально высоким (6,1±1,7 Шсоге.), что достоверно отличало его от этого показателя при неконтролируемом (0,5±0,1 Шсоге.) и частично контролируемом (1,8±1,1 Шсоге.) течении БА (р< 0,05 в обоих случаях). И, что особенно интересно, выявлены достоверные различия по этому показателю в группах пациентов с частично контролируемым течением заболевания и неконтролируемом течении БА, р > 0,05, рис. 5.
25
20
со.
ч
К 15
Р.
s 10
5
0,5 -В—В—н Щ
0
Рис. 5. Соотношение ИЛ-1 РА/ ИЛ-1Р у пациентов с бронхиальной астмой при разных уровнях контроля
Полученные данные свидетельствуют о том, что по мере повышения уровня контроля БА увеличивается соотношение ИЛ-1РА / ИЛ-1р, при этом показатель имеет достоверные различия при неконтролируемом, частично контролируемом и контролируемом течении заболевания. И что особенно важно, отношение ИЛ-1РА /ИЛ-1Р является показателем завершенности достоверного перехода в контролируемое течение БА.
Корреляционный анализ выявил тесные прямые взаимосвязи соотношения ИЛ-1РА / ИЛ-1Р с контролируемым течением БА (г = 0,86, р<0,05) и обратные связи - с частичным контролем БА (г = -0,57, р<0,05) и с неконтролируемым течением БА (г = -0,72, р<0,05). Эти данные свидетельствовали о том, что чем выше показатель отношения ИЛ-1РА / ИЛ-1р, тем меньше выраженность воспаления в дыхательных путях, которое формирует бронхообструкцию и как результат клиническую симптоматику.
Заключение
Комплексное исследование жидкостных ци-тограмм индуцированной мокроты свидетельствовало о наличии (неконтролируемая, частично контролируемая БА) или отсутствии (контролируемая БА) эозинофильного воспаления. В качестве полезного биологического маркера воспаления использовалось относительное число эозинофилов, однако применение его не позволило отличить обострения (неконтролируемая БА) от периодов частичного контроля течения заболевания, то есть судить об активности воспаления при этих уровнях контроля БА. Объективным показателем выраженности воспаления в бронхиальном дереве, достоверно коррелирующим с уровнями контроля заболевания, явилось соотношение ИЛ-1РА/ ИЛ-1р в альвеолярных макрофагах индуцированной мокроты. По мере повышения степени контроля БА наблюдается достоверное увеличение этого показателя, способного помочь в определении не только наличия и воспаления в дыхательных путях, но и в мониторировании течения БА.
Литература
1. Авдеев, С.Н., Анаев Э.Х., Чучалин А.Г. Применение метода индуцированной мокроты для оценки интенсивности воспаления дыхательных путей // Пульмонология. - 1998. - Т. 8, № 2, - С. 81-87.
2. Боровиков, В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере: для профессионалов. - СПб.: «Питер», 2001. - 656 с.
3. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы. Пересмотр 2006 г / под ред. А.Г. Чучалина. - М.: Издательский дом «Атмосфера», 2007. - 104 с.
4. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы. Пересмотр 2011 г / Под ред. А.С. Белевского. - М.: Российское респираторное общество, 2012. - 108 с.
5. Громова, А.Ю., Симбирцев А.С. Полиморфизм генов семейства IL-1 человека // Цитокины и воспаление. - 2005. - Том 4. - № 2. - С. 3-12.
6. Реброва, О.В. Статистический анализ медицинских данных с помощью пакета программ «Статистика». - Москва: Медиа Сфера, 2002. - 380 с.
7. Стандарты (протоколы) диагностики и лечения больных с неспецифическими заболеваниями легких / Под ред. А.Г. Чучалина. - М.: Грантъ, 1999. - 40с.
8. Цой, А.Н., Архипов В.В. Бронхиальная астма: новые решения. - М.: 000 «Медицинское информационное агентство», 2007. - С.38-45.
9. Balbi, B., Pignatti P., Corradi M.et. al. Bronchoalveolar lavage, sputum and exhaled clinically relevant inflammatory markers: values in
неконтролируемое п течение
частично о контролируемое течение
0 контролируемое течение
healthy adults // Eur Respir J. - 2007. - Vol. 30. -P. 769-781.
10. Belda, J., Leigh R., Parameswaran K. et al. Induced sputum cell counts in healthy adults // Am J Respir Crit Care Med. - 2000. - Vol. 161 (2 Pt 1). -P. 475-478.
11. Djukanovic, R, Sterk P.J., Fahy J.V. et al. Standardised methodology of sputum induction and processing // Eur Resp J. - 2002. - Vol. 20, Suppl. 37. - P. 1-2.
12. Efthimiadis, A., Spanevello A., Hamid Q. et al. Methods of sputum processing for cell counts, immu-nocytochemistry and in situ hybridization. Report of working group 3 // Eur Respir J. - 2002. - Vol. 20: Suppl. 37. - P. 19-23.
13. Gibson, P.G., Simpson J.L., Saltos N. Heterogeneity of airway inflammation in persistent asthma: evidence of neutrophilic inflammation and increased sputum interleukin-8 // Chest. - 2001. -Vol. 119(5). - P. 1329-36.
14. Gorska, K., Krenke R., Korczynski P. et al. Eo-sinophilic airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease and asthma // Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society. - 2008. - Vol. 59, Suppl 6. - P. 261-70.
15. Green, R H, Brightling C.E., Woltmann G. et al. Analysis of induced sputum in adults with asth-
ma: identification of subgroup with isolated sputum neutrophilia and poor response to inhaled corticoste-roids // Thorax. - 2002. - Vol. 57(10). - P. 875-9.
16. Green, R.H., Brightling C.E., McKenna S. et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial // Lancet. - 2002. -Vol. 360(9347). - P. 1715-21.
17. Jayaram, L., Parameswaran K., Sears M.R. et al. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice // Eur Respir J. - 2000. - Vol. 16. -P. 150-158.
18. Louis, R., Lau L.C.K., O.Bron A. et al. The relationship between airways inflammation and asthma severity // Am. J.Respir. Crit. Care Med. - 2000. -Vol. 161, № 1. - P. 9-16.
19. Paggiaro, P.L., Chanez P., Holz O., et al. Sputum induction. Report of working group 1 // Eur Respir J. - 2002. - Vol. 20, Suppl. 37. - P. 3-8.
20. Rutgers, SR., Tioens W., Kaufmann H.F. et al. Comparison of induced sputum with bronchial wash, bronchoalveolar lavage and bronchial biopsies in COPD // Eur Respir J. - 2000. - Vol. 15. - P. 109115.
21. Thomas, R.A., Green R.H., Brightling C.E. et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects // Chest. - 2004. -Vol. 126. - P. 1811-1814.
С. Поспелова
E-mail: sun_up2002@mail.ru
С.Н. Поспелова, С.А. Собченко, В.Ю. Кравцов Возможности цитологических и иммуноцитохимических показателей индуцированной мокроты в оценке воспаления дыхательных путей при разных уровнях контроля бронхиальной астмы // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. — 2015. - Том 7, № 2. - С. 68-73.
possibilities of cytological and immunocytochemical markers of induced sputum in the evaluation of airway inflammation in patients with different levels of asthma control
S. Pospelova, S. Sobchenko, V. Kravtsov North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, Department of pulmonology,
St. Petersburg, Russia
Were analyzed cytological and immunocytochemical data of induced sputum 43 patients with different levels of asthma control
Results of cytological research showed lack or presence of eosinophilic airway inflammation (relative number of eosinophils> 3%), but were not helpful in distinguishing uncontrolled from partially controlled asthma, these data could not be used for determination of level of asthma control. Objective indicator of the severity of airway inflammation, significantly correlated with the levels of disease control, is the ratio of IL-1Ra/IL-1ß in AM.
Key words: bronchial asthma, levels of control, eosinophilic inflammation, liquid-based cytology, immunocytochemistry method, interleukin-1ß, IL-1Ra/IL-1ß ratio.
Authors
S. Pospelova
E-mail: sun_up2002@mail.ru
S. Pospelova, S. Sobchenko, V. KravtsovPossibilities of cytological and immunocytochemical markers of induced sputum in the evaluation of airway inflammation in patients with different levels of asthma control // Herald of the Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov. - 2015. - Vol. 7, № 2. - P. 68-73.
