CC BY
11Возможности цифровой микрофокусной рентгенографии при оценке репаративной регенерации костной ткани в эксперименте Васильев А.Ю., Буланова И.М., Мальгинов Н.Н., Киселева Е.В., Черняев С.Е., Никулина О.М., Тарасенко И.В., Воложин А.И. ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава, Москва
Capabilities of digital microfocal X-ray study in the evaluation of reparative regeneration of bone tissue in an experiment Vasilyev A.Yu., Bulanova I.M., Malginov N.N., Kiseleva E.V., Chernyaev S.E., Nikulina O.M., Tarasenko I.V., Volozhin A.I.
Moscow State University of Medicine and Dentistry, Russian Agency for Health Care, Moscow
В эксперименте на животных с помощью цифровой микрофокусной рентгенографии изучалась динамика регенерации костной ткани в различные сроки. Исследовано 16 кроликов породы шиншилла, которым костный дефект в области угла ветви нижней челюсти закрывали остеопластическим материалом «Гапкол» с нанесенными аллогенными, аутоло-гичными стволовыми клетками, выделенными из жировой ткани кроликов, и плазмой крови человека, обогащенной тромбоцитарными факторами роста. Проведено сравнительное исследование возможностей цифровой микрофокусной рентгенографии и рентгеновской компьютерной томографии при оценке репаративной регенерации костной ткани. Результаты лучевых методов исследования верифицированы данными сканирующей электронной микроскопии.
Digital microfocal X-ray study was experimentally studied in animals to examine the time course of changes in their bone regeneration. Sixteen Chinchila rabbits whose bone defect in the angle of the mandibular ramus had been closed with the osteoplastic material Gapcol with the applied allogeneic, autologous stem cells isolated from rabbit adipose tissue and human plasma enriched with thrombocytic growth factors were examined. The capabilities of digital microfocal X-ray study versus X-ray computed tomography were compared in the evaluation of reparative regeneration of bone tissue. The results of radiation studies were verified with the data of scanning electron microscopy.
Введение
В клинической практике рентгенография является обязательным и традиционным методом оценки регенерации костной ткани в динамике после травматических повреждений. С помощью стандартного рентгенологического исследования удается определить правильность сопоставления костных отломков, формирование эндостальной, пе-риостальной и интермедиарной мозоли, образование костной ткани на месте перелома [1,7,16,17].
В последние годы особенно пристальное внимание привлекает специальная методика рентгеновского исследования - микрофокусная рентгенография с прямым многократным увеличением
рентгеновского изображения [1,5,6,9,13,21]. Ее отличительной особенностью является получение рентгеновских изображений различных объектов с помощью источников излучения, размер фокусного пятна которых не превышает 0,1 мм. Сущность рентгенографии с прямым многократным увеличением изображения состоит в производстве снимков при меньшем, чем при обычной рентгенографии, расстоянии между фокусом рентгеновской трубки и объектом, при удалении пленки от объекта. Рентгеновское излучение из точечного источника имеет характер расходящегося пучка. При этом все детали изображения увеличиваются в размерах, в то время как нерезкость и зернистость регистриру-
ющей системы остаются неизмененными [5,6,14,15].
Однако для практического применения этого метода необходимы дополнительные исследования, в том числе с использованием экспериментальной модели репаративной регенерации, что явилось предметом данного исследования.
Материал и методы В работе использовали 16 кроликов шиншилла весом
Ключевые слова: цифровая микрофокусная рентгенография, регенерация костной ткани, мезенхимальные стволовые клетки Index terms: digital microfocal X-ray study, bone regeneration, mesenchymal stem cells
3,5-4 кг. Операцию проводили под общим наркозом «Zoletil» («Virbac Sante Animale», Франция). Препарат вводили внутримышечно из расчета 7,5 мг/кг веса тела кролика. В области края и ветви нижней челюсти выстригали шерсть, делали разрез кожи с соблюдением правил асептики, обнажали угол и ветвь челюсти. В области угла нижней челюсти с помощью фрезы, соединенной с физиодиспенсором, со скоростью 800 об/мин, при постоянном охлаждении стерильным физиологическим раствором с обеих сторон создавали полнокостный дефект размером 8х8 мм. Дефект закрывали остеопластичес-ким материалом «Гапкол» с алло-генными или аутологичными стволовыми клетками, который фиксировали двумя швами через заранее приготовленные отверстия. Мягкие ткани укладывали на место, кожу ушивали. Для профилактики послеоперационных осложнений кроликам вводили антибиотики внутримышечно в течение 3 дней. Рана заживала первичным натяжением.
В работе использовали ауто-логичные и аллогенные стволовые клетки, выделенные из кусочков жировой ткани кролика (СКЖТ), взятые из паховой области. СКЖТ выделяли по стандартному методу с модификациями (А.И.Воложин и соавт., 2007). На 2-м пассаже СКЖТ переводили на остеогенную среду, в которой клетки культивировали в течение 14 дней. За сутки до операции, предварительно индуцированные к остеогенной дифференцировке, СКЖТ кролика пассировали на пластины из коллагена с гидроксиапатитом (ГАПКОЛ производства «ЗАО НПО ПОЛИСТОМ», Россия) из расчета 5*106 клеток на 1 губку (размер пластины 20х8х1,2 мм).
Животные были разделены на 4 группы:
1. Контроль - дефект закрывали ГАПКОЛом без клеток.
2. Опыт 1 - дефект закрывали ГАПКОЛом с аллогенными СКЖТ.
на рабочих станциях Konica Minolta.
Компьютерная томография выполнена на рентгеновском компьютерном томографе «NewTom3G». Толщина срезов составляла 0,2мм. Производилось построение трехмерных реконструкций изображения.
Результаты и обсуждение
Анализ цифровых микрофокусных рентгенограмм без увеличения показал низкое качество изображения при оценке трабе-кулярной структуры. Костные балки дифференцировались неотчётливо, контуры их размыты, взаимоотношение между ними фактически не определялось. На микрофокусных рентгенограммах с 3- и 5-кратным увеличением изображения начинала хорошо визуализироваться трабекуляр-ная структура кости. Отчетливо дифференцировались костные балки, их взаимоотношение. Отмечалось значительное увеличение контрастности изображения между мягкими тканями и фоном снимка (краевой эффект). На микрофокусных рентгенограммах с 5-кратным увеличением начинал определяться эффект псевдообъёмного изображения, который максимально выражен при увеличении изображения в 7 раз. При 20-кратном увеличении идентификация трабекуляр-ной структуры костной ткани отчетливее. Хорошо определялись контуры краевого костного дефекта, мелкие и малоконтрастные структуры изображения.
При анализе цифровых микрофокусных рентгенограмм с 3-, 5-, 7-, 20-кратным увеличением изображения костный дефект имел ровные, нечеткие контуры у5 (31%) животных, выведенных из опыта через 30 суток. В проекции дефекта определялась неоднородной структуры новообразованная ткань, по плотности соответствующая мягким тканям. В большинстве случаев - 6 (60%), - отмечались участки минерализации первичной мозоли, как структуры высокой интенсивности Вестник рентгенологии и радиологии № 2-3, 2008
3. Опыт 2 - дефект закрывали ГАПКОЛом с аутологичными СКЖТ.
4. Опыт 3 - дефект закрывали ГАПКОЛом с нанесенной на него плазмой человека, обогащенной тромбоцитами. Плазму получали согласно общепринятым правилам (Pietrzak W.S., Eppley B.L., 2005).
Через 30 суток после операции было выведено из опыта 5 (31%) животных, через 60 суток -6 (37%) и через 120 суток - 3 (19%) животных. Погибло 2 (13%) животных через 10 суток после операции. Животных выводили из опыта передозировкой наркоза. Нижние челюсти вместе с прилежащими мышцами фиксировали в 4% растворе нейтрализованного формальдегида, после чего проводили их рентгенологическое исследование.
Все 32 фрагмента нижней челюсти были исследованы методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы помещали в холодный 5-10% раствор гипохлорита натрия марки А (ГОСТ 11086-76) для деорга-нификации. После тщательной отмывки в проточной воде их высушивали на воздухе. Высушенные образцы кости фотографировали, а затем приклеивали на столики токопроводящим клеем (Watford, England), напыляли медью или золотом в напылителе Balzers SCD 040 (Лихтенштейн) в атмосфере аргона. Исследование всех образцов проводили в микроскопе Philips SEM-515 (Голландия) при ускоряющем напряжении 15 kv.
Была выполнена микрофокусная рентгенография без увеличения изображения, с прямым увеличением в 3-5-7-20 раз на аппарате «Пардус-150». В качестве приёмника изображения использовались кассеты с фосфорной пластиной. После экспозиции полученная информация считывалась сканирующим лазерным устройством - дигитайзером Regius model 170. Последующая обработка цифровой рентгенограммы производилась
округлой формы в проекции костного дефекта (рис. 1а). В одном случае выявлялся линейный периостит на данном сроке регенерации. При сканирующей электронной микроскопии в проекции костного дефекта определялась грубоволокнистая соединительная ткань с сосудистыми лакунами (рис. 1б).
У 6 (37%) животных, выведенных из опыта через 60 суток после операции, в проекции костного дефекта отмечалась мягкотка-ная мозоль с более высокой степенью минерализации, высокой интенсивности, неоднородной структуры. Чаще всего плотность мозоли приближалась к плотнос-
ти кортикального слоя. В 5 (42%) случаях определялись отдельные тонкие незрелые костные балки, как правило, в проекции коркового слоя (рис. 2а). В большинстве случаев 9 (75%) на этом сроке отмечался физиологический остеосклероз вокруг краевого костного дефекта. Образование пластинчатой костной ткани и формирование отдельных трабекул отмечалось при сканирующей электронной микроскопии на сроках регенерации 60 суток (рис. 2б).
При анализе цифровых микрофокусных рентгенограмм у 3 (19%) животных, выведенных из опыта через 120 суток, в 2 (33%) случаях отмечалось полное вос-
становление костной ткани в проекции дефекта (рис. 3а). Новообразованная кость выглядела незрело: костные балки были неравномерны по форме и величине, хаотично расположены. В одном случае в эти сроки сохранялся краевой костный дефект в области ветви нижней челюсти в виде прерывания коркового слоя протяженностью 3мм. Данные сканирующей электронной микроскопии позволяют визуализировать формирование трабеку-лярной структуры костной ткани в проекции дефекта на данном сроке регенерации (рис. 3б).
В одном случае отмечалось отсутствие регенерации костной
Рис. 1. Регенерация костной ткани через 30 суток, II группа: а) цифровая микрофокусная рентгенограмма с 7-кратным увеличением изображения; б) СЭМ, ув. Х 63.
Рис. 2. Регенерация костной ткани через 60 суток, III группа: а) цифровая микрофокусная рентгенограмма, 20-кратное увеличение изображения; б) СЭМ, ув. Х 44,4.
ткани. На цифровых микрофокусных рентгенограммах без увеличения и с 3-, 5-, 7-, 20-кратным увеличением в проекции дефекта отсутствовала первичная костная мозоль, определялись закругленные края костного дефекта, остеосклеротический ободок коркового слоя. КТ и данные СЭМ также подтвердили отсутствие первичной костной мозоли.
Через 10 суток после операции 2 животных погибло. На цифровых микрофокусных рентгенограммах и компьютерных томограммах определялись острые зазубренные края костных дефектов, что свидетельствовало о свежей травме, отсутствовала первичная костная мозоль, отмечался физиологический остеопо-роз вокруг краевых дефектов.
Анализ результатов рентгеновской компьютерной томографии при контроле регенерации костной ткани в различные сроки показал низкую информативность в оценке трабекулярной структуры костной ткани. Взаимоотношение костных балок отдифференцировать не удалось. Построение трехмерных реконструкций позволило оценить пространственную локализацию структур в проекции костного дефекта, за счет отсутствия эффекта перекрывания, рельефно обрисовать поверхностные структуры и объяснить сложные трехмерные со-
4
ф
^ 1
CÖ V
i 05
О) ZS
О 0
I группа —■— II группа «А — III группа IV группа
10 суток 30 суток 69 суток 120 суток
Рис. 4. Оценка регенерации костной ткани по группам экспериментального материала, где 0 - нет регенерации, 1 - +, 2 - ++, 3 - +++, 4 - ++++.
отношения между костными и мягкоткаными фрагментами.
При сравнении диагностической значимости цифровой микрофокусной рентгенографии и КТ в оценке регенерации костной ткани, микрофокусная рентгенография позволила на более ранних сроках визуализировать первичную костную мозоль. На компьютерных томограммах новообразованная ткань в проекции костного дефекта начинала определяться позже, при большей её степени минерализации. В нашем исследовании чувствительность цифровой микрофокусной рентгенографии с 3-кратным увеличением в выявлении костной мозоли составила - 90%, при увеличении изображения в 5, 7, 20 раз - 93%, КТ - 83%.
При оценке регенерации костной ткани, в зависимости от вида применяемых костных адаптеров, выявлено, что оптимальным оказалось использование аутологич-ных стволовых клеток с пластиной Гапкол в III группе экспериментального материала (рис. 4).
Отмечалась отличная регенерация в III группе на всех сроках - 30,60 и 120 суток после выполнения операции - нанесения краевого костного дефекта. К этим данным приближаются результаты регенерации II группы экспериментального материала, но ни в одном случае через 120 суток после операции не определялось полного восстановления костной ткани в проекции дефекта. В I группе - контроль, где использовались только плас-
тины Гапкола, результаты регенерации костной ткани оказались существенно ниже, чем в остальных группах. Отмечались интересные результаты в IV группе, где применялась тромбоцитар-ная плазма, обогащенная факторами роста. В этой группе через 60 суток после операции в одном случае определялось отсутствие регенерации костной ткани. Однако, в отличие от II группы, через 120 суток отмечалось полное замещение костной тканью всей области дефекта.
Выводы
1. Цифровая микрофокусная рентгенография является высокоинформативным методом в оценке регенерации костной ткани в эксперименте на животных. Оптимальным является 7-кратное увеличение при цифровой микрофокусной рентгенографии, дополнительная информация появляется при увеличении изображения в 20 раз.
3. Сочетание микрофокусной рентгенографии и цифровой радиографии позволяет выполнять коррекции ошибок экспозиции, улучшение изображения с помощью изменения контраста, яркости и пространственной фильтрации. Метод позволяет четко различить изображение элементов костных структур и способствует выявлению минимальных отклонений от нормы за счет широкого динамического диапазона изображения.
4. При сравнительном исследовании использование микрофокусной рентгенографии с прямым увеличением и цифровой обработкой изображения позволяет детально изучить трабеку-лярную структуру костной ткани, выявить костную мозоль на более ранних сроках, не определяемые при рентгеновской компьютерной томографии
Литература
1. Васильев А.Ю. Рентгенография с прямым многократным
увеличением в клинической
практике. - М.: ИПТК ЛОГОС, 1998. - 148 с.
2. Мультипотентные клетки жировой ткани: перспективы использования в челюстно-лицевой хирургии / А.Волошин, Е. Киселева,Т. Калашникова // Кафедра. -2007. -Т..6, № 3, - С. 20-25.
3. Иванов С.А., Потрахов Н.Н. Портативные микрофокусные рентгеновские аппараты для медицинской диагностики // Мед. техника. - 1998. - № 6. - С. 6-8.
4. Календер В. Компьютерная томография.- М.: Техносфера,
2006. - С 257-265.
5. Потрахов Н.Н. Микрофокусная рентгенография в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. - СП-б., 2006. -198 с.
6. Потрахов Н.Н., Мухин В.М., Дентальная микрофокусная рентгенография // Мед. физика, 2001. - № 11.
7. Семизоров А.Н. Рентгенография в диагностике и лечении переломов костей. - М.,
2007. - С. 21-27.
8. Bookstein J.J., Voegeli E.A. A critical analysis of magnification radiography. Laboratory investigation // Radiology. - 1971. -Vol. 98 , N1 - P. 23-30.
9. Buckland-WrightJ.C.,Bradshaw C.R. Clinical application of highdefinition microfocal radiography // Br. J Radiol. - 1989. -Vol. 62. - P. 209-217.
10. Brnkland-Wright J.C., Lynch J.A., Bird C. Microfocal techniques in quantitative radiography: measurement of cancellous bone organization //Br. J. Rheumatol. - 1996. - Vol. 35, Suppl. 3. - P. 18-22.
11 Fractal signature analysis of macroradiographs measures tra-becular organization in lumbar vertebrae of postmenopausal women / Buckland-Wright J.C., Lynch J.A., Rymer J., Fogel-man L. // Calcif. Nissue Int. -1994.-Vol. 54, №2. - P.106-112.
12.Buckland-Wright J.C. A new high-definition microfocal X-ray
unit // Br. J. Radiol. - 1989.-Vol.62, N 735. - P. 201-208.
13.Buckland-Wright J.C, Brad-shaw C.R. Clinical applications of high-definition microfocal radiography // Br J. Radiol. -1989. - Vol. 62, 735. -P.209-217.
14.Doi K., Imhof H. Noise reduction by radiographic magnification // Radiology. - 1977. - Vol. 122. P.479-487.
15.Ely R.V. Microfocal Radiography. - Academic Press, 1980.
16. Direct radiographic magnification for skeletal radiography /H.K. Genant, K. Doi, J.C. Mall, E.A. Sickles // Radiology. -1977. - Vol. 123.- P.47-55.
17.Nicholl J.E., Spencer J.D., Buck-land-Wright J.C. Pattern of scaphoid fracture union detected by macroradiography //J. Hand Surg. - 1995. - Vol. 20, N2. - P. 189-93.
18. Pietrzak W.S., Eppley B.L. Platelet rich plasma: biology and new technolog // J. Craniofac Surg. - 2005. - Vol. 16. - P. 1043-1054.
19. Occult fractures of the wrist, joint: high resolution image magnification roentgen versus MRL / S. Schick, S. Trattnig, C. Gabler et al. // Fortsch.r Geb. Rontgenstr. Neuen Bildgeb. Verfahr - 1999. - Vol.170, № 1. - P.16-21
20. Cervical spine: postmortem assessment of accident injuries— comparison of radiographic, MR imaging, anatomic, and pathologic findings / A. Stabler, J. Eck, R. Penning et al. // Radiology. - 2001. - Vol. 221, № 2- P. 340-346.
21.Takahashi S., Sakuma S. Magnification radiography. -New York, 1975 -. P. 110.
22.The primary observation of tissue engineered periosteum osteogenesis in vivo in allogenic rabbit / L. Zhao,Z. Shi, S. Zhou et al. // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi, -2008, - Vol. 22, № 2. -P. 145-147.
Поступила 21.01.2008
