Возможности спектроскопии комбинационного рассеяния для дифференциальной диагностики новообразований кожи

Козлов Сергей Васильевич; Захаров Валерий Павлович; Морятов Александр Александрович; Братченко Иван Алексеевич; Артемьев Дмитрий Николаевич

УДК 535.3,616-006

ВОЗМОЖНОСТИ СПЕКТРОСКОПИИ КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НОВООБРАЗОВАНИЙ КОЖИ

1 Самарский государственный медицинский университет 2 Самарский государственный аэрокосмический университет им. акад. С.П. Королева (национальный исследовательский университет)

Поступила в редакцию 29.03.2015

В статье приведены сведения об эпидемиологии меланомы кожи, анализ методов диагностики. Представлен первый опыт применения нового метода диагностики опухолей кожи. Проанализированы результаты спектроскопии комбинационного рассеяния опухолей кожи человека in vitro и in vivo. Показано, что комбинационное рассеяние с оригинальным двухэтапным фазовым анализом параметров обладает высокими показателями чувствительности и специфичности. Предложен новый способ ранней диагностики новообразований кожи.

Ключевые слова: новообразование, кожа, меланома, спектроскопия комбинационного рассеяния, неинвазивная диагностика

Среди других новообразований злокачественная меланома кожи (МК) занимает особое положение, обладая агрессивными свойствами, она ответственна за более чем 85% летальности от злокачественных новообразований кожи. МК распространена неравномерно, наиболее высокие показатели заболеваемости характерны для Австралии и новой Зеландии (до 40 на 100 тыс. населения), Соединенных штатов Америки (до 21,1 на 100 тыс.), некоторых стран Европы [3]. В частности, в США в 2013 г. заболевание выявлено у 76,600 американцев, причем 35% заболевших - это люди моложе 45 лет. В России ежегодно выявляется более полумиллионов новых больных злокачественными новообразованиями (ЗНО), из них 14% это злокачественные новообразования кожи. МК в России встречается реже, ежегодно заболевает около 8500 человек - 3,97 новых заболеваний на 100 тыс. человек, но характерен высокий уровень ежегодного прироста заболеваемости от 4,55 до 6,1% ежегодно за последнее десятилетие [1]. В Самарской области

Козлов Сергей Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой онкологии. E-mail: KozlovSV@samaraonko. ru

Захаров Валерий Павлович, доктор физико-математических наук, профессор. E-mail: ssauvz@mail.ru

Морятов Александр Александрович, кандидат медицинских наук, доцент. E-mail: ama78@mail.ru Братченко Иван Алексеевич кандидат физико-математических наук, ассистент. E-mail: ud_liche@mail.ru

Артемьев Дмитрий Николаевич, инженер НИЛ «Фотоника». E-mail: artemyevdn@gmail.ru

высокие показатели заболеваемости ЗНО - 446,6 на 100 тыс., одной из особенностей региона является высокий уровень заболеваемости новообразованиями кожи - 18,6%, первое место в структуре онкопатологии в 2013 г.

Цель исследования: разработать новый метод ранней неинвазивной дифференциальной диагностики новообразований кожи.

Скрининг и диагностика. МК - уникальная опухоль, для которой характерно многообразие клинических проявлений, особенно сложно дифференцировать меланому с другими новообразованиями кожи в начальных стадиях заболевания. Потенциально опасные пигментные или пигментированные новообразования кожи при визуальном осмотре можно выявить более, чем у 90% населения [5]. Следствием гиподиагностики меланомы может быть длительное наблюдение или неадекватное лечение, приводящее к диссе-минации новообразования с предсказуемым исходом. Гипердиагностика меланомы приводит к неоправданно завышенному объёму хирургического вмешательства и серьезным косметическим дефектам. Несмотря на существенные успехи, достигнутые в системной лекарственной терапии МК, результаты 5-летней выживаемости более всего зависят от своевременной и эффективной диагностики и адекватного объёма хирургического лечения. Поэтому актуальным остается поиск методов ранней и уточняющей диагностики меланомы кожи.

Большинство МК при их визуальном исследовании обладают одним или несколькими

характерными признаками - правило ABCDЕ [6]. Однако использование правила ABCDE не исключает множество субъективных оценок и не имеет достаточной специфичности. В России массовые исследования позволяют выявлять до 15% всех новых случаев МК. Эффективность визуальной диагностики, в том числе с использованием правила ABCDЕ напрямую зависит от опыта и специализации врачей и от частоты встречаемости таких новообразований в их повседневной практике [4]. Одним из возможных способов преодоления упомянутых недостатков и повышения качества диагностики является использование стандартных приборов и инструментов, наиболее распространенным является метод дерматоскопии (эпилюминесцентная микроскопия) [8, 10]. Использование метода позволяет достигнуть диагностической точности 92,2%, чувствительность - 97,9% и специфичность - 90,3%. Ультразвуковое исследование МК направлено на определения уровня инвазии и обследования зон регионарного метастазиро-

вания [2] для правильного выбор объема хирургического лечения [7]. Возможным недостатком метода может быть некорректное завышение оценки глубины опухолевой инвазии при развитии её на фоне пигментного невуса или изъязвлении опухоли. Флуоресцентная диагностика -метод, основанный на выявлении характерной флуоресценции злокачественных клеток, помогает активному поиску скрытых, небольших по размерам опухолевых очагов на поверхности кожи (сателлиты или транзиторные метастазы). К сожалению, реализация перечисленных методов возможна только на базе крупных специализированных центров, с участием подготовленных специалистов, дорогостоящих методов или реактивов, что затрудняет их широкое применение. Возможным решением проблемы будет поиск способа повышения эффективности ранней диагностики новообразований кожи путем изучения диагностических возможностей новых оптических методов анализа строения тканей человека.

Рис. 1. Оптическая схема экспериментальной установки: 1 - лазер, 2 - оптический модуль, включающий узкополосный фильтр 2а, широкополосный фильтр 2б, дихро-ичное зеркало 2в, 3 - исследуемый образец, 4 - спектрограф с цифровой камерой, 5 - компьютер

Материалы и методы. Ранее проведенные исследования [11] показали возможные перспективы использования методов спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) для дифференциальной диагностики новообразований кожи, в том числе для организации массовых исследований и мониторинга новообразований кожи. В данной работе использовалась экспериментальная установка, реализующая принципы КР. Принципиальная схема установки представлена на рис. 1. Основные элементы: полупроводниковый лазер 1 (LML-785.0RB-04), оптический КР модуль 2 (PBL 785), спектрограф

(Sharmrock SR-303i) с интегрированной цифровой камерой (ANDOR DV-420A-OE) и компьютер. Для выделения комбинационного рассеяния использовался оптический модуль 2, который отрезал вклад оптического волокна и предотвращал попадание возбуждающего излучения в регистрирующий тракт спектрографа 4. Использование данного спектрографа обеспечивает разрешение 0,05 нм при низком уровне собственных шумов. Для исключения вклада автофлуоресценции в КР спектре использовался метод полиномиальной аппроксимации с дополнительной фильтрацией случайных шумовых эффектов

и автоматическим определением степени полинома по заданному спектральному интервалу. В данной работе анализ КР спектров производился в диапазоне 1200-1800 см-1.

В качестве объектов исследований были использованы образцы различных новообразований кожи человека, полученные после хирургического лечения в отделениях Самарского областного клинического онкологического диспансера (СОКОД). Регистрацию спектра КР выполняли, располагая рабочую часть спектрометра (рис. 1 оптический модуль) непосредственно над исследуемой областью на расстоянии 3-4 мм. Последовательно проводили регистрацию спектра с патологически измененного участка, далее участка здоровой кожи. Время обследования одного пациента составляло не более 3-5 минут. В серии экспериментов ex vivo была проведена регистрация спектров КР с образцов новообразований кожи с диагнозом: меланома - 24, ба-зальноклеточный рак - 25, плоскоклеточный рак - 7, пигментный невус - 9, другие доброкачественные новообразования - 6.

Следующий этап - проведение экспериментов in vivo, были проанализированы КР-спектры полученных при исследовании: мела-нома - 9 наблюдений, базальноклеточный рак -8, пигментный невус - 2, другие доброкачественные новообразования - 2. Все пациенты,

участвующие в исследовании, были старше 18 лет, были предварительно обследованы в СО-КОД и подготовлены к хирургическому лечению в отделениях. Участие в исследовании было добровольным и сопровождалось информированным согласием, исследование получило положительную оценку комитета по биоэтике.

Анализ КР спектров новообразований и кожи. Ввиду высокой вариативности значений данных интенсивностей для разных пациентов, связанной, в том числе, с различной концентрацией кожных пигментов, КР спектр исследуемых образцов может существенно отличаться друг от друга. Для компенсации данного эффекта произведена нормировка всех спектров на максимум интенсивности пика в полосе 14301460 см-1. Характерные нормированные спектры комбинационного рассеяния для новообразований и нормальной кожи представлены на рис. 2. Максимум спектра комбинационного рассеяния соответствует сдвигу КР 1450 см-1, которому отвечает изгибная мода колебаний группы СН2/СН3. Наряду с данной полосой уверенно регистрируются полосы 1240-1280 см-1 (продольная мода колебаний С=К), 1300-1340 см-1 (изгибные и скручивающие моды связи СН2), 1540-1580 см-1 (деформационная мода связи С=С и триптофана), 1640-1680 см-1 (продольная колебательная мода С=О в амидах).

Рис. 2. Нормализованные спектры комбинационного рассеяния здоровой кожи, меланомы и базальноклеточного рака (a - ex vivo, b - in vivo) в области 1200-1800 см-1

Существующие различия в интенсивно-стях КР пиков для нормальной кожи и различных видов новообразований кожи могут объясняются структурными нарушениями тканей при развитии ЗНО либо изменением концентрации отдельных биологических молекул в опухолевых клетках. Основные спектральные различия между здоровой кожей и ЗНО, зарегистрирован-ны как in vivo так и ex vivo в полосах 1300 и 1750-1780 см-1 . Наличие существенных различий в КР спектрах исследуемых образцов но-

вообразований и здоровой кожи позволяет провести дифференциацию типов данных тканей с использованием КР спектроскопии. Для определения типа исследуемой ткани предложен метод фазового анализа интенсивностей КР исследуемых тканей.

Проведенные исследования позволяют сформулировать и предложить способ анализа КР спектра новообразований - метод расчета фазовых критериев определения ЗНО кожи и мела-номы относительно других новообразований

кожи - двухэтапный фазовый метод. Исходно полученные параметры спектра КР последовательно анализируют. На первом этапе вводится две фазовые характеристики: отношение максимумов интенсивности рассеяния I1320 в полосе 1300-1340 см-1 и I1660 в полосе 1640-1680 см-1 по отношению к интенсивности КР в полосе 1440-1460 см-1. Тогда каждое измерение может быть представлено в виде точки на фазовой плоскости I1320 - I1660 (рис. 3а, 4а). Используя в качестве эталонного метода гистологические исследования образцов, проводящиеся независимо от спектральных измерений, каждая экспериментальная точка на фазовой плоскости может быть отнесена к меланоме, раку кожи, здоровой коже или доброкачественным новообразованиям. Это позволяет реализовать способ оптической идентификации меланомы. Предварительно рассчитанные показатели чувствительность и специфичность метода для диагностики мелано-мы ex vivo на первом этапе составили 88% и 90%. При исследованиях in vivo чувствительность определения меланомы составила 78%, а специфичность 90%. Невысокое значение чувствительности на первом этапе метода по сравнению с экспериментами ex vivo может стать препятствием для проведения массовых

исследований. В связи с этим был предложен второй этап анализа.

На втором этапе диагностики рассматривались абсолютные изменения интенсивностей в полосах 1320, 1450 и 1660 см-1 в ненормированных КР спектрах новообразований относительно здоровой ткани. Другими словами, выделись 3 координаты спектра новообразования (Ш320, Ш450 и Ш660) и 3 координаты нормальной ткани (1п1320, 1п1450 и 1п1660), и далее вычислялась разница соответствующих координат по абсолютной величине, нормированной на сумму интенсивностей в конкретной полосе (Д1320=|Ш320 - Ы320|/(Ш320 + Ы320) и т.д.). Последовательный анализ данных координат позволяет построить 3 фазовые плоскости (первая: оси Д11320 и Д1450 , вторая: оси Д11320 и Д11660, третья: оси Д11450 и Д11660), которые оказались полезными для определения вида новообразований кожи. Наблюдения с пигментными новообразованиями, подозрительными в отношении меланомы, но не попавшие в соответствующую область фазовой плоскости на первом этапе рассматривают на втором этапе анализа; положение расчетной точки в поле соответствующем меланоме на одном из этапов исследования является маркером МК.

Рис. 3. Классификация новообразований двухстадийным фазовым методом ex vivo

Рис. 4. Классификация новообразований двухстадийным фазовым методом in vivo

При введении второго этапа анализа КР спектров скорректированные предварительные показатели - чувствительность и специфичность - при исследованиях ex vivo составили 88% и 100% соответственно. Следует отметить, что специфичность двухстадийного фазового метода идентификации меланомы выше, чем в пороговых методах, что позволяет сделать вывод о низкой вероятности ложной идентификации заболевания, которая стремится к нулю на данном этапе. Для исследований in vivo использование двухстадийного метода позволило повысить чувствительность на 11% (89%), а специфичность при этом составила 88%. Таким образом, двухстадийный метод позволяет существенно повысить точность диагностики МК при исследованиях новообразований кожи с использованием абсолютных изменений интенсивностей в полосах 1320 и 1450 см-1.

Эффективность предложенного двухста-дийного метода диагностики новообразований кожи в среднем на 5-10% выше по сравнению с другими методами диагностики [4, 5, 8, 10], основанными на анализе комбинационного рассеяния. Важным является факт использования сравнения индивидуальных характеристик спектра КР полученных при исследовании новообразования и здоровой кожи, каждого пациента (второй этап исследования), что позволяет индивидуализировать метод. Высокие показатели чувствительности особенно важны для организации массового скрининга новообразований кожи при профилактических осмотрах, учитывая практически полное отсутствие ложных отрицательных результатов. Другим достоинством предложенного метода является его инвариантность относительно размеров опухоли: точность диагностики не снижается при анализе новообразований диаметром менее 5 мм, так как диаметр пятна лазерного луча спектрометра комбинационного рассеяния не превосходит 2 мм. При визуальном осмотре врачом малый размер новообразования является существенным затруднением и эффективность диагностики по результатам визуального осмотра снижается до 40%, а при использовании фазового метода точность диагностики злокачественного новообразования сохраняется на уровне 90%.

Выводы: первые результаты исследования, посвященного изучению разрешающих возможностей метода спектроскопии КР (Рама-новской спекроскопии) с последующим двух-этапным фазовым анализом полученных параметров показывает высокую эффективность

метода для дифференциальной диагностики МК и других ЗНО, пигментных и других доброкачественных новообразований кожи. Безопасность и быстрота проведения исследования показывают высокие потенциальные возможности метода; возможность анализа подозрительного в отношении меланомы кожи очага независимо от размера и локализации; отсутствие необходимости сложного анализа субъективных признаков, и автоматический алгоритм интерпретации данных позволяют видеть перспективу широкого использования метода.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Каприн, Д.В. Состояние онкологической помощи населению в 2012 году / Д.В. Каприн, В.В. Старин-ский, Г.В. Петрова. - М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий» 2013. 250 с.

2. Сидоренко, Ю.С. Способ неинвазивной диагностики меланомы кожи / Ю.С. Сидоренко, Н.А. Максимова, В.В. Позднякова, Я.В. Дрейзина // патент на изобретение РФ №2318441, приоритет от 05.09.2006 г.

3. Worldwide Incidence for Melanoma of the Skin - Statistics from GLOBOCAN 2012.

4. Brochez, L. Diagnostic ability of general practitioners and dermatologists in discriminating pigmented skin lesions / L. Brochez, E. Verhaeghe, L. Bleyen, J.M. Naeyaert // J.Am. Acad. Dermatol. 2001. Jun; V. 44(6). P. 979-986.

5. Ermakov, A.V. Early diagnosis and prophylaxis for cutaneous melanoma // J. Oncosurgery. 2013. V. 5(3). P. 52-58.

6. Friedman, R. Early detection of malignant melanoma: role of physician examination and self-examination of the skin / R. Friedman, D. Rigel, A. Kopf // CA: Cancer Journal of Clinicians. 1985. Vol. 35. P. 130-151.

7. Krahn, G. Dennatoscopy and high frequency sonography: two useful non-methods to increase pre-operative diagnostic accuracy in pigmented skin lesions / G. Krahn et al. / Pigment Cell Res. 1998. V.11. P. 151-154).

8. Menzies, S. W. A sensitivity and specificity analysis of the surface microscopy features of invasive melanoma / S. W. Menzies, C. Ingwar, W. McCarthy / H Melanoma Res. 1996. Vol. 6. No. 1. P. 55-62.

9. Rubegni, P. Melanocytic skin lesions and pregnancy: digital dermoscopy analysis // P. Rubegni, P. Sbano, V. Burroni et al. // Skin Res. Technol. 2007. Vol. 13(2). P. 143-147.

10. Sergeyev, Yu.V. Digital video dermoscopy: new approaches to the diagnosis, treatment and prevention of skin diseases / Yu.V. Sergeyev, O.L. Ivanov, A.Yu. Sergeyev et al. // Russian Journal of Skin and Sexually Transmitted Diseases. 2004. Vol. 1. P. 23.

11. Zhao, J. Real-time Raman spectroscopy for in vivo skin cancer diagnosis / J. Zhao, H. Lui, D.I. McLean, H. Zeng // Cancer Res. 2012. V. 72(10). P. 2491-2500.

POSSIBILITY BACKSCATTERING SPECTROMETRY FOR DIAGNOSTICS OF SKIN NEOPLASMS

1Samara State Medical University 2Samara State Aerospace University named after academician S.P. Korolyov (National Research University)

The data on cutaneous melanoma epidemiology and diagnostic techniques. New method diagnosis of skin neoplasms is suggested. The results of resonance Raman spectroscopy of human skin neoplasms in vitro and in vivo are analyzed. Displayed: by means of original two-stage phase analysis of obtained parameters the method possesses high sensitivity and specificity scores. Conclusions: new technique of early non-invasive skin neoplasms diagnosis is suggested.

Key words: skin, neoplasms, melanoma, backscattering spectrometry, noninvasive diagnosis

Sergey Kozlov, Doctor of Medicine, Professor, Head of the Oncology Department. E-mail: KozlovSV@samaraonko.ru Valeriy Zakharov, Doctor of Physics and Mathematics, Professor. E-mail: ssauvz@mail.ru Alexander Moryatov, Candidate of Medicine, Associate Professor. E-mail: ama78@mail.ru Ivan Bratchenko, Candidate of Physics and Mathematics, Assistant. E-mail: ud_liche@mail.ru

Dmitriy Artemyev, Engineer at the SRL "Photonica". E-mail: artemyevdn@gmail.ru

POSSIBILITY BACKSCATTERING SPECTROMETRY FOR DIAGNOSTICS OF SKIN NEOPLASMS

Текст научной работы на тему «Возможности спектроскопии комбинационного рассеяния для дифференциальной диагностики новообразований кожи»