Научная статья на тему 'Возможности применения технологии лазерной микродиссекции биологических препаратов для молекулярногенетического анализа хромосомной ДНК, методом электрофореза в пластинах полиакриламидного геля'

Возможности применения технологии лазерной микродиссекции биологических препаратов для молекулярногенетического анализа хромосомной ДНК, методом электрофореза в пластинах полиакриламидного геля Текст научной статьи по специальности «Медицинские технологии»

CC BY
228
42
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ / BIOLOGICAL SUBSTANCE / ЛАЗЕРНАЯ МИКРОДИССЕКЦИЯ / LASER MICRODISSECTION / АНАЛИЗ ХРОМОСОМНОЙ / CHROMOSOMAL DNA ANALYSIS BY STR-LOCI / ДНК ПО STR-ЛОКУСАМ / ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПЛАСТИНАХ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЯ / THE ELECTROPHORESIS IN THE PLATES OF POLYACRYLAMIDE GEL

Аннотация научной статьи по медицинским технологиям, автор научной работы — Рындин В. В., Смагина Т. А., Кобылянский А. Г., Марков Д. Д., Клевно В. А.

Статья посвящена изучению возможности типирования хромосомной ДНК по максимальному количеству STR-локусов в определенном количестве клеток, выделенных из биологических препаратов, методом лазерной микродиссекции. Определялась возможность применения этого метода для электрофореза в пластинах полиакриламидного геля. Установлено, что в виду недостаточной чувствительности использованного метода, он не может быть рекомендован к применению в молекулярно-генетических лабораториях судебно-медицинских учреждений.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по медицинским технологиям , автор научной работы — Рындин В. В., Смагина Т. А., Кобылянский А. Г., Марков Д. Д., Клевно В. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

THE POSSIBILITIES OF APPLYING THE LASER MICRODISSECTION TECHNOLOGY OF BIOLOGICAL AGENTS FOR MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF CHROMOSOMAL DNA BY ELECTROPHORESIS IN THE PLATES OF POLYACRYLAMIDE GEL

The article is devoted to studying the possibility of chromosomal DNA typing on the maximum number of STR-loci in a certain number of cells isolated from biological products using laser microdissection. The possibilities of this method for the electrophoresis in the plates of polyacrylamide gel are determined. The article established that the method cannot be recommended for use in molecular genetic laboratories of forensic institutions due to lack of sensitivity of the method.

Текст научной работы на тему «Возможности применения технологии лазерной микродиссекции биологических препаратов для молекулярногенетического анализа хромосомной ДНК, методом электрофореза в пластинах полиакриламидного геля»

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИИ: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

87

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для проведения молекулярно-генетической экспертизы по факту изнасилования в лабораторию поступили биоматериалы после проведенного медицинского аборта, установленный срок беременности 5 недель, а также образцы буккального эпителия потерпевшей и подозреваемого. Анализ отцовства усложнялся тем, что, согласно следственной версии, подозреваемый являлся биологическим отцом потерпевшей. В генетическом профиле эмбриона в данном случае предполагаются присутствие большого числа гомозиготных аллельных комбинаций. Также возможны гетерозиготные аллельные комбинации, совпадающие с аллельными комбинациями матери или отца.

Для исследования был представлен флакон, содержащий кашеобразный субстрат из крови с фрагментами мягких тканей. Содержимое банки было отфильтровано, промыто дистиллированной водой и помещено в чашку Петри. С учетом малых физических размеров эмбриона на ранних стадиях внутриутробного развития был проведен визуальный осмотр содержимого флакона для поиска фрагментов пуповины или зародышевых оболочек эмбриона. В результате визуального осмотра были выявлены два фрагмента тканевой структуры красного цвета, неравномерной окраски, в виде расслаивающихся тяжей около 2 мм в диаметре, длиной до 3—4 мм, которые могли являться фрагментами пуповины (объекты № № 1,2), и один фрагмент, имеющий вид полупрозрачной пленки 4х5 мм, который может являться фрагментом зародышевой оболочки эмбриона (объект № 3). Из обнаруженных фрагментов были сделаны вырезки. Остальные фрагменты по своему виду и структуре, вероятно, являлись свертками крови и фрагментами эндометрия.

ДНК из объектов выделяли с использованием набора PrepFiler ТМ Automated Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США), на автоматической станции для выделения ДНК «AutoMate Express™ Forensic DNA Extraction System» (Applied Biosystems, США).

Анализ матричной активности ДНК из объектов проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием системы количественной энзиматической амплификации Quantifiler® Human DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США).

Продуктивность полимеразной цепной реакции регистрировали в режиме реального времени с использованием амплификатора ABI PRISM 7500 Sequence Detection System и программного обеспечения SDS software v.1.1 (Applied Biosystems, США).

Концентрация ДНК в препаратах из объектов № № 1,2 составила 82,8 и 46,6 нг/мкл, в препарате из объекта № 3—92,5 нг/мкл. Препараты ДНК были разведены до «рабочей» концентрации 0,1 нг/мкл.

Типирование полиморфных STR-локусов ядерной ДНК из объектов проводили с помощью полимеразной цепной реакции, используя наборы реагентов «AmpFlSTR Identifiler Plus' и «Globalfiler», производства фирмы «Applied Biosystems», США, в соответствии с прилагаемыми к наборам инструкциями. Реакцию амплификации проводили с помощью прибора «GeneAmp PCR system 9700» фирмы «Applied Biosystems», США. Разделение и детекцию флуоресцентно меченых амплифицированных фрагментов проводили с использованием прибора ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer и программного обеспечения производства фирмы «Applied Biosystems». Определение длин амплифицированных фрагментов и установление номеров аллелей проводили на основе внутренних стандартов длины (Size Standard GeneScan-600 LIZ) и входя-

щих в набор реагентов аллельных леддеров с помощью программного комплекса GeneMapper ID-Х.

В препаратах ДНК из объектов № № 1, 2 установлены генетические признаки потерпевшей.

В препарате ДНК из объекта № 3 установлен смешанный генетический профиль с доминированием генетических признаков потерпевшей. Минорный генетический компонент был представлен генетическим профилем эмбриона мужского генетического пола.

Нематеринские аллели в суммарном ДНК-профиле совпали с аллелями соответствующих локусов в генотипе подозреваемого. Наличие нематеринских аллелей только в 4 локусах из 21 связано с присутствием в генотипе эмбриона гомозиготных аллельных комбинаций и гетерозиготных аллельных комбинации, совпадающих с аллельными комбинациями матери. Такие данные подтверждают следственную версию о родстве на уровне родитель-ребенок между потерпевшей и подозреваемым.

Для подтверждения выявленного родства проводился анализ STR-маркеров Y-хромосомы (набор реагентов «AmpFISTR Y-Filer PCR AmplificationKit», производства фирмы «Applied Biosystems», США).

Гаплотип Y-хромосомы, выявленный в препарате ДНК из объекта № 3, полностью совпадает с гаплотипом Y-хро-мосомы подозреваемого.

ВЫВОДЫ

Таким образом, проведение молекулярно-генетиче-ской экспертизы абортивного материала, полученного на ранних сроках беременности (5 недель), возможно, хотя и сопряжено с определенными сложностями (сложность хранения биологического материала, необходимость дифференциально-морфологического анализа абортивного материала, отбор большого числа проб, анализ смешанных генетических профилей).

Возможности применения технологии лазерной микродиссекции биологических препаратов для молекулярно-генетического анализа хромосомной ДНК, методом электрофореза в пластинах полиакриламидного геля

• В. В. Рындин1, Т. А. Смагина1, к.б.н. А. Г. Кобылянский2, Д. Д. Марков2, д.м.н., проф. В. А. Клевно1

ТБУЗ МО «Бюро СМЭ» (нач.— д.м.н., проф. В. А. Клевно)

2Центр клеточных и генных технологий федерального государственного бюджетного учреждения науки институт молекулярной генетики Российской академии (ЦКГТ ИМГ РАН)

Аннотация: Статья посвящена изучению возможности типирования хромосомной ДНК по максимальному количеству STR-локусов в определенном количестве клеток, выделенных из биологических препаратов, методом лазерной микродиссекции. Определялась возможность применения этого метода для электрофореза в пластинах полиакриламидного геля. Установлено, что в виду недостаточной чувствительности использованного метода, он не может быть рекомендован к применению в молекулярно-ге-нетических лабораториях судебно-медицинских учреждений.

Ключевые слова: биологический препарат, лазерная микродиссекция, анализ хромосомной

журнал СУДЕБНАЯ МЕДИЦИНА наука | практика | образование

www.cудебная-медицина.рф • том 1 №2, апрель 2015

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.