CC BY
380
Возможности применения рамановской микроспектроскопии для исследования структурных особенностей твердых тканей зубов человека
Мандра Ю.В.
к.м.н., доцент, зав. кафедрой пропедевтики и физиотерапии стомат. заболеваний ГОУ ВПО УГМА, г. Екатеринбург, врач-стоматолог высшей категории, [email protected]
Ивашов А.С.
аспирант кафедры пропедевтики и физиотерапии стомат. заболеваний ГОУ ВПО УГМА, г. Екатеринбург, [email protected]
Вотяков С.Л.
член-корреспондент РАН, доктор геолого-минералогических наук, зав. лабораторией физико-химических методов исследования ИГГ УрО РАН, г. Екатеринбург, [email protected]
Киселева Д.В.
к.г.-м.н., старший научный сотрудник лаборатории физико-химических методов исследования ИГГ УрО РАН, г. Екатеринбург, [email protected]
Резюме
Проведено экспериментальное исследование кристаллической структуры твердых тканей зубов человека методом раманомикроспектроскопии при различных патологических процессах. Результаты проведенного экспериментального исследования свидетельствуют об информативности метода ИК-раманоспектро-скопии для изучения кристалличности, структурных особенностей минералов твердых тканей зубов. Выявленные структурные особенности зубов при патологических процессах (кариес, повышенная стираемость) и при депульпировании необходимо учитывать при проведении эстетико-функциональной реставрации фронтальных зубов с изготовлением виниров.
Ключевые слова: рамановская микроспектроскопия, эмаль, дентин.
POSSIBILITIES OF RAMAN MICROSPECTROMETRY IMAGING FOR STRUCTURAL
INVESTIGATION OF HUMAN ENAMEL AND DENTIN
Mandra J.V., Votjakov S.L., Ivashov A.S., Kiseleva D.V.
Summary
Raman microspectrometry imaging of human dental tissues in different pathological conditions has been revealed Structural characteristics of human enamel and dentin were calculated and evaluated. Results of the spent experimental research testify about the efficacy of method Raman microspectrometry for studying of crystallinity, structural features of tooth tissues minerals.The revealed structural features of teeth with pathological processes (caries, tooth wear) and after endodontic treatment are necessary for considering in esthetic restoration with veneers
Keywords: Raman microspectrometry imaging, enamel, dentin.
Спектроскопические методы, в частности, инфракрасная (ИК) спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния света (КРС или рамановская спектроскопия), являются основными в изучении особенностей структуры и дефектообразования органо-минеральных агрегатов, в частности, костных и зубных тканей; методы дают информацию об особенностях их локальной молекулярной структуры. При этом в экспериментах по рамановской спектроскопии реализуется высокое пространственное разрешение (до 0,5-1 мкм) в сочетании с простотой пробоподготовки, сниженными требованиями к образцу (он может быть непрозрачным, гидратированным и др.) и
отсутствием разрушений после анализа; метод может рассматриваться как весьма перспективный в различных мате-риаловедческих приложениях [3].
Интерпретация рамановских спектров основана на положении, интенсивности и ширине пиков. Область 920-980 см-1. Линия симметричного валентного колебания РО43- (у^ является самой интенсивной в спектре минерализованной ткани. Ее особенностью является высокая чувствительность к минеральному окружению: частота и форма этой линии зависят от локального окружения и изменяются вследствие замещений анионных группировок и изменения степени кристалличности. Во многих исследованиях апатитовых тканей и синтетических апатитов частота линии РО43-(у^ связывалась с составом окружающего минерала [4].
В рамановской спектроскопии минерализованных тканей принято подразделять апатитовое окружение на три группы с различными частотами соответствующих линий. В замещенном карбонат-апатите В-типа (карбонат-ионы замещают фосфат-ионы в решетке апатита) фосфатная линия v1 проявляется в диапазоне 955-959 см-1. В высококристаллическом незамещенном гидроксиапатите линия v1 сдвигается в область 962-964 см-1. И, наконец, линия с частотой 945-950 см-1 свидетельствует о наличии разупорядоченной фосфатной решетки апатита [4]. Происходит ли это вследствие замещений А-типа (карбонат-ионы замещают гидроксил-ионы) или из-за присутствия аморфного фосфата кальция, неясно; авторы [4] используют термин «разупо-рядоченный фосфат». В общем случае, в костной и зубной ткани полоса фосфата v1 является суперпозицией всех трех составляющих; обычно она имеет несимметричную форму из-за вклада колебаний разупорядоченного фосфата и незамещенного гидроскиапатита. Для оценки степени кристалличности апатита используют вычисление ширины линии фосфата v1 на ее полувысоте [5].
Область 1065-1070 см-1 соответствует колебаниям карбонат-иона В-типа. Для оценки отношения фосфат/карбонат принято использовать отношения интенсивностей соответствующих пиков рамановского спектра: 959 см-1 для РО43- и 1070 см-1 - для СО32-, причем можно использовать как отношение амплитуд пиков, так и их площадей.
Область 1400-1800 см-1. Колебания органической матрицы в данной области обусловлены, в основном, двумя разновидностями связей: колебания связей -СО-ЫН-, формирующих белковую основу, и колебания, связанные с боковыми цепочками аминокислот. На рамановских спектрах наиболее ярко проявляются пики белковых связей амидной группировки -СОЫН2, имеющей 9 колебательных мод; в спектре регистрируются следующие полосы: амид I (1655-1675 см-1), который представляет собой, главным образом, валентное колебание С=О; амид II (1560 см-1, деформационное колебание Ы-Н, валентное С-Ы); амид III (1240-1260 см-1, валентное С-Ы, деформационное Ы-Н) [5]. Низкоинтенсивное плечо пика при 1620 см-1 соотносят с колебаниями боковой цепочки тирозина Y8а. Пик 1450 см-1 соответствует деформационному крутильному колебанию СН2 в коллагене (два атома водорода, ковалентно связанных с одним и тем же атомом углерода, симметрично двигаются подобно веслам при гребле) [5]. Во многих публикациях пик колебаний амида I (1665 см-1) используется для оценки относительного содержания органической матрицы и расчета отношений минерал/органическая матрица [4, 5].
Область 2750-3350 см-1. Пики в этой области, как правило, соотносят с колебаниями связей С-Н (2880-2935, 3070 см-1) и С-Ы (3320, 3435 см-1) в коллагене [6]. Упомяну -тыми авторами пик при 2940 см-1 использовался для оценки соотношения минерал/коллаген по отношению площадей пиков 960 см-1/2940 см-1.
Цель исследования - изучить особенности строения твердых тканей зубов при кариозном процессе, при некариозном поражении на примере патологической стираемости зубов, депульпировании методом ИК раманоспектрометрии.
Задачи исследования
1) Провести ИК раманоспектрометрию твердых тканей зубов при кариозном процессе, зубов при некариозном поражении на примере генерализованной патологической стираемости зубов, депульпированных зубов.
2) Установить особенности рамановских спектров образцов твердых тканей зубов при кариозном процессе, зубов при некариозном поражении на примере генерализованной патологической стираемости зубов, депульпирован-ных зубов.
3) Оценить кристалличность и упорядоченность структуры гидроксиапатита, минерализованность, соотношение минерал/органическая матрица, исследовать особенности твердых тканей зубов при кариозном процессе, зубов при некариозном поражении на примере генерализованной патологической стираемости зубов, депульпиро-ванных зубов.
Материалы исследования
Материалом исследования послужили 16 человеческих зубов, удаленных по ортопедическим и ортодонтическим показаниям, среди них интактные, кариозные, с проявлениями повышенной стираемости и депульпированные (по 4 образца). Свежеудаленные зубы промывали проточной водой, очищали от остатков мягких тканей, обрабатывали антисептиками и выдерживали в 0,9% растворе хлорида натрия при температуре 5-7°С. Из каждого зуба изготовлено два образца твердых тканей (эмали и дентина) размером 2х2х1 мм (рис. 1).
Методы исследования
Образцы (восемь фрагментов твердых тканей зубов) помещены в эпоксидную смолу и смонтированы на предметное стекло. Анализ выполнен в точке геометрического центра образца. Эксперименты выполнены на рамановском спектрометре LabRam HR (HORIBA Scientific) с решеточным монохроматором (фокус 800 мм, плоское поле, скорректированное на хроматизм), многоканальным CCD детектором (1024x256 пикселей со спектральным диапазоном 200-1050 нм, спектральное разрешение 0,35 см-1/пиксель при 633 нм с решеткой 1800 штр/мм). Для возбуждения рамановских спектров использовался лазер (длина волны излучения 632 нм, мощность излучения на образце 7мВт, время измерения 15-25 с, объектив 100х). Оцифрованные спектры обработаны в программе PeakFit V.4.11, произведена коррекция базовой линии, сглаживание спектров, разложение суммарных пиков на элементарные составляющие.
Рис. 1. Рамановский спектр, полученный при исследовании образцов дентина и эмали
WWW.DENTAL-PRESS.COM
ACTUAL PROBLEMS OF STOMATOLOGY
25
результаты и обсуждение
На рис. 1 приведены полученные рамановские спектры образцов твердых тканей зубов человека в диапазоне 150-3400 см-1. Интерпретация линий спектра по данным [Tamowski et al, 2002; Ager et al, 2006] приведена в табл. 1 (линии 1508 и 1250 см-1 приписаны эпоксидной смоле и исключены из рассмотрения).
Таблица 1.
Идентификация рамановских спектров [Tarnowski et al, 2002; Ager et al, 2006]
Романовский частотный сдвиг, см-' Фрагмент, колебание
430 РО43- у4 (Р-0 деформационное)*
580 РО43- у4 (Р-0 деформационное)*
855 Бензольное кольцо пролина
876 Бензольное кольцо гидроксипролина
950-964 РО43- у, (Р-О симметричное валентное)*
1001-1003 «Дыхательная» мода бензольного кольца фенилаланина
1030 РО43- у3 (Р-О асимметричное валентное)*
1045 РО43- у3 (Р-О асимметричное валентное)*
1065-1070 СО32- V, замещение В-типа (С-О плоскостное валентное)*
1245-1270 Амид III, С-Ы-Н валентное
1445 СН2 деформационное крутильное
1555-1565 Амид II, С-Ы-Н валентное
1610-1620 У8а (колебания побочной цепочки тирозина)
1665 Амид I, С-С-Н валентное
2880-2935, 3070 Колебания С-Н
3350 Колебания С-Ы
Расчеты интенсивностей рамановских спектров представлены в табл. 2.
На основании рассчитанных положений линии v1 фосфат-иона (957.978-960.049 см-1) можно констатировать, что минеральная фаза всех исследованных образцов представляет собой замещенный по В-типу карбонат-гидрокси-апатит, причем его относительное содержание - наимень-
шее в образце дентина зуба с некариозным процессом, что свидетельствует об уменьшении упорядоченности фосфатной решетки гидроксиапатита при повышенной стираемо-сти зубов.
Ширина пика РО4 на полувысоте свидетельствует о степени кристалличности гидроксиапатита.
Ширина пика РО4 на полувысоте свидетельствует о степени кристалличности гидроксиапатита (см. табл. 2). Наибольшие значения показателя отмечены в дентине де-пульпированного зуба, в эмали зубов при кариесе и повышенной стираемости. Образец дентина депульпированного зуба имеет наименьшую степень кристалличности, что объясняется снижением обменных процессов в дентине после удаления пульпы при сохранении обменных процессов между эмалью и ротовой жидкостью.
Распределение СО3/РО4. Отражается снижение кристалличности за счет замещения фосфат-иона карбонат-ионом. Наибольшие показатели отмечены также в дентине депуль-пированного зуба, а также в эмали и дентине при кариесе.
Наибольшее соотношение минерал/органическая матрица. Наблюдается в образцах эмали и дентина депульпи-рованных зубов.
Полученные данные свидетельствуют об изменении количественного состава и пространственных изменений кристаллов гидроксиапатита:
1. Гидроксиапатит в образцах эмали и дентина интак-тного зуба имеет наибольшую степень кристаллизации и наименьшее замещение фосфат-иона карбонат-ионом, что говорит об оптимальной минерализации твердых тканей этих образцов.
2. Образцы эмали и дентина, пораженных кариозным процессом, содержат гидроксиапатит деминерализованный, карбонат-замещенный, со сниженной интенсивностью пика фосфата, но в образцах нет значительного увеличения количества органической составляющей.
3. Показатели спектра в образцах эмали депульпирован-ных зубов схожи с показателями образцов эмали интактных зубов. Кристалличность эмали депульпированных зубов даже выше, чем у эмали интактных зубов. Образцы дентина депульпированного зуба показали наименьшую кристалличность, наименьшую минерализацию, значительное увеличение рамановских пиков, отвечающих за органиче-
Таблица 2.
Данные расчета интенсивностей спектров раманоспектроскопии (М)
Исследованный фрагмент Положение линии РО43- (v), см-1 Ширина линии POJl-(vI) на полувысоте Интегральная интенсивность линии РО43- (V'), отн. ед. Интегральная интенсивность линии СО32-, отн. ед. Отношение СО./ РО4 Интегральная интенсивность пика амида I, отн. ед. Отношение минерал/органическая матрица
Эмаль интактная 9б0,049 17,б1 40465 9135 0,22б 5685 7,118
Эмаль депульп. 959,014 15,538 99491 23100 0,232 16900 5,887
Эмаль кариозн. 9б0,049 18,б4б 57287 19170 0,335 17397 3,293
Эмаль некариоз. 959,014 18,б4б 49768 14991 0,301 16016 3,107
Дентин интактн. 9б0,049 18,б4б 37202 8993 0,242 б151 б,048
Дентин депульп. 959,014 24,8б1 43722 25132 0,575 37097 1,179
Дентин кариозн. 959,014 18,б4б 48б83 17873 0,3б7 18381 2,б49
Дентин некариоз. 957,978 18,б4б 43885 12209 0,278 9510 4,б15
скую составляющую. Полученные данные согласуются с ранее проведенными исследованиями [1].
4. Образцы эмали зуба, пораженного некариозным процессом, имеют сниженную минерализацию и кристалличность, увеличение органической составляющей. Образцы дентина зуба с повышенной стираемостью имеет значительно сниженную кристалличность среди исследуемых образцов, но при этом высокое соотношение минерал/органический матрикс, что совпадает с данными ранее проведенных исследований [2].
Выводы
Результаты проведенного экспериментального исследования свидетельствуют об информативности метода ИК-раманоспектроскопии для изучения кристалличности, структурных особенностей минералов твердых тканей зубов.
Выявленные структурные особенности зубов при патологических процессах (кариес, повышенная стираемость) и при депульпировании необходимо учитывать при проведении эстетико-функциональной реставрации фронтальных зубов с изготовлением виниров.
литература
1. Акмалова ГМ. Экспериментально-клиническое обоснование выбора пломбировочных материалов при лечении не-
осложненного и осложненного кариеса. Дис. ... канд.мед. наук / Г.М. Акмалова. - Екатеринбург, 2006. - 147 с.
2. Мандра Ю.В. Повышенная стираемость зубов: ранние клинические проявления, морфоструктурные изменения, лечебно-профилактические методы коррекции. Автореферат дисс. ... доктора мед. наук. / Ю.В. Мандра. - Екатеринбург, 2011. - 48 с.
3. On the Increasing Fragility of Human Teeth With Age: A Deep-UV Resonance Raman Study [Text]/ Ager III J.W., Nalla R.K., Balooch G., Kim G., Pugach M., Habelitz S., Marshall G.W., Kinney J. H., O’Ritchie R. // Journal of Bone and Mineral Research. 2006. V. 21. № 12. P. 1879-1887.
4. Mineralization of Developing Mouse Calvaria as Revealed by Raman Microspectroscopy [Text]/ Tarnowski C.P., Ignelzi Jr M.A., Morris M.D. // Journal of Bone and Mineral Research. 2002. V.17. № 6. P. 1118-1126.
5. Skeletal Self-Repair: Stress Fracture Healing by Rapid Formation and Densification of Woven Bone [Text]/ Uthgenannt B.A., Kramer M.H., Hwu J.A., Wopenka B., Silva M.J. // Journal of Bone and Mineral Research. 2007. V.22. № 10. P. 1548-1556.
6. Novel Assessment of Bone Using Time-Resolved Transcutaneous Raman Spectroscopy [Text]/ Draper E.R.C., Morris M.D., Camacho N.P., Matousek P., Towrie M., Parker A.W., Goodship A.E. // Journal of Bone and Mineral Research. 2005. V. 20. № 11. P. 1968-1972.
О
Q-
o
<=t
О
о
о
\
\
DRY TIPS „ПАМПЕРС" ДЛЯ ПОЛОСТИ РТА
Впитывает слюну намного лучше валика, почти в 30 раз больше собственного веса! о Не выделяет накопленную влагу при надавливании, о в некоторых случаях может заменить Rubber Dam.
Уменьшает риск воспаления слюнных желез, который может быть вызван контаминацией.
Легко прилипает к слизистой, эластичен, повторяет движения щек, легко удаляется.
Более комфортен для пациента, не оставляет волокон в полости рта.
Прицельно изолирует протоку околоушной железы, при любом ее топографическом положении.
Сохраняет стабильное положение на месте прикрепления даже во время активной работы, о В отличие от ватного валика, занимает меньше пространства, оставляя большее рабочее поле.
АкгаНмау ’
medico!
Поставщик Dry Tips в России:
ООО «Крафтвэй Медика л»
Теп. (495) 232-69-33. www.kraftwavdental.ru
к S'*
