CC BY
69
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2005 УДК 616.12-008.318:575.224.234
ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ГЕННЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ РИТМА СЕРДЦА
Л. А. Бокерия, Е. З. Голухова, Т. Т. Какучая
Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева (дир. - академик РАМН Л. А. Бокерия) РАМН, Москва
Нарушения ритма сердца продолжают оставаться одними из наиболее частых причин заболеваемости и смертности во всем мире. Так, от внезапной сердечной смерти вследствие желудочковых тахиаритмий в США ежегодно умирает около 300 тыс. человек, а фибрилляция предсердий, от которой страдает более 2-х млн. американцев, является ведущей причиной возникновения ишемических инсультов среди взрослого населения. Современные методы лечения аритмий направлены на модификацию патологического электрофи-зиологического субстрата и включают следующие направления: фармакотерапию, имплантацию различных устройств и хирургические методы лечения или катетерную аблацию. Фармакотерапия являлась опорой антиаритмического лечения в течение многих десятилетий. Традиционно анти-аритмические препараты классифицируют по их электрофизиологическим эффектам на клеточном уровне, в частности, по их способности воздействовать на возбудимость, длительность потенциала действия и автоматизм. Несмотря на хорошую результативность многих антиаритмических препаратов в лечении различных аритмий, их применение может быть ограничено вследствие неблагоприятного воздействия на функцию сердца в целом, относительно низкую эффективность, часто возникающие и трудно переносимые системные побочные эффекты и, что наиболее важно, из-за проаритмогенных эффектов, ведущих к парадоксальному возрастанию уровня смертности.
Радиочастотная катетерная аблация революционизировала клиническую электрофизиологию, дав возможность с 90%-ной эффективностью устранять целый ряд тахиаритмий — большинство су-правентрикулярных аритмий и некоторые виды желудочковых тахикардий (за исключением полиморфной желудочковой тахикардии/фибрилляции желудочков), существенно превосходя таким образом эффективность антиаритмических препаратов. Однако такие часто встречающиеся нарушения ритма сердца, как фибрилляция предсердий и вышеуказанные формы желудочковой тахикардии, в меньшей степени поддаются такому виду лечения.
Что касается имплантируемых устройств — ежегодно в США имплантируют около 250 тыс. электрокардиостимуляторов и 60 тыс. кардиовертеров-дефибрилляторов. Имплантация электрокардиостимуляторов (ЭКС) является современным методом паллиативного лечения брадиаритмий, а кар-диовертеры-дефибрилляторы успешно используются вот уже более 20 лет также для паллиативного лечения только жизнеугрожающих желудочковых аритмий. Положительная результативность подобной тактики у пациентов с высоким риском — а именно у пациентов со сниженной сократительной функцией левого желудочка, переживших внезапную сердечную смерть и т. д., была отчетливо продемонстрирована в целом ряде масштабных рандомизированных исследований. Однако, будучи спасительным, подобный вид лечения не предотвращает возникновение жизнеугрожающих нарушений ритма в последующем. Кроме того, у пациентов с низким риском — сохранной сократительной функцией левого желудочка — необходима тщательная оценка соотношения пользы и риска при имплантации кардиовертеров-дефибрилляторов.
Таким образом, вышесказанное побуждает стремиться к разработке новых методов, альтернативных имеющимся методам лечения аритмий, на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии, генетики и биоинженерии, которые являлись бы не паллиативными, а радикальными — позволяющими предотвращать и устранять аритмии.
Понимание молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе аритмий, позволило начать применение генных препаратов в лечении этих заболеваний. Соматическая генная терапия позволяет манипулировать генной экспрессией соматических клеток, что дает возможность противодействовать болезни по аналогии с фармакотерапией, но в отличие от последней однократное введение нужного гена в орган-мишень может обратить патологию и действовать в течение всего жизненного цикла организма без системного воздействия на него, однако данное корригирующее действие не передается следующим поколениям. При этом следует отметить, что селективная доставка необходи-
АННАЛЫ АРИТМОЛОГИИ, № 4, 2005
АННАЛЫ АРИТМОЛОГИИ, № 4, 2005
мого функционирующего терапевтического гена может быть направлена как на стимуляцию, так и на торможение секреции определенных белков с целью регресса патофизиологии заболевания.
Гипотетически клеточные технологии могут использоваться в лечении аритмий для того, чтобы:
1) заменить отсутствующие или патологически измененные клетки проводящей системы сердца;
2) модифицировать измененный электрофизиоло-гический субстрат миокарда донора с помощью имплантации клеток, трансфецированных генетическими конструкциями, экспрессирующими специфические ионные каналы (токи); 3) изменить микроокружение в миокарде путем локальной секреции специфических рекомбинантных белков.
Важным шагом в подтверждении возможностей антиаритмической терапии с использованием генных и клеточных технологий при брадиаритмиях явились экспериментальные исследования, показавшие возможность создания потенциальных триггеров-инициаторов сердечных сокращений и возбудимого субстрата для их дальнейшего проведения, иными словами, создание так называемого биологического стимулятора. Современные электрокардиостимуляторы, использующиеся для уменьшения смертности и заболеваемости при полных атриовентрикулярных блокадах и дисфункциях синусного узла, имеют ряд ограничений: 1) несмотря на усовершенствование технологий, ЭКС не могут замещать автономную модуляцию сердечного ритма — то есть обеспечить адекватный ответ на физические и эмоциональные нагрузки; 2) у детей по мере роста организма требуется замена стимулятора;
3) выбор места фиксации стимулирующего электрода имеет большое значение, так как результирующий путь активации может оказать положительное или отрицательное действие на электрофизиологию или сократительную функцию миокарда; 4) разрядка батареи через определенные промежутки времени требует ее замены; 5) могут возникнуть инфекционные осложнения, требующие замены стимулятора; 6) и наконец, электрокардиостимуляторы могут выйти из строя под воздействием различных металлодетекторов, нейростимуляторов, магнитнорезонансной томографии. В отличие от ЭКС, использование биологических стимуляторов в идеале может дать целый ряд преимуществ: 1) позволит создать стабильный физиологичный ритм пожизненно; 2) не потребует батареи или электрода и соответственно их замены; 3) не будет риска инфекционновоспалительных осложнений и неоплазий; 4) обеспечит соответствующие изменения сердечного ритма в ответ на физиологические потребности организма; 5) позволит максимизировать эффективность сокращений и сердечный выброс, способствуя проведению возбуждения и активации соответ-
ственно индивидуальной анатомии; 6) будет обладать ограниченным аритмогенным потенциалом, или последний будет вовсе отсутствовать; 7) будет представлять собой радикальный, а не паллиативный метод лечения. С целью создания биологического стимулятора в настоящее время прошли экспериментальные исследования (как in vitro, так и in vivo, на различных животных — крысах, морских свинках, свиньях, собаках, с созданием моделей синдрома слабости синусного узла и полной атриовентрикулярной блокады) три концепции: 1) регуляция нейрогуморальных воздействий (путем повышения экспрессии в-адренергических рецепторов с помощью внедрения плазмидной конструкции гена, несущего в-адренергический рецептор) [3, 7]; 2) уменьшение ионных токов, участвующих в реполяризации миокарда; идея заключалась в том, что сокращение гиперполяризующих ионных потоков фиксировало бы мембранные потенциалы на уровне отрицательных значений и способствовало увеличению вклада входящих ионных токов в процесс деполяризации и тем самым потенцированию стимуляции [8—11]; 3) увеличение входящих ионных токов во время диастолы, то есть повышение экспрессии входящих деполяризующих ионных токов; исследования в этом направлении сконцентрированы на токе If, так как это единственный ионный ток, который функционирует только в диастолу, и, таким образом, он не будет удлинять потенциал действия, и он хорошо регулируется автономной нервной системой; исследовалась возможность влияния повышенной экспрессии гена HCN2, кодирующего If-ток, на инициацию последнего и соответственно индукцию сердечных сокращений [15, 16]. Из трех вышеуказанных концепций пока только последняя показала явную эффективность с точки зрения безопасности, отсутствия побочных эффектов, физиологичности и автономной адаптации. Что касается применения клеточных технологий с целью создания биологического стимулятора, наиболее обнадеживающими оказались исследования с использованием взрослых мезенхимальных стволовых клеток человека (благодаря их низкой антиген-ности, свойствам ионных каналов и способности переносить красители и передавать ионные токи друг другу, другим клеточным линиям, в том числе и миоцитам), трансфецированных нужными генами (HCN); в отличие от изолированной генной терапии HCN-экспрессирующие взрослые мезенхимальные стволовые клетки синхронизированно взаимодействовали с кардиомиоцитами хозяина и таким образом давали возможность избежать спорадической активации сердечного ритма [5, 19].
Механизмы возникновения тахиаритмий (риен-три, триггерная активность и анормальный автоматизм) могут быть результатом патологических изме-
нений электрофизиологии и/или структурного субстрата в миокарде. Эти изменения могут быть врожденными (например, различные генные мутации ионных каналов при врожденном синдроме удлиненного интервала QT, синдроме Бругада и т. д.) или приобретенными (например, желудочковые аритмии, возникающие при ишемической болезни сердца и сердечной недостаточности, или развитие фибрилляции предсердий при этих или других заболеваниях). Патологический субстрат, лежащий в основе возникновения этих аритмий, может быть анатомическим или функциональным и может локализоваться в специфическом участке миокарда или затрагивать весь миокард. Генная терапия при тахиаритмиях может преследовать следующие цели: 1) изменение глобальных электрофизиологических свойств миокарда для уменьшения длительности потенциала действия при приобретенном или врожденном синдроме удлиненного интервала QT (сердечная недостаточность рассматривается в качестве прототипа приобретенного синдрома удлиненного QT); для этого проводились следующие экспериментальные исследования: а) повышение экспрессии гена KV4,3, кодирующего исходящий калиевый ток Ito, приводило к значительному уменьшению длительности потенциала действия (экспериментальные исследования H. B. Nuss [13] с гиперэкспрессией гена Drosophila shaker B, кодирующего калиевый канал, в кардиомиоциты желудочка на моделях собак с сердечной недостаточностью); б) повышение экспрессии гена человека HERG, кодирующего калиевый канал, обеспечивающего быстрый компонент тока с задержанным выпрямлением (Ikr) фазы реполяризации в миокарде, приводило к выраженному уменьшению продолжительности потенциала действия, увеличению относительного рефрактерного периода и уменьшению частоты ранних постдеполяризаций [14]; в) повышение экспрессии добавочной субъединицы KCNE3 для усиления активности KCNQ1 канала, способствовало увеличению активности калиевого канала обеспечивающего медленный компонент тока с задержанным выпрямлением (Iks) фазы реполяризации в миокарде, и таким образом приводило к уменьшению продолжительности потенциала действия и интервала QT [17]; г) повышение экспрессии кальциевой АТФ-азы саркоплазматическо-го ретикулума (SERCA) изолированно или в сочетании с геном, кодирующим Kir2,1 компонент калиевого тока с задержанным выпрямлением, приводило не только к уменьшению продолжительности потенциала действия, но и увеличению контрактиль-ности миокарда [18]; 2) локальное изменение электрофизиологических свойств: а) D. Y Burton и соавт. исследовали эффект гиперэкспрессии миссенс-му-тации гена Q9E-hMiRP1, кодирующего калиевый
ток. Установлено, что данная мутация является причиной синдрома удлиненного интервала QT и может приводить к уменьшению калиевого тока после введения кларитромицина. In vitro трансфекция мутантного гена Q9E-hMiRP1 способствовала кларит-ромицин-индуцированному снижению исходящего калиевого тока в трансфецированных клетках по сравнению с результатами трансфекции другого типа мутантного гена hMiRP1. Доставка плазмидной конструкции гена Q9E-hMiRP1 в миокард предсердий свиньи (15% предсердных миоцитов оказались трансфецированными этим геном) приводила к удлинению потенциала действия предсердий. Исследователи пришли к выводу, что этот мутантный ген может оказывать локальное действие на ткань предсердий, подобное антиаритмическому препарату III класса, и таким образом использоваться в будущем для лечения предсердных риентри аритмий [1]; б) J. K. Donahue и соавт. [2] в эксперименте осуществили «модификацию» АВ-узла при фибрилляции предсердий путем селективной доставки в область АВ-узла гена с повышенной экспрессией ингибирующего Ga12 белка, который подавил проводимость АВ-узла без его блокады, уменьшив тем самым частоту желудочкового ритма (своеобразная имитация эффекта бета-адреноблокаторов).
Относительно применения клеточных технологий для лечения тахиаритмий следует отметить, что необходимо выделение и создание разных подтипов человеческих кардиомиоцитов (с фенотипом пейсмейкерных, предсердных, желудочковых клеток, клеток системы Гиса—Пуркинье), поддающихся генетическим манипуляциям, способных структурно и функционально интегрироваться в ткань-мишень реципиента; таким требованиям отвечают кардиомиоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека — они успешно интегрируются в ткань сердца ex vivo, образуя единый функционирующий синтиций сердца [6]. Оказалось, что фибробласты также могут образовывать щелевые контакты с кардиомиоци-тами хозяина и генерировать электрические взаимодействия с последними — так, с целью изменения возбудимости желудочков сердца крысы были имплантированы фибробласты, трансфецирован-ные для экспрессии специфических калиевых каналов (Kv1,3), что привело к выраженному уменьшению амплитуды внеклеточного сигнала и появлению множественных локальных участков с блокадой проведения; данные изменения исчезли после введения специфического блокатора Kv1,3 [4].
Несмотря на значительный прогресс в понимании соматической генной терапии и ее потенциальной роли в радикальном лечении аритмий, мы должны реально осознавать, что находимся лишь в самом начале пути к ее изучению в эксперименте.
АННАЛЫ АРИТМОЛОГИИ, № 4, 2005
АННАЛЫ АРИТМОЛОГИИ, № 4, 2005
Для внедрения в клиническую электрофизиологию необходимо, чтобы генные технологии доказали свою безопасность, высокую и длительную эффективность, возможность целенаправленного воздействия на ткани-мишени без индукции реакций со стороны иммунной системы, словом, значительное превосходство над традиционными методами терапии. На пути применения генных технологий в лечении аритмий есть определенные сложности: 1) все еще недостаточные знания молекулярных механизмов, лежащих в основе многих аритмий, и пространственное и временное разнообразие экспрессии ионных каналов в различных участках миокарда могут препятствовать использованию единичных трансгенов ионных каналов; 2) для успешного анти-аритмического лечения необходима устойчивая и длительная экспрессия трансгена (месяцы и годы), что труднодостижимо с использованием современных векторных технологий; 3) главным недостатком используемых в настоящее время технологий является невозможность адекватного контроля уровня или степени трансгенной экспрессии внутри клеток, невозможность определения точного количества трансфецированных миоцитов, их трансмурального и регионального распределения в сердце. В целом в настоящее время миокардиальная экспрессия in vivo с использованием современных вирусных векторов непредсказуема, дает относительно кратковременный эффект, не гомогенна, может способствовать повышенной дисперсии различных элект-рофизиологических свойств и тем самым спровоцировать возникновение аритмий. Таким образом, на сегодняшний день не изученными остаются множество важных вопросов: каковы оптимальные дозы и пути введения генных препаратов, возникают ли при их применении какие-либо нежелательные эффекты в отдаленном периоде наблюдения, каковы особенности их фармакокинетики и фармакодинамики в организме человека, является ли их действие продолжительным, и если да, то насколько?
Использование клеток (фибробластов, различных дериватов стволовых клеток и т. д.), которые могут быть подвергнуты генетическим манипуляциям ex vivo для инициации определенных электрофизио-логических свойств, а затем имплантированы в сердце in vivo, может иметь ряд преимуществ перед изолированной генной терапией: большую эффективность и лучший контроль над процессом трансфекции ex vivo, возможность проводить фенотипический скрининг клеток перед их трансплантацией и более пролонгированный эффект (последнее было продемонстрировано в исследовании [12]), а также позволит снизить аритмогенный риск, обусловленный негомогенностью реполяризации за счет гетерогенной экспрессии генов. Так же, как и с генными препаратами, остаются открытыми множество
вопросов: мигрируют ли имплантированные клетки или остаются на месте, дифференцируются ли они в другие виды клеток, как они функционируют в организме человека (так же, как в моделях различных животных, или нет), какова гарантия отсутствия развития злокачественных осложнений, тератогеннос-ти, инфекционных осложнений, реакции отторжения? Нет полных ответов на вопросы о предпочтительном типе клеток, их оптимальном количестве, наилучшем времени и пути введения и, главным образом, о способности этого метода заменить существующие ныне традиционные методы терапии.
Решение вышеизложенных проблем не является легкой задачей. Однако с учетом того, что конечной целью терапии больных является в большей степени их радикальное излечение, чем симптоматическое лечение, попытка нахождения возможных путей решения этих проблем оправданна.
ЛИТЕРАТУРА
1. Burton D. Y., Song C., Fishbein I. et al. The incorporation of an ion channel gene mutation associated with the long QT syndrome (Q9E-hMiRP1) in a plasmid vector for site-specific arrhythmia gene therapy: In vitro and in vivo feasibility studies // Hum. Gene. Ther. - 2003. - Vol. 14.
- P. 907-922.
2. Donahue J. K., Heldman A. W., Fraser H. et al. Focal modification of electrical conduction in the heart by viral gene transfer // Nat. Med. - 2000. - Vol. 6. - P. 1395-1398.
3. Edelberg J. M., Aird W. C., Rosenberg R. D. Enhancement of murine cardiac chronotropy by the molecular transfer of the human beta2adrenergic receptor cDNA // J. Clin. Invest. - 1998. - Vol. 101. - P. 337-343.
4. Feld Y., Melamed-Frank M., Kehat I. et al. Electrophysio-logical modulation of cardiomyocytes tissue by transfected fibroblasts expressing potassium channels: A novel strategy to manipulate excitability // Circulation. - 2002.
- Vol. 105. - P. 522-529.
5. Huebach J. F., Graf E. M., Leutheuser J. et al. Electrophysio-logical properties of human mesenchymal stem cells // J. Physiol. - 2003. - Vol. 554, № 3. - P. 659-672.
6. Kehat I., Amit M., Gepstein A. et al. Functional integration of human embryonic stem cell derived cardiomyocytes with preexisting cardiac tissue: Implication for myocardial repair // Circulation. - 2001. - Vol. 104 (Suppl. II).
- P. 618.
7. Martin E. T., Coman J. A., Shellock F. G. et al. Magnetic resonance imaging and cardiac pacemaker safety at 1.5-Tesla // J. Amer. Coll. Cardiol. - 2004. - Vl. 43, № 7. - P. 1315-1324.
8. Miake J., Marban E., Nuss H. B. Biological pacemaker created by gene transfer // Nature. - 2002. - Vol. 419.
- P. 132-133.
9. Miake J., Marban E., Nuss H. B. Functional role of inward rectifier current in heart probed by Kir2.1 overexpression and dominant-negative suppression // J. Clin. Invest.
- 2003. - Vol. 111, № 10. - P. 1529-1536.
10. Miake J., Nuss H. B. Mechanism of automacity induced by dominant-negative suppression of IK1 in guinea pig ventricular myocytes // Biophys. J. - 2003. - Vol. 84, № 2.
- P. 1529 (Part 2 of 2).
11. Miake J., Nuss H. B. Multiple ionic conductances sustain IK1-suppressed biopacemaking // Circulation. - 2003.
- Vol. 108. - P. IV-35.
12. Muller-Ehmsen J., Peterson K. L., Kedes L. et al. Rebuilding a damaged heart: Long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function // Ibid. - 2002.
- Vol. 105. - P. 1720-1726.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 73
13. Nuss H. B., Johns D. C., Kaab S. et al. Reversal of potassium channel deficiency in cells from failing hearts by adenoviral gene transfer: A prototype for gene therapy for disorders of cardiac excitability and contractility // Gene Ther.
- 1996. - Vol. 3. - P. 900-912.
14. Nuss H. B., Marban E., Johns D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes // J. Clin. Invest.
- 1999. - Vol. 103. - P. 889-896.
15. Plotnikov A. N, Sosunov E. A., Qu J. et al. A biological pacemaker implanted in the canine left bundle branch provides ventricular escape rhythms having physiologically acceptable rates // Circulation. - 2004. - Vol. 109. - P. 506-512.
16. Qu J., Plotnikov A. N., Danilo P. Jr et al. Expression and function of a biological pacemaker in canine heart // Ibid. - 2003. - Vol. 107. - P. 1106-1109.
17. Schroeder B. C., Waldegger S., Fehr S. et al. A constitutively open potassium channel formed by KCNQ1 and KCNE3 // Nature. - 2000. - Vol. 403. - P. 196-199.
18. Terraciano C. M., Hajjar R. J., Harding S. E. Overexpres-sion of SERCA2a accelerates repolarisation in rabbit ventricular myocytes // Cell Calcium. - 2002. - Vol. 31. - P. 299-305.
19. Valiunas V., Doronin S., Valiuniene L. et al. Human mesenchymal setm cells make cardiac connexins and form functional gap junctions // J. Physiol. - 2004. - Vol. 555, № 3. - P. 617-626.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2005 УДК 616.12-008.318:612.172.2-08
КЛИНИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ И ОСОБЕННОСТИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ С ПОДТВЕРЖДЕННЫМ ГЕНЕТИЧЕСКИ СИНДРОМОМ УДЛИНЕННОГО ИНТЕРВАЛА £Г, ТИП 1
Л. А Бокерия, А Ш. Ревишвили, Е. А Пантелеева, И. В. Проничева, Е. В. Заклязьминская*, А В. Поляков*
Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева (дир. - академик РАМН Л. А. Бокерия) РАМН, *ГУ Медико-генетический научный центр (дир. - академик РАМН Е. К. Гинтер) РАМН, Москва
В статье представлены результаты клинического и молекулярно-генетического обследования 13 больных с синдромом удлиненного интервала QT из 8 неродственных семей. В 5 семьях диагноз первичного синдрома удлиненного интервала QT был подтвержден молекулярно-генетическими методами. Проведен анализ клинической вариабельности синдрома, а также оценка эффективности различных методов лечения.
Ключевые слова: желудочковые аритмии, синкопе, генетическая гетерогенность, вариабельность фенотипа.
We present the results of clinical and molecular-genetic investigation of 13 patients with long QT syndrome from 8 non-related families. In 5 families diagnosis of inherited long QT syndrome was confirmed by molecular-genetic tests. We have analyzed clinical variability of this syndrome and assessed the efficacy of different treatment methods.
Key words: ventricular arrhythmias, syncope, genetic heterogeneity, phenotype variability.
Синдром удлиненного интервала QT (CyQT) — заболевание, характеризующееся увеличением продолжительности интервала QT, синко-пальными состояниями и высоким риском внезапной смерти вследствие перехода полиморфной желудочковой тахикардии (ЖТ) типа «пируэт» («torsades de pointes») в фибрилляцию желудочков (ФЖ). Внезапная сердечная смерть возможна при первом синкопальном эпизоде в отсутствие долж-
ного лечения. Выделяют две клинические формы заболевания: синдром Романо—Уорда (Romano— Ward) с аутосомно-доминантным типом наследования и синдром Джервелла—Ланге—Нильсена (Jervell—Lange— Nielsen) с аутосомно-рецессивным типом наследования. В последнем случае удлинение интервала QT сочетается с врожденной нейро-сенсорной глухотой. Этиология и патогенез заболевания длительное время были неясны. Все эти дан-
АННАЛЫ АРИТМОЛОГИИ, № 4, 2005
