CC BY
18
М.А. Виленский1, Д.А. Александров2, 4, П.А. Тимошина1, В.В. Тучин1' 3, А.А. Скороход2, А.С. Яровой2
Возможности мониторинга кровотока в тканях поджелудочной железы методом лазерной спекл-визуализации в норме и при реперфузии
1 Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского
2 Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского
3 Институт проблем точной механики и управления РАН, г. Саратов 4 Филиал ФГБУЗ ЦМСЧ № 119 ФМБА России - МСЧ № 9, г. Саратов
M.A. Vilensky1, D.A. Alexandrov2' 4, P.A. Timoshina1, V.V. Tuchin1' 3, A.A. Scorokhod2, A.S. Yarovoy2
Blood flow monitoring in normal and re-perfused pancreatic tissue by the method of laser speckle-visualization
1 Saratov State University named by N.G. Chernyshevsky 2 Saratov State Medical University named by V.I. Razumovsky
3 Institute of Precision Mechanics and Control, Russian Academy of Sciences, Saratov
4 FGBHI Branch (Federal Governmental Budgetary Healthcare Institution) Joint Medical Service № 119 FMBA — Joint Medical Service № 9, Saratov
Введение
В 1980-х годах были проведены исследования, показавшие высокую чувствительность поджелудочной железы к понижению перфузии и к ишемии и выявившие прямую связь между патологическими изменениями тканей железы и повторным нарушением кровотока [2]. Установлено также, что тяжелая ишемия поджелудочной железы является инициатором панкреатита. Посттрансплантационный панкреатит — распространенное заболевание, которое возникает с частотой от 17 до 88% и носит ишемически-реперфузионный характер. Мониторинг кровотока в тканях поджелу-
дочной железы позволяет оценивать роль изменений кровоснабжения в развитии патологии этого органа, в том числе изучать возможности медикаментозной и хирургической коррекции.
С развитием методов лазерной доппле-ровской флоуметрии, капилляроскопии, ин-травиальной микроскопии, оптической когерентной томографии, магнитно-резонансной томографии, радиоизотопной артериографии и др. появилась возможность проводить прижизненные исследования состояния микроциркуляции в динамике [4].
Некоторые из этих методов имеют ряд ограничений, таких как недостаточное пространственное и временное разрешение,
недостаточное количество информации о потоке частиц при сканировании по глубине, степень инвазивности измерений и др. В настоящее время к наиболее эффективным методам определения основных параметров микр оциркуляции относятся методы динамического рассеяния света — лазерная допплеровская флоуметрия и спекл-визуализация [1; 2; 3].
Материалы и методы
Работа выполнена на 9 белых крысах линии "^81аг массой тела 200—250 г. Все манипуляции на животных проведены в строгом соответствии с «Правилами проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации» (утв. МЗ РФ и введены в действие с 1 января 1999 г.), приложением 3 к приказу МЗ СССР от 10.08.1977 г. № 755, положениями Хельсинкской декларации (2000) и рекомендациями, содержащимися в Директивах Европейского сообщества (№ 86/609ЕС).
Животные были разделены на 3 группы по 3 особи обоих полов в каждой группе. Для мониторинга состояния микроциркуляции в поджелудочной железе был сконструирован специальный столик, на котором располагался исследуемый орган. Данное приспособление исключало физиологическое движение органов, вызванное, например, дыханием, и позволяло провести прямые микроскопические изменения скорости эритроцитов.
В первой группе животных исследования проводили после 5 минут блокады кровотока (локальной ишемии), вторую группу животных исследовали после ишемии длительностью 10 минут, для третьей группы длительность ишемии составляла 15 минут. Повторные исследования кровотока у подопытных животных были проведены на 7-е сутки. Измерения контраста спекл-картин и микроскопические исследования скорости кровотока проводили в нормальном состоянии, во время ишемии и при реперфузии.
Микроскопические исследования, проведенные в данной работе, позволили визуализировать капиллярный кровоток и получить значения усредненной скорости эритроцитов на участке капилляра. Однако исполь-
зование капилляроскопа сопряжено с определенными трудностями: во-первых, невозможно проводить измерения в режиме реального времени; во-вторых, для подготовки установки к эксперименту требуется достаточно большое время для точной настройки на отдельный капилляр. В связи с этим применение микроскопических исследований (например, в неотложной хирургии) затруднено. Для мгновенных измерений скорости кровотока и мониторинга изменений в режиме реального времени был использован метод спекл-визуализации.
Для получения параметров кровотока были проведены спекл-визуализация полного поля [2] и микроскопические исследования микроциркуляции поджелудочной железы. В области пережатия были локализованы отдельные капиллярные сосуды, для которых путем анализа записанных видеомикроизображений была определена скорость кровотока. Для микроскопических исследований применяли зеленую подсветку (центральная длина волны — ~517 нм), чтобы за счет высокого поглощения крови в этой спектральной области повысить контраст изображений.
Метод спекл-визуализации полного поля на основе анализа контраста усредненных по времени спекл-модулированных изображений был успешно применен в лабораторных и клинических условиях для исследований микроциркуляции крови в областях ожоговых поражений кожи [2] и в коре головного мозга лабораторных животных при воздействии лекарственных препаратов [3] и др.
Спекл-коррелометрический мониторинг вариаций микрогемодинамики в поджелудочной железе крысы проводили с помощью лабораторного образца спекл-коррелометрического капилляроскопа полного поля [1] . Данная установка позволяла проводить регистрацию изображений одного и того же участка образца как в когерентном свете ( освещение лазером) , так и при некогерентном освещении (светодиоды) без механической перенастройки. В связи с тем, что объектом исследований был кровоток, для спекл-визуализации применяли одномо-довый гелий-неоновый лазер ГН-5П с дли-
Возможности мониторинга кровотока в тканях поджелудочной железы методом лазерной спекл-визуализации в норме и при реперфузии
ной волны 633 нм, на которой наблюдается существенное рассеяние зондируемого излучения эритроцитами. Для микроскопических исследований применяли зеленое освещение (центральная длина волны — ~517 нм), что обусловлено высоким поглощением крови в данной спектральной области. Это приводит к увеличению контрастности изображений. Лазерный пучок расширяли до необходимого сечения с помощью микрообъектива M1 (ЛОМО, 8х), диафрагмы P (10 мкм) и кол-лимирующего зеркала C и направляли на исследуемый объект S. Спекл-модулированные изображения поверхности анализируемого участка регистрировали монохромной КМОП-камерой (типа Basler a602f, число пикселей в матрице 656x491, размер пикселя 9,9x9,9 мкм; 8 бит/пиксель), оснащен -ной объективом ЛОМО (кратность увеличения - 10х).
Если рассеяние происходит на ансамбле частиц (взвеси, суспензии и т.п.), то контраст зависит и от оптических свойств базового вещества, частиц, их формы, размеров и характера агрегации. При этом также следует учитывать эффекты многократного рассеяния и конечность длины когерентности лазерного излучения. Таким образом, теоретический учет всех параметров, влияющих на измеряемые значения контраста, представляется крайне сложной либо неразрешимой задачей. В связи с данным фактом была рассмотрена возможность применения калибровки с использованием фантома с устойчивыми оптическими параметрами и определения оптических параметров исследуемых биообъектов.
Исследование на фантоме
Фантом, использованный для моделирования микроциркуляции, имел следующую структуру: базовое вещество — эпоксидная смола с рассеивающей композицией в виде наночастиц TiO2; верхний слой каналов с диаметром 180—200 мкм располагался на глубине 230—250 мкм; на глубине 2 мм находились дополнительные каналы, моделировавшие сосуды более глубоких слоев биоткани. Цифровая камера регистрировала изображения одного из каналов в верхнем слое. Кровоток моделировали пропусканием
по каналам фантома взвеси частиц красного пигмента. Размер частиц был выбран в интервале от 7 до 10 мкм, что соответствует физиологическому размеру красных кровяных телец — эритроцитов. Скорость потока регулировали с использованием дозатора лекарственных веществ MLW Ыпеоша! (Германия).
Одним из самых важных параметров при исследованиях контраста является время регистрации спекл-картины — экспозиция. Несмотря на то что существует возможность (в известных пределах) программного управления экспозицией используемой камеры, в реальном эксперименте имеются ограничения, не позволяющие выбирать любое доступное значение. Так, в связи с разными у различных образцов коэффициентами поглощения и рассеяния, характеристиками внутренней динамики (или в случае их временных либо пространственных вариаций у одного образца) при неизменной интенсивности падающего излучения наблюдаются существенные различия в статистике регистрируемого распределения интенсивности, а следовательно, и рассчитываемом на его основе контрасте.
Автоматизированный алгоритм настройки параметров цифровой камеры, который был разработан и включен в состав используемой программы анализа контраста, позволил в некоторых пределах компенсировать указанные различия путем оптимального подбора усиления и яркости при фиксированной экспозиции. Тем не менее в случае недостаточного времени накопления или слишком большого количества света, падающего на детектор камеры за время экспозиции, статистика интенсивности регистрируемого изображения искажается вследствие большого темнового шума или «перегрузки» светочувствительных элементов детектора.
Другим важным моментом была необходимость определить применимость метода анализа контраста для мониторинга динамики реального кровотока микрокапиллярной сети. Взяв за основу полученные ранее в микроскопических исследованиях значения скорости микроциркуляции, а также данные других авторов, мы провели исследо-
вания зависимости контраста, рассчитанного методом вЬАБСА, от скорости движения частиц. В качестве объекта использовали тот же фантом, по каналам которого пропускали взвесь частиц красного красителя с объемной концентрацией около 1% и размером частиц 7—10 мкм. Скорость движения потока частиц регулировали с использованием дозатора и устанавливали в пределах 0—8 мм/с, чтобы покрыть все возможные физиологические значения скорости кровотока.
Измерения контраста проводили при экспозициях камеры 5 и 10 мс — минимальных значениях, при которых отсутствовали заметные искажения статистики регистрируемой интенсивности из-за недостаточности падающего на детектор излучения, рассеянного образцом.
Результаты измерений подтвердили факт большей чувствительности метода при меньших экспозициях, а также показали наибольшую зависимость контраста от скорости в пределах до 0,25 мм/с, т.е. именно от реальных скоростей микроциркуляции. Предварительные измерения показали
также, что объемная концентрация частиц в области единиц процента заметно не влияет на область наибольшей чувствительности. Однако требуются дальнейшие исследования для больших концентраций частиц вплоть до физиологических значений гематокрита.
Результаты исследований на животных
В табл. 1 собраны данные по изменению скорости эритроцитов и относительным изменениям контраста спекл ов в первой группе исследуемых животных (длительность ишемии — 5 минут). В результате возобновления кровотока после локальной ишемии происходило резкое увеличение скорости эритроцитов. В табл. 2 представлены результаты изменения скорости кровотока при повторном исследовании сосудов для единственного животного, пережившего 7 суток наблюдения.
В табл. 3 приведены данные исследования скорости кровотока для второй группы животных в 1-е сутки эксперимента, а в табл. 4 — такие же данные через 7 суток
Значения усредненного по времени контраста спеклов и скорости эритроцитов в зависимости от функционального состояния диагностируемого органа (1-я группа, 1-е сутки)
№ Скорость, мкм/с Нормальное состояние, контраст, <У> Ишемия, мкм/с Ишемия, контраст, <У> Реперфузия, мкм/с Реперфузия, контраст, <У>
1 90 0,37 О 0 0,45 180 0,2
2 115 0,34 О 0 0,43 290 0,17
3 92 0,37 О 0 0,45 275 0,17
Значения усредненного по времени контраста спеклов и скорости эритроцитов в зависимости от функционального состояния диагностируемого органа (1-я группа, 7-е сутки)
Порядок эксперимента Без воздействия, мкм/с Без воздействия, контраст, <У> Ишемия, мкм/с Ишемия, контраст, <У> Реперфузия, мкм/с Реперфузия, контраст, <У>
Первичный эксперимент, лабораторное животное № 2 115 0,34 О 0 0,43 290 0,17
Повторный эксперимент, спустя 7 дней 387 0,15 О 0 0,44 690 0,14
Значения усредненного по времени контраста спеклов и скорости эритроцитов в зависимости от функционального состояния диагностируемого органа (2-я группа, 1-е сутки)
№ Нормальное состояние, скорость, мкм/с Нормальное состояние, контраст, <У> Ишемия, мкм/с Ишемия, контраст, <У> Реперфузия, мкм/с Реперфузия контраст, <У>
1 276 0,26 О 0 0,38 278 0,19
2 114 0,32 О 0 0,44 297 0,18
3 230 0,25 О 0 0,45 321 0,17
Возможности мониторинга кровотока в тканях поджелудочной железы методом лазерной спекл-визуализации в норме и при реперфузии
Значения усредненного по времени контраста спеклов и скорости эритроцитов в зависимости от функционального состояния диагностируемого органа (2-я группа, 7-е сутки)
Порядок эксперимента Без воздействия, мкм/с Без воздействия, контраст, <V> Ишемия, мкм/с Ишемия, контраст, <V> Реперфузия, мкм/с Реперфузия, контраст, <V>
Повторный эксперимент, лабораторное животное № 1 400 0,15 О 0 0,42 500 0,14
Повторный эксперимент, спустя 7 дней 354 0,15 О 0 0,44 570 0,14
Значения усредненного по времени контраста спеклов и скорости эритроцитов в зависимости от функционального состояния диагностируемого органа (3-я группа, 1-е сутки)
№ Нормальное состояние, скорость, мкм/с Нормальное состояние, контраст, <V> Ишемия, мкм/с Ишемия, контраст, <V> Реперфузия, мкм/с Реперфузия, контраст, <V>
1 150 0,29 О 0 0,39 178 0,27
2 119 0,31 О 0 0,41 117 0,31
3 130 0,3 О 0 0,45 181 0,27
эксперимента для двух лабораторных животных, доживших до этого срока.
Данные по третьей группе собраны в табл. 5. Не наблюдалось ярко выраженного увеличения скорости кровотока при репер-фузии, что, возможно, было связано с сильными структурными изменениями при длительной ишемии.
Одним из возможных перспективных направлений применения данного метода в клинической практике является мониторинг микрогемодинамики органов брюшной полости при острых панкреатитах в целях коррекции тактики лечения.
Литература
1. Виленский М.А., Агафонов Д.Н., Зимня-ков Д.А. и др. Спекл-корреляционный анализ микроциркуляции ногтевого ложа // Квантовая электроника. 2011. № 41(4). С. 324-328.
2. Briers J.D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging // Physiological Measurement. 2001. Vol. 22. P. 35-66.
3. Dunn A.K., Bolay H., Moskowitz M.A., Boas D.A. Impact of velocity distribution assumption on simplified laser speckle imaging equation // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2001. Vol. 21. P. 195-201.
4. Schvartzman P.R., White R.D. Textbook of Cardiovascular Medicine. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2002.
Контакты:
Александров Денис Анатольевич, Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского;
профессор кафедры хирургии и онкологии ФПК и ППС, доктор медицинских наук. Тел.: 8-987-823-06-09. E-mail: denirov@bk.ru
