CC BY
43
2. Алексеев И.Б. Годность к вождению автотранспорта лиц после кератотомии. Автореф. дис...к.м.н.— М., 1994.- 20 с.
3. Горячкина Т.Г., Евдокимов В.И. //Медицина труда и про-мышл. экол.- 2006.- №8.- С.35-37
4. Матвеев В.И., Шелепин Ю.Е. // Офтальмоэргономика: итоги и перспективы: Тез. докл. межд. симпоз. М., 1991.- С.4
5. Розенблюм Ю.З. и др. Офтальмологическое обследование
водителей автотранспорта: Метод. рекоменд. МНИИ глазных
болезней им. Гельмгольца. М., 1989.- 10с.
6. АС РФ № 2269921. Устройство для определения остроты
зрения. / Тлупова Т.Г. и др. Приор. от 17.05.2004. Опубл.
20.02.2006. Бюл. № 5
7. Kosnik W.D., Seculer R., Kline D.W. // Hum. Factors.-1990.- Vol.35.-№ 5.-Р.597-608
8. Lippmann O. // Probl. Industr. Med. Ophthal. Stuttgart , 1987.- Vol.10.- Р.183-183
9. Mackie S., Welb L., Hutchison B. et al. // Eye.- 1995.- № 9.-Р.517-525
10. Mekuria Z.Z., Gurdulic-Sverko A., Klescic D. // Coviek i promet. ,1988.- Vol.14.-Р.233-233
11. SachenwegerM. // Folia Ophthalmol., 1987.- B. 12, №. 2.-S.127-127
12. Secular R., Kline D., Dismukes K. // Aviat. Space and Environ. Med.,1982.- Vol. 53.- № 8.- Р.747-752.
УДК 617.711-004.1
ВОЗМОЖНОСТИ ИНСТРУМЕНТА ДЛЯ ДОЗИРОВАННОГО ЗАБОРА КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА КОНЪЮНКТИВЫ «ГЛАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ» И КОМПЬЮТЕРНОЙ МОРФОМЕТРИИ МИКРОИЗОБРАЖЕНИЙ КОНЪЮНКТИВЫ В ПОВЫШЕНИИ ТОЧНОСТИ СПОСОБА ИМ-ПРЕССИОННОЙ ЦИТОЛОГИИ И ОПТИМИЗАЦИИ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА «СУХОГО ГЛАЗА»
С.В. ЯНЧЕНКО, А.И. ЕРЁМЕНКО, А.А. ЕВГЛЕВСКИЙ*
В течение последнего десятилетия предложены разные способы диагностики синдрома «сухого глаза» (ССГ), однако, по свидетельству отечественных и зарубежных авторов, данная проблема всё ещё далека от своего оптимального решения [1-6]. При начальных формах ССГ, специфичные для данного заболевания жалобы на «сухость» отсутствуют. Субъективные проявления ССГ, зачастую могут быть представлены «слезотечением» (или «ощущением слезотечения»), «чувством песка», ощущением «инородного тела», что затрудняет раннюю диагностику заболевания и своевременное назначение адекватной терапии. Постановка диагноза достаточно сложна, и основывается на выявлении «микропризнаков» заболевания [1], что требует от офтальмолога определённой подготовки, а в плане расходных материалов, необходимости использования так называемых витальных красителей (лиссаминовый зелёный, бенгальский розовый), являющихся в настоящее время мало доступными [2]. Медико-социальное значение выявления ранних форм ССГ заключается в том, что лица, имеющие его проявления, образуют группу риска клинической манифестации ССГ тяжёлой степени (с наличием нитчатого кератита, рецидивирующих эрозий эпителия роговицы) [2].
Одним из направлений верификации морфологических изменений тканей «глазной поверхности» при синдроме «сухого глаза» (ССГ) является способ импрессионной цитологии конъюнктивы с использованием целлюлозно-ацетатных фильтров «МПНроге» [6]. В различных модификациях способа импрессион-ной цитологии, фильтровальную бумагу прижимают к конъюнктиве «глазной поверхности» стеклянной палочкой или поверхностью «головки» тонометра Гольдмана, при этом, авторы описывают оказываемое на ткани давление различными субъективными терминами, характеризуя его как «нежное прижатие» или «лёгкое давление» [5,6]. Недостатком данного подхода является недостаточная дозированность забора клеточного материала, из-за отсутствия объективных показателей необходимого усилия компрессии (прижатия) фильтровальной бумаги к конъюнктиве «глазной поверхности», что может быть причиной недостаточной воспроизводимости результатов исследования. Кроме этого, при указанном подходе взятия клеточного материала требуется последовательное трёхэтапное использование двух инструментов: пинцета для помещения целлюлозно-ацетатного фильтра на поверхность
* Кубанский ГМУ, каф. глазных болезней, Краснодарский край, гор. Краснодар 350 000, ул. Седина, 4
конъюнктивы, «головки» тонометра Гольдмана для прижатия фильтра к слизистой, пинцета для удаления фильтра с поверхности конъюнктивы. Указанная особенность, с одной стороны, может снижать воспроизводимость результатов исследования, а с другой, не исключает ятрогенное повреждение конъюнктивы «глазной поверхности» браншами пинцета при попытке захвата края целлюлозно-ацетатного фильтра плотно прижатого к поверхности слизистой оболочки. После забора материала, отпечатки эпителиальных клеток фиксируются и окрашиваются, либо непосредственно на фильтровальной бумаге либо после перенесения отпечатка на предметное стекло проводятся варианты визуального морфометрического анализа [6]. Визуальный морфометрический анализ основан на субъективном описательном или полуколичественном учете различных градаций патоморфологических признаков (в баллах), при этом, морфологические изменения в тканях могут быть оценены не однозначно, что, в свою очередь, может снижать точность диагностики ССГ [4].
Цель работы - повышение точности способа импрессион-ной цитологии в диагностике ССГ, путём разработки и апробации в условиях клиники инструмента для дозированного забора клеточного материала конъюнктивы «глазной поверхности», а также путём использования способа компьютерной морфометрии микроизображений конъюнктивы.
Материалы и методы. Разработанный нами инструмент для дозированного взятия клеточного материала, имеет корпус в форме полого цилиндра глухо закрытого с торца; пружину, ориентированную вдоль оси цилиндра, закреплённую перед торцом на фиксаторе, причём пружина откалибрована на её сжатие при усилии 15 г; с рабочего конца корпус имеет шток с упорной втулкой-ограничителем движения штока, опирающийся на пружину; на конце штока расположен сменный стерилизуемый наконечник с резьбой, на внешней стороне наконечника при помощи сменного кольца зафиксирован целлюлозно-ацетатный фильтр.
Техническим результатом использования этого инструмента является обеспечение адекватных условий получения клеточного материала с конъюнктивы «глазной поверхности», что позволяет объективизировать диагностику, просто и оперативно провести в динамике контроль за результатами лечения. Устройство легко стерилизуется, конструктивно удобно в использовании, так как дозированное усилие в 15 г при переносе фильтра на конъюнктиву осуществляется просто однократным прикосновением к конъюнктиве «глазной поверхности» в течение 5 с. Использование этого инструмента позволяет сделать процедуру забора клеточного материала конъюнктивы безопасной, т.к. исключена возможность травматизации конъюнктивы при извлечении целлюлозно-ацетатного фильтра браншами пинцета, что не исключено при традиционной манипуляции.
Инструмент для дозированного взятия клеточного материала с конъюнктивы «глазной поверхности» используют следующим образом. Забор клеточного материала проводят после однократной инстилляции в конъюнктивальную полость 0,4% раствора оксибупрокаина («Инокаин»). Веки исследуемого глаза фиксируют пальцами левой руки врача-исследователя. Корпус инструмента удерживается тремя пальцами правой руки исследователя (большим, указательным и средним), безымянный палец и мизинец правой руки врача фиксируют на окологлазничной области пациента. Предварительно на внешней поверхности сменного стерилизуемого наконечника инструмента, при помощи сменного стерилизуемого кольца, фиксируют стерильную полоску целлюлозно-ацетатного фильтра марки НАТН, размером 10х8 мм (корпорации МИНроге). Полоску стерильной фильтровальной бумаги, закреплённую на сменном наконечнике инструмента, прижимают к конъюнктиве «глазной поверхности». При этом, шток, за счёт сжатия пружины, полностью погружается в корпус инструмента. Полный ход штока обеспечивает приложение к конъюнктиве глазной поверхности усилия равного 15 г. Нужное время прижатия целлюлозно-ацетатного фильтра к конъюнктиве «глазной поверхности» - 5 с. После 5-секундной дозированной компрессии фильтровальную бумагу извлекают с поверхности конъюнктивы вместе с инструментом. В глаз пациента инсталлируют капли антибиотика (ципрофлоксацин 0,3%). После этого клетки конъюнктивы переносят с полоски фильтровальной бумаги на обезжиренное предметное стекло. Для этого врач-исследователь удерживает корпус инструмента в правой руке, целлюлозно-ацетатный фильтр прижимают к поверхности предметного стекла. Шток инструмента за счёт сжатия пружины пол-
ностью погружают в корпус инструмента до достижения усилия в 15 г. Нужное время контакта фильтровальной бумаги и предметного стекла - 5 с. Клетки конъюнктивы, перенесенные на предметное стекло, сушат на воздухе 30-40 мин. и подвергают фиксации, окрашиванию и патоморфологическому исследованию.
Инструмент апробирован в условиях клиники. Для сравнительной оценки воспроизводимости результатов забора клеточного материала конъюнктивы «глазной поверхности» (точности способов забора материала) было проведено взятие 7 проб по [6], а также 7 проб с использованием разработанного инструмента. Взятие проб проводили у одного человека-добровольца в возрасте 55 лет без признаков глазной патологии. Взятие всех образцов эпителия конъюнктивы у одного и того же человека, обусловлено необходимостью обеспечить единообразие проб изучаемой ткани. В основную группу вошли 7 отпечатков эпителия конъюнктивы, полученных с использованием разработанного инструмента; контрольную группу составили 7 отпечатков эпителия конъюнктивы, полученные без использования указанного инструмента. В каждом отпечатке, окрашенном по Май-Грюнвальду, подсчитывали по 5 полей зрения и рассчитывали среднее количество эпителиоцитов в расчёте на одно поле зрения для данного образца. Основным критерием в оценке воспроизводимости результатов, и был коэффициент вариации (CV). Полученные результаты подвергали обработке методами вариационной статистики.
Для оптимизации морфологического анализа микроизображений конъюнктивы нами был использован способ компьютерной морфометрии. При этом, отпечатки конъюнктивы, полученные с помощью инструмента для дозированного забора клеточного материала, и окрашенные по Май-Грюнвальду фотографировали с помощью цифровой микрофотоустановки, собранной на кафедре гистологии КГМУ. Изображения с увеличением 400х, «захватывались» ПЗС-матрицей и передавались в персональный компьютер, где оцифровывались и сохранялись в графическом файле формата РСХ при разрешении 640x480 пикселей в режиме wepaH шкала» (при 16 градациях этой шкалы). Компьютерные изображения эпителия конъюнктивы подвергали анализу с помощью программы «М-SCAN», разработанной на кафедре гистологии КГМУ. Анализу подвергали участок изображения, размером 480x480 пикселей, соответствующий 75% всего изображения. Методом компьютерной мор-фометрии измеряли уровень структурно-информационной энтропии микроскопических изображений эпителия конъюнктивы, что позволяло судить об уровне структурной дезорганизации ткани конъюнктивы. Показатель энтропии эпителия конъюнктивы при отсутствии глазной патологии соответствовал 1,3±0,002 усл ед. При значениях интегрального показателя энтропии выше этой границы ставили диагноз ССГ.
Для сравнительной оценки точности компьютерной мор-фометрии и классического (визуально-описательного) морфологического анализа в исследование включено 10 лиц (20 глаз) с подтверждённым диагнозом - ССГ лёгкой степени тяжести (в соответствии с клинической классификацией [1]. Все длительное время предъявляли жалобы на наличие слезотечения (при проходимости слёзных путей). Тесты на наличие бактериальной флоры, вирус простого герпеса типа-1 и типа-2, хламидии были отрицательными. Диагноз ССГ лёгкой степени тяжести в форме «мони-торного синдрома» был установлен впервые, на основании микропризнаков заболевания (увеличение высоты слёзного мениска при его прицельной биомикроскопии с использованием флюо-ресцина; выявление дегенеративно изменённых клеток в пределах экспонируемой глазной щели при окрашивании витальным красителем - «лиссаминовым зелёным»), а также на основании функциональных тестов слёзопродукции (гиперлакримия при постановке теста по Ширмеру-1; уменьшение времени разрыва слёзной плёнки при постановке пробы Норна до 6,1±0,9 с).
Классический морфологический анализ проводили исходя из критериев Nelson J.D. [6]. Использовалась балльная оценка изменений в эпителиальной ткани конъюнктивы, с градацией выраженности признаков от 0 до 3 баллов. Образцы с наличием маленьких округлых эпителиальных клеток конъюнктивы, и наличием большого количества бокаловидных клеток в эпителиальном пласте получали оценку - «0»; образцы с большими полигональными клетками эпителия конъюнктивы с маленькими ядрами, и незначительным количеством бокаловидных клеток в
эпителиальном пласте - оценку - «3». Образцы с оценкой <2 (0; 1) классифицировались как норма. Основанием для постановки морфологического диагноза ССГ служили оценки от 2 до 3.
В 1-группу (основную) вошли 10 пациентов (20 глаз) с диагнозом ССГ, которым для подтверждения клинического диагноза проводилась компьютерная морфометрия отпечатков эпителиальных клеток конъюнктивы с расчётом интегрального коэффициента энтропии ткани. Во 2-ю группу (контроль) вошли те же 10 пациентов (20 глаз) с подтверждённым диагнозом ССГ, которым проводился классический (описательный) морфологический анализ тех же препаратов эпителиальных клеток конъюнктивы «глазной поверхности». Основным критерием точности способов оценки морфологического статуса изучаемой ткани, было совпадение клинического и морфологического диагнозов. Все результаты подвергали обработке методами вариационной статистики.
Результаты. Сравнительная оценка воспроизводимости результатов забора клеточного материала с использованием разработанного инструмента и без его использования по [6] представлены в табл. При использовании инструмента для дозированного забора клеточного материала конъюнктивы вариабельность результатов снижается в 7,8 раз, что говорит о росте воспроизводимости результатов забора и точности способа диагностики.
Таблица
Оценка воспроизводимости результатов забора клеточного материала
Способ забора клеточного материала Ср. число эпителиоцитов в образцах конъюнктивы в расчёте на одно поле зрения микроскопа МББ-1 при общем 400х
Обр. 1 Обр.2 Обр.3 Обр. 4 Обр. 5 Обр.6 Обр. 7
Осн. группа 20 19 19 20 20 20 18
Контроль 11 13 18 19 12 20 26
Итоги статобработки для образцов осн. группы: 19,43±0,30. CV=4,05%.
Контроль: 17±2,02. CV=31,49%
Сравнительная оценка точности компьютерной мор-фометрии и классического (визуально-описательного) морфологического анализа. В 1-й (основной) группе (компьютерная морфометрия) совпадение клинического и морфологического диагнозов ССГ зафиксировано в 100% наблюдений (20 глаз), показатель энтропии эпителия конъюнктивы составил 2,1+0,009 усл.ед, что на 62% превышало значение, характерное для здоровых лиц (P<0,001). Во 2-й (контрольной) группе совпадение клинического и морфологического диагнозов ССГ было отмечено лишь в 65% (13 глаз). Эти изменения были достоверными (р<0,01). Учитывая приведенные выше данные, использование компьютерной морфометрии для объективной оценки результатов способа импрессионной цитологии конъюнктивы, позволяет повысить точность выявления ранних форм ССГ в 1,5 раза.
Заключение. Разработанный инструмент позволяет обеспечить единообразный уровень механического воздействия на слизистую оболочку глазного яблока и повысить точность способа импрессионной цитологии в 7,8 раз. Использование инструмента позволяет упростить технику манипуляции и сделать её более безопасной. Компьютерная морфометрия микроизображений конъюнктивы с расчётом показателя энтропии изучаемой ткани позволяет объективизировать морфологический анализ и повысить точность способа импрессионной цитологии в диагностике ССГ в 1,5 раза. Использование инструмента для дозированного забора клеточного материала конъюнктивы и применение компьютерной морфометрии микроизображений оптимизирует диагностику синдрома «сухого глаза» за счёт повышения в 9,3 раз точности способа импрессионной цитологии.
Литература
1. Бржесский В.В. и др. Роговично-конъюнктивальный ксероз.- 2-е изд.- СПб, 2003.
2. Ерёменко А.И. и др. // Сб. науч.тр. VI Всерос.школы офтальмол.- М, 2007.- С. 330-337.
3. Майчук Д.Ю. // Окулист.- 2007.- №2 (86).- С. 18-19.
4. The Research Subcommittee of IDEWS // Ocul. Surf-2007.- Vol. 5, №2.- P. 93-107. "
5. Murube J. // Eur. J. Ophthalmol., 2003.- Vol 13; №2.-Р. 115-127.
6. Singh R. et al. // Br J Of Ophthalmol.- 2005.- Vol. 89; №7.- Р. 1655-1659.
