Научная статья на тему 'ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА MLVA ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ НА ПРИМЕРЕ ИЗОЛЯТОВ C.DIFFICILE'

ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА MLVA ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ НА ПРИМЕРЕ ИЗОЛЯТОВ C.DIFFICILE Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
10
3
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ПАТОГЕННЫ / КЛОСТРИДИОЗЫ / ДНК / ГЕНОТИПИРОВАНИЕ / ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ЭЛЕМЕНТЫ / PATHOGENS / CLOSTRIDIOSIS / DNA / GENOTYPING / REPEAT ELEMENTS

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Шахбиев И.Х., Новикова О.Б., Терлецкий В.П.

Клостридиозы являются серьезными заболеваниями у людей и животных. Часто заболевание возникает и прогрессирует при назначении больным антибиотиков, которые убивают другие виды микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, убирают защитный барьер, препятствующий развитию клостридий. Этот патоген относят к внутрибольничным инфекциям, поэтому генотипирование его изолятов является важной задачей профилактической медицины. В статье изложены данные по использованию генотипирования, основанного на ПЦР-амплификации повторяющихся элементов в геноме C.difficile.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Шахбиев И.Х., Новикова О.Б., Терлецкий В.П.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

POTENTIAL AND LIMITATIONS OF MLVA METHOD FOR BACTERIAL STRAIN IDENTIFICATION ON A SET OF C. DIFFICLE STRAINS

Resume. Clostridiosis is a serious disease in human and animals.Often the disease occurs and develops at administration of antibiotics, which suppress other microorganism species in intestine, thus, removes protective barrier preventing clostridia propagation. This pathogen is assigned to nosocomial infection, that is why genotyping their isolates is an important task in preventive healthcare. Data on use of genotyping based on PCR amplification of repeat elements in C. difficile genome is presented in this article.

Текст научной работы на тему «ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА MLVA ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ НА ПРИМЕРЕ ИЗОЛЯТОВ C.DIFFICILE»

УДК 579.62: 579.253.4

Шахбиев И.Х. соискатель ученой степени Чеченский государственный университет

Россия, г. Грозный Новикова О.Б., к.вет.н. зав. отделом микробиологии ВНИВИП-филиал ВНИТИП РАН Россия, г. Санкт-Петербург-Ломоносов Терлецкий В.П., доктор биол. наук профессор кафедры ГАОУВОЛО «ЛГУим. А.С. Пушкина» Россия, г. Санкт-Петербург ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА MLVA ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ НА ПРИМЕРЕ

ИЗОЛЯТОВ C.DIFFICILE Аннотация. Клостридиозы являются серьезными заболеваниями у людей и животных. Часто заболевание возникает и прогрессирует при назначении больным антибиотиков, которые убивают другие виды микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, убирают защитный барьер, препятствующий развитию клостридий. Этот патоген относят к внутрибольничным инфекциям, поэтому генотипирование его изолятов является важной задачей профилактической медицины. В статье изложены данные по использованию генотипирования, основанного на ПЦР-амплификации повторяющихся элементов в геноме C.difficile.

Ключевые слова: патогенны, клостридиозы, ДНК, генотипирование, повторяющиеся элементы.

Shakhbiev I.Kh.

PhD student Chechen State University Russia, Grozhy Novikova O.B., PhD in veterinary medicine

Head of Dept.

ARRVIPS-Branch of FSBSI ARRTPI Russia, Saint Petersburg-Lomonosov Terletskiy V.P., D.Sc.

Dept. Prof.

Pushkin Leningrad State University Russia, Saint Petersburg

POTENTIAL AND LIMITATIONS OF MLVA METHOD FOR BACTERIAL STRAIN IDENTIFICATION ON A SET OF C. DIFFICLE

STRAINS

Resume. Clostridiosis is a serious disease in human and animals.Often the disease occurs and develops at administration of antibiotics, which suppress other microorganism species in intestine, thus, removes protective barrier preventing clostridia propagation. This pathogen is assigned to nosocomial infection, that is why genotyping their isolates is an important task in preventive healthcare. Data on use of genotyping based on PCR amplification of repeat elements in C. difficile genome is presented in this article.

Key words: pathogens, clostridiosis, DNA, genotyping, repeat elements.

Одним из распространенных видов микроорганизмов, обитающих в желудочно-кишечном тракте человека и животных и имеющих большое значение с медицинской точки зрения, является Грам-положительная бактерия Clostridium difficile [1]. C.difficile обнаруживается в микрофлоре кишечника у 80% здоровых детей в возрасте до 1 года и у 1-5% здоровых взрослых. В то же время, у госпитализированных взрослых носительство может достигать 20-40%. Данная бактерия впервые признана возбудителем колита у людей в 1978 году [5]. С тех пор ее значение как патогенного микроорганизма существенно возросло. Было показано, что бактерия развивается после назначения пациентам антибиотиков, которые угнетают конкурентные виды микробов и при этом не оказывают негативного влияния на C. difficile [2; 4]. В последние годы отмечается не только повышение частоты внутрибольничной инфекции, вызванной C. difficile, но и ее летальность [4]. В этой связи проблеме клостридиоза уделяют большое внимание, в частности, интерес представляет генетическая вариабельность штаммов.

Несмотря на значительное число публикаций по эпидемиологии C.difficile, остается спорным вопрос об эндо- и экзогенном характере инфекции и путях передачи возбудителя. Внутрибольничные случаи заболевания могут носить как спорадический, так и эпидемический характер. Эпидемическое распространение получают лишь отдельные штаммы, например риботип 1 и риботип 027, производящими в 20 раз больше токсинов А и В, чем другие патогенные штаммы. Кроме того, отмеченные штаммы устойчивы ко многим широко используемым антибиотикам.

Эффективный контроль над вспышками заболевания возможен при быстрой идентификации изолятов, позволяющей дифференцировать эпидемические и спорадические штаммы. В отношении C.difficile разработаны и используются несколько методов генотипирования. Наиболее распространенным сейчас в Европе является метод риботипирования, основанный на вариабельности интергенного участка между 16S и 23S генами рибосомной ДНК. В США предпочтение отдают методу пульс-гель электорофореза. Используется также метод выявления вариаций тандемных

повторов ДНК (MLVA) и секвенирование генов «домашнего хозяйства» (MLST). К сожалению, эти методы не лишены недостатков. В частности, риботипирование часто не различает эпидемиологически не родственные изоляты, т.е. обладает недостаточной дискриминационной способностью. Пульс-гель электрофорез проводится в течение длительного времени и требует значительных материальных и людских затрат. Секвенирование (MLST) является дорогостоящей процедурой и иногда не позволяет добиться необходимого уровня дискриминации штаммов.

Способом выявления изменений в геномах микроорганизмов является генотипирование, которое приобрело большое значение в системе профилактики инфекционных заболеваний, так как позволяет установить источники инфекции и выявить пути ее распространения [3; 6]. В США референтные лаборатории часто применяют при генотипировании метод пульс-гель электрофореза (ПГЭ). В Европе более популярным является риботипирование изолятов, основанное на вариабельности участка между 16S и 23 S генами рибосомной ДНК, выявляемой ПЦР. Помимо этих двух методов генотипирования используются и другие, например, метод выявления вариаций тандемных повторов ДНК (MLVA) и секвенирование по семи генам «домашнего хозяйства» (MLST). К сожалению, указанные методы не лишены недостатков. ПГЭ является длительной и трудоемкой процедурой и чувствительной к наличию эндонуклеаз, что снижает типируемость. Секвенирование (MLST) иногда не позволяет добиться необходимого уровня в дискриминации штаммов.

Материалом исследования служила геномная ДНК, выделенная от 25 культур госпитальных изолятов C. difficile. Ночную культуру микроорганизма в объеме 1 мл, выращенную в анаэробных условиях в контейнере, центрифугировали в течение 5 минут при 8000 g. Осадок бактериальных клеток использовали для выделения геномной ДНК стандартным методом с использованием фенольно-хлороформенной экстракции.

Данный анализ проводили на этих же изолятах с использованием подхода, описанного в 2009 году [7]. Использовали следующие праймеры для амплификации полиморфных тандемных повторов: TR6-F 5'-TTTCAACTTGTCCAGTTTTTAAGTC-3' TR6-R 5'-ATGACATAGCGTTTGTGGAAT-3'; TR10-F 5'-TGCATCAAATTGGTCAAGACTC-3' TR10-R 5'-TGAAATCATTGACTATAAAGCAAAA-3'. Условия амплификации соответствовали оригинальной методике [7]. Реакцию проводили с использованием 1 мкл геномной ДНК C. difficile, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0.1 мкМ праймеров, 1х ПЦР буфер, 1 е.а. Hot Start Taq-полимеразы (Invitrogen™). ПЦР включала начальную денатурацию ДНК при 96°C в течение 3 минут, затем проводили 35 циклов: 96°C 45 секунд, 52°C 45 секунд, 72°C 45 секунд. В качестве финального шага использовали инкубацию при 72°C в течение 7

минут. Общий объем смеси составлял 25 мкл, реакция проводилась в стандартных 96-ти луночных планшетах для ПЦР. Продукты реакции разделяли в агарозном геле, окрашивали флуоресцентым красителем GelRed™ (Bio-Rad™), фотографировали в системе гель-документации. В качестве маркера длин фрагментов ДНК использовали GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific™).

Применение метода MLVA с двумя парами праймеров по локусам TR6 и TR10 привело к появлению амплификатов разного размера у отдельных изолятов.

Рис. 1. MLVA-генотипирование группы изолятов C.difficile с помощью ПЦР праймеров для локуса TR6

Однако, как в отдельности, так и в комбинации, вариация размеров касалась лишь небольшого числа изолятов из 25 изученных. В частности, по локусу TR6 выявлено всего 2 генотипа, причем один из них встречался всего у 2-х изолятов - 27760 и 27762 (генотип 1, Рис. 1), а остальные изоляты были идентичными и рассматривались как генотип 2. Локус TR10 был немного информативней (Рис.2). Основным генотипом был генотип 1, выявляемый у 22 изолятов. Кроме того, были выявлены уникальный генотип 2 (изолят 27525) и генотип 3 (изоляты 27526 и 27533).

ГГ) Т М". V© со о

г-1 /^J rvj rf} <■»», rr~, rf,

f, w, w, w, u-, w, •/-, w,

I—I I I I- I I I 1-4

<5 4 N N N N N N «¿5

Рис. 2. MLVA-генотипирование группы изолятов C.difficile с помощью ПЦР праймеров для локуса TR10

Низкий полиморфизм локусов TR и TR10 в нашей группе изолятов не позволяет рекомендовать этот подход для генотипирования изолятов C. difficile. Наши данные не соответствуют выводам по использованию этих локусов, сделанных авторами в ранее опубликованной работе в Германии [7], где индекс дискриминации достигал значения 0,967. Одной из причин такого противоречия может быть большее исходное генетическое разнообразие изолятов в работе немецких ученых, что позволило выявить разницу в длине тандемных повторов у большинства изолятов. В нашей работе, все изоляты имели четкую временную и географическую привязку к одному месту (госпиталь кантона Во, Швейцария) и они могли оказаться генетически близкими друг к другу.

В заключение, метод генотипирования MLVA при использовании двух локусов тандемных повторов TR6 и TR10 имеет ограниченную дискриминационную способность, для повышения которой необходимо в анализ дополнительно включать другие локусы, либо в дополнение использовать другие методы генотипирования.

Работа поддержана грантом РФФИ по заявке № 18-316-00051 мол_а в части проведения генотипирования бактерий и при поддержке Государственного задания ФАНО 599.01.Х30170599-2014-0222 в части анализа полученных результатов

Использованные источники:

1. Лобзин Ю.В., Захаренко С.М., Иванов Г.А. Современные представления об инфекции Clostridium difficile // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. Т. 4. №3. С. 200-232.

2. Малов В.А. Инфекция Clostridium difficile: современное состояние проблемы // Фарматека. 2010. Т. 4. С. 27-31.

3. Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О.Б., Борисенкова А.Н., Белаш Д.Э., Яковлев А.Ф. Эффективный молекулярно-генетический метод

идентификации штаммов сальмонелл и протея // Доклады РАСХН. 2013. № 5. С.60-63.

4. Шоп И.В. Комплексный взгляд на проблему внутрибольничной диареи, вызванной Clostridium difficile и не только // Болезни и антибиотики. 2013. Т. 1. № 8. С. 60-67.

5. Bartlett J.G., Chang T.W., Gurwith M., Gorbach S.L., Onderdonk A.B. Antibiotic-associated pseudomembranous colitis due to toxin-producing Clostridia // N. Engl. J. Med. 1978. V. 298. No 10. P.531-534.

6. Terletskiy V., Kuhn G., Francioli P., Blanc D. Application and evaluation of double digest selective label (DDSL) typing technique for Pseudomonas aeruginosa hospital isolates // Journal of Microbiological Methods. 2008. V. 72 P. 283-287

7. Zaiss N.H., Rupnik M., Kuijper E.J., Harmanus C., Michielsen D., Janssens K. et.al. Typing Clostridium difficile strains based on tandem repeat sequences // BMC Microbiol. 2009. V. 9. P.6.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.