CC BY
44
3-е МЕСТО В КОНКУРСЕ ПО ГЕПАТОЛОГИИ НОГР ЗА 2008 г.
ВОЗМОЖНОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ГЕПАТОПАТИИ И НАРУШЕНИЙ ЖИРОВОГО ОБМЕНА ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 1-го ТИПА
Семенова Е.В.
Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева, Саранск
Семенова Елена Васильевна 430004 Саранск, ул. Грузинская, д. 56/56.
Тел.: 8 (8342) 475 865 E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Целью исследования было изучение возможности фармакологической коррекции морфологических изменений печени и нарушений жирового обмена при сахарном диабете 1-го типа в эксперименте. Для фармакологической коррекции в данном исследовании применяли симвастатин, новое соединение из группы антиоксидантов - производных 3-гидроксипиридина - под шифром ГП-5, а также комбинацию симвастатина и ГП-5. Было установлено, что применение ГП-5 и комбинации ГП-5 с симвастатином более значительно по сравнению с монотерапией симвастатином снижает степень выраженности диабетической гепатопатии по результатам гистологического исследования и препятствует развитию дислипидемии у больных диабетом крыс. Данные изменения сопровождаются также снижением активности свободнорадикального окисления липидов за счет специфического антиоксидантного действия изучаемого производного 3-гидроксипиридина.
Ключевые слова: 3-гидроксипиридин; диабетическая гепатопатия; нарушения жирового обмена SUMMARY
The purpose of the research has been the study of possibilities for the pharmacological correction of the morphological changes in liver and lipid metabolism disorders in experimental type 1 diabetes. Simvastatin, new compound from the group of antioxidants - 3-hydroxipyridine derivate under the code HP-5, and also the combination of simvastatin and HP-5 have been used for the pharmacological correction in this research. It was revealed that the using of HP-5 and the combination of simvastatin and HP-5 attenuate the order of expression of diabetic hepatopathia as the result of the histological study and hinder from the development of dislipidemia in rates with type 1 diabetes which is more expressed in comparison with the monotherapy by simvastatin. These changes also are followed with the diminishing of the free radical lipid oxidation activity by the specific antioxidant effect of the investigated 3-hydroxipyridine derivate.
Key words: 3-hydroxipyridine; diabetic hepatopathia; lipid metabolism disorders
a\
©
В настоящее время большое внимание уделяется исследованию поражений печени при метаболическом синдроме, ассоциированном с сахарным диабетом (СД) 2-го типа, в частности неалкогольному стеатогепатиту. В то же время гепатопатии при СД 1-го типа остаются «в тени» гепатологических изысканий. Однако данная проблема, на наш взгляд, заслуживает пристального внимания.
Инсулинозависимый СД занимает третье место среди тяжелых хронических заболеваний у детей, уступая только бронхиальной астме и детскому церебральному параличу, и распространенность его в ближайшие
десятилетия будет расти. По оценке Международного института диабета (Австралия), к 2010 г. на Земле количество больных СД достигнет цифры 220 млн.
В целом отмечается общность звеньев патогенеза между различными типами СД, но если при диабете 2-го типа имеет место резистентность к инсулину, то есть ткани «не видят» циркулирующий в крови инсулин, то при 1-м типе СД наблюдается его абсолютный дефицит. В результате чего происходит активация липолиза, увеличение концентрации в крови ненасыщенных жирных кислот, активируется перекисное окисление липидов (ПОЛ), что
усугубляет метаболические нарушения и ускоряет развитие осложнений СД. А полифагия, наблюдающаяся при СД 1-го типа, приводит к увеличению поступления всех питательных веществ, в том числе и жиров, что усугубляет метаболические нарушения.
Известно, что печень принимает активное участие во всех видах обмена веществ, в том числе и жировом обмене. В последнее десятилетие активно обсуждается центральная роль печени в генезе дислипидемии и атеросклероза. Поэтому изменения в печени при инсулинозависимом СД, опосредованные нарушением липидного обмена, могут иметь первостепенное значение в развитии и прогрессировании осложнений диабета.
Избыточное образование свободных жирных кислот (СЖК), обусловленное усиленным липолизом на фоне дефицита инсулина, приводит к отложению жира в нехарактерных для него органах и тканях. СЖК обладают прямой и опосредованной продуктами окисления липидов токсичностью, что приводит к ингибированию К/№ АТФазы, угнетению гликолиза, разобщению окислительного фосфорилирования, активизации PPARа пути утилизации избытка СЖК, развивается окислительный стресс. В результате описанных изменений формируется стеатоз печени. Генез диабетической гепатопатии (ДГП) при СД 1-го типа связывают также с нарушением внешнесекреторной функции поджелудочной железы и изменением активности липазы, диастазы, в меньшей степени — трипсина панкреатического сока.
В то же время хронический недостаток инсулина в организме вызывает повышение активности контринсулярных гормонов: кортизола, глюкагона, катехоламинов. Повышенный синтез глюкокортико-идов надпочечниками ведет к усилению процессов глюконеогенеза.
Обычно ДГП при СД 1-го типа протекают бессимптомно, создавая превратное впечатление о состоянии гепатобилиарной системы. Из-за кажущегося благополучия дополнительное обследование и необходимое лечение своевременно не проводятся. Кроме того, общепринятые для оценки состояния печени исследования уровней активности аминотрансфераз зачастую не коррелируют со степенью поражения печени и в большинстве случаев не выходят за пределы нормы.
По данным литературы, чаще всего встречаются три формы ДГП — диабетическая гепатомегалия, жировая дистрофия печени и хронический реактивный гепатит. При диабетической гепатомегалии выявляются мутное набухание, вакуолизация, баллонная дистрофия и снижение содержания гликогена в гепатоцитах. При жировой дистрофии печени морфологические изменения проявляются распространенной белковой и очаговой дистрофией, разрастанием стромы, слущиванием клеток эндотелия, периваскулярным склерозом и капельными включениями в гепатоцитах. При хроническом реактивном гепатите морфологическая картина
печени та же, что и при хроническом пер-систирующем гепатите.
ДГП ухудшает течение диабета: повышают частоту эпизодов кетоацидоза, гиперли-пидемии и дислипопротеидемии, существенно уменьшают вероятность достижения стойкой компенсации диабета, а также увеличивают риск развития ангиопатий и нейропатий.
Таким образом, адекватная коррекция ДГП является важным моментом в лечении СД 1-го типа, поэтому в антидиабетическую терапию должны быть включены препараты с гепатопротекторной активностью, а с учетом патогенеза и важной роли ПОЛ в поражении печени при ДГП еще и антиоксиданты. Верность данного утверждения подтверждается результатами клинических исследований, установивших эффективность комбинации унитиола, токоферола ацетата и карсила при ДГП. В последние годы исследуется возможность применения эссенциальных фосфолипидов, в частности эссенциале, в комплексной терапии детей с диабетом 1-го типа, их эффект связывают со стимуляцией управляемых фосфолипидами процессов торможения патологического накопления холестерина в тканях.
Учитывая существенное значение дисли-пидемии в генезе ДГП, которая в то же время является также и следствием нарушения процессов обмена липидов в печени на фоне дефицита инсулина, рациональным будет включение гиполипидемических препаратов, которые могут способствовать разрыву патологического круга и не только снижению риска сосудистых осложнений при СД 1-го типа, но и препятствовать развитию или приводить к регрессу гепатопатии.
Производные 3-гидроксипиридина (3-ГП) относятся к группе цитопротекторов с выраженной антиоксидантной и мембранопротекторной активностью. Из данной группы в клинической практике широко применяются такие препараты, как эмоксипин и мексидол. В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что мексидол проявляет протективное действие при токсических гепатитах, умеренное гиполипидеми-ческое действие при нарушениях липидного обмена. Для ряда новых производных 3-ГП была изучена аналогичная активность, и полученные результаты свидетельствуют о наличии подобных свойств у многих химических соединений данного ряда. В связи с этим актуальным является поиск среди новых производных 3-ГП эффективных препаратов, способных корригировать метаболические нарушения при СД 1-го типа, а также диабетическую гепатопатию.
Целью настоящей работы явилось исследование возможности коррекции гепатопатии и нарушений
X а Ш ЕЕ
те
у
х Е
Зс и ^
о Ч с
О >■
2
и
а
>
V
X
а
о
Таблица 1
ПОКАЗАТЕЛИ ГЛИКЕМИИ У БЕЛЫХ КРЫС С АЛЛОКСАНОВЫМ ДИАБЕТОМ И ЭКЗОГЕННОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЕЙ НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ ГП-5, СИМВАСТАТИНА И ИХ КОМБИНАЦИИ
Серия Средний уровень глюкозы в сыворотке крови, ммоль/л Степень достоверности
Интактные крысы 4,73 ± 0,42
Контроль 16,42 ± 2,19 p < 0,001*
ГП-5 в дозе 50 мг/кг 10,36 ± 1,31 p < 0,05**
Симвастатин в дозе 1 мг/кг 11,15 ± 0,68 p > 0,05**
ГП-5 в дозе 50 мг/кг + симвастатин в дозе 1 мг/кг 9,04 ± 2,11 p < 0,05**
— достоверность по отношению к значениям в интактной группе.
— достоверность по отношению к значениям в контрольной группе.
жирового обмена при экспериментальном СД 1-го типа с экзогенной гиперхолестеринемией с помощью нового производного 3-ГП под лабораторным шифром ГП-5, структурным компонентом которого являлось соединение с самостоятельной гиполипи-демической активностью. Исследуемое соединение было синтезировано на кафедре органической химии МГУ имени Н.П. Огарева, его структура подтверждена данными ИК-спектроскопии и ЯМР. В качестве препарата сравнения был выбран симвастатин, препарат с доказанным влиянием на липидный обмен, для которого в последние годы исследуется эффективность при дислипидемиях на фоне инсулинзависимого диабета. Выбор его также связан с имеющимися в литературе сведениями о его гепатитогенных свойствах. Последнее обусловило появление дополнительной группы сравнения — группы, получавшей комбинацию симвастатин + ГП-5, где ГП-5 выступал как потенциальный корректор побочных эффектов симвастатина.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проведено на 58 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-220 г. Диабет моделировали однократным внутрибрюшинным введением аллоксана в дозе 135 мг/кг. Гиперхолестеринемию моделировали ежедневным введением холестерина в дозе 40 мг/кг и эргокальциферола в дозе 7500 ЕД/кг per os в течение 14 дней. Летальность при моделировании к концу второй недели эксперимента составила 40%. Далее животных поделили на группы: 1-я — ин-тактные крысы; 2-я — контрольная, крысы с диабетом и гиперхолестеринемией, которым внутримышечно в течение 14 дней вводили 0,1%-ный раствор NaCl в дозе 0,1 мл; крысы 3-й группы получали ГП-5 в дозе 50 мг/кг (2,5% от LD50); 4-й — симвастатин в дозе 1 мг/кг в том же режиме; 5-й — ГП-5 в дозе 50 мг/кг с симвастатином в дозе 1 мг/кг. После 2-недельного курса терапии исследуемыми соединениями животных каждой группы декапитировали под уретановым
О!
о
о
ГЧ
наркозом, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
В каждой экспериментальной группе к окончанию эксперимента отмечали показатель летальности.
Для светоскопического изучения использовали образцы печени подопытных животных. Материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, заключали в парафин по общепринятой методике, срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Для определения физиологических изменений исследовали сыворотку крови. Уровень глюкозы сыворотки крови определяли глюкозоксидазным методом. Уровень малонового диальдегида (МДА) определяли набором Vital по методу С.Г. Конюховой, активность каталазы — по методу М.А. Королюка. Исследования проводили на фотоэлектроколориметре ERMA. В сыворотке крови иммуноферментным методом исследовали уровень общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ), ЛПНП. Уровень ЛПОНП и ЛПВП рассчитывали по формулам:
ХС ЛПОНП = ТГ/2,18;
ХС ЛПВП = ОХ - ХС ЛПОНП - ХС ЛПНП.
Значимость различий сравниваемых величин определяли на основании t-критерия Стьюдента. Значимыми считали различия при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Через 3 дня после введения аллоксана у животных появились первые признаки СД, а через 2 недели клиническая картина экспериментального СД становилась отчетливо выраженной у подавляющего числа животных: наблюдались матовость волосяного покрова, гиперпигментация кожи хвоста, полидипсия, полифагия, полиурия, которую определяли визуально и по нарастанию массы опилок, пропитанных мочой.
Летальность в различных группах, оцененная к концу эксперимента, существенно варьировала:
Таблица 2
ВЛИЯНИЕ ГП-5, СИМВАСТАТИНА И ИХ КОМБИНАЦИИ НА УРОВНИ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА И АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ БЕЛЫХ КРЫС С АЛЛОКСАНОВЫМ ДИАБЕТОМ И ЭКЗОГЕННОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЕЙ
Серии опытов МДА сыворотки крови, ммоль/л Каталаза сыворотки крови, мккат/с-л
Интактные крысы 9,17 ± 1,2 3,5 ± 0,7
14,68 ± 1,19 7,72 ± 1,72
Контроль
p < 0,05* p < 0,001*
10,40 ± 0,84 3,42 ± 0,67
ГП-5 в дозе 50 мг/кг
p < 0,05** p < 0,05**
13,15 ± 0,58 11,23 ± 1,18
Симвастатин в дозе 1 мг/кг
p > 0,05** p > 0,05**
ГП-5 в дозе 50 мг/кг + 9,4 ± 0,58 3,78 ± 0,7
симвастатин в дозе 1 мг/кг p < 0,01** p < 0,05**
* — достоверность по отношению к значениям в интактной группе.
** — достоверность по отношению к значениям в контрольной группе.
в контроле она составила 38%, в группе, получавшей симвастатин, — 16%, а в группе, получавшей ГП-5 и комбинацию ГП-5 с симвастатином, как и среди интактных животных, 0%.
При биохимическом исследовании крови было установлено, что введение аллоксана приводило к развитию достоверной гипергликемии (4,33 ± 0,41 ммоль/л у интактных крыс и 16,42 ± 2,19 ммоль/л в группе контроля) (табл. 1). На фоне терапии ГП-5 и комбинацией ГП-5 и сим-
вастатина отмечалось достоверное снижение уровня гликемии на 37 и 43% соответственно по сравнению с данным показателем в группе контроля. Достоверного снижения гликемии в группе симвастатина обнаружено не было.
Для оценки состояния процессов ПОЛ были исследованы уровни МДА и активность каталазы в сыворотке крови. Установлено, что в контрольной группе достоверно повышается активность каталазы (в 2 раза по сравнению
Таблица 3
ВЛИЯНИЕ ГП-5, СИМВАСТАТИНА И ИХ КОМБИНАЦИИ НА ПОКАЗАТЕЛИ ЛИПИДНОГО
СПЕКТРА СЫВОРОТКИ КРОВИ БЕЛЫХ КРЫС С АЛЛОКСАНОВЫМ ДИАБЕТОМ И ЭКЗОГЕННОЙ
ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЕЙ
Общий Триглицериды ЛПОНП ЛПНП ЛПВП
Серии опытов холестерин сыворотки сыворотки сыворотки сыворотки
сыворотки крови, ммоль/л крови, ммоль/л крови, ммоль/л крови, ммоль/л крови, ммоль/л
Интактные крысы 1,44 ± 0,05 0,57 ± 0,04 0,28 ± 0,02 0,67 ± 0,03 0,49 ± 0,01
Контроль 2,48 ± 0,37 p < 0,05* 1,25 ± 0,16 p < 0,01* 0,62 ± 0,08 p < 0,01* 1,36 ± 0,05 p < 0,001* 0,49 ± 0,11 p > 0,05*
ГП-5 в дозе 50 мг/кг 1,32 ± 0,09 p < 0,05** 0,63 ± 0,07 p < 0,01** 0,31 ± 0,03 p < 0,01** 0,5 ± 0,02 p < 0,001** 0,51 ± 0,31 p > 0,05**
Симвастатин 1,65 ± 0,03 0,54 ± 0,05 0,27 ± 0,03 0,88 ± 0,06 0,51 ± 0,06
в дозе 1 мг/кг p > 0,05** p < 0,01** p < 0,01** p < 0,001** p > 0,05**
ГП-5 в дозе 50 мг/ 1,5 ± 0,05 0,68 ± 0,12 0,34 ± 0,06 0,59 ± 0,02 0,57 ± 0,05
кг + симвастатин в дозе 1 мг/кг p < 0,05** p < 0,05** p < 0,05** p < 0,001** p > 0,05**
- достоверность по отношению к значениям в интактной группе.
— достоверность по отношению к значениям в контрольной группе.
конкурс молодых ученых
young scientists competition
со средним значением в интактной группе), однако данное повышение не обеспечивает адекватного снижения процессов ПОЛ, что проявляется накоплением в крови диеновых коньюгатов, в частности уровень МДА достоверно повышается на 60% по сравнению с аналогичным показателем в группе интактных животных (табл. 2). На фоне введения ГП-5 и комбинацией ГП-5 и симвастатина отмечалось достоверное снижение уровня МДА на 29 и 36% соответственно по сравнению с данным показателем в группе контроля, при достоверно более низкой активности каталазы, чем в контроле. Достоверного изменения уровня МДА и активности каталазы в группе симвастатина по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе не обнаружено.
Уровень ОХ в группе контроля был достоверно выше, чем у интактных, на 72%, ТГ и ЛПОНП — на 121%, ЛПНП — на 103%, что характеризовало дислипидемические нарушения в крови подопытных животных с моделируемой патологией. На фоне монотерапии ГП-5 уровень ОХ, ТГ и ЛПОНП, ЛПНП снижался на 47, 50 и 63% соответственно по сравнению с контролем. На фоне введения комбинации симвастатина и ГП-5 уровень ОХ, ТГ и ЛПОНП, ЛПНП снижался на 40, 45 и 57%, тогда как на фоне монотерапии симвастатином указанные показатели снижались на 33, 56 и 35%. Достоверных изменений уровня ЛПВП в группах обнаружено не было, что могло быть связано со спецификой физиологии подопытных животных.
При исследовании печени белых крыс из группы контроля (рис. 2-4 (см. цветную вклейку)), которым спустя 2 недели после моделирования СД на протяжении 14 суток вводился физиологический раствор, были обнаружены следующие изменения по сравнению с печенью интактных животных (рис. 1 (см. цветную вклейку)): нарушение балочной структуры, баллонная дистрофия с признаками жировой инфильтрации гепатоцитов преимущественно 2-й и 3-й зоны аци-нуса, выраженная зернистая дистрофия гепатоцитов 1-й зоны ацинуса, гликогеноз ядер (эффект «пустых ядер») преимущественно 1-й зоны ацинуса, единичные жировые кисты, невыраженная лейкоцитарная инфильтрация портальных трактов. Патологические изменения присутствовали во всех взятых образцах, варьировала лишь степень их выраженности.
На фоне введения ГП-5 в дозе 50 мг/кг наблюдались сохранная балочная структура печени, зернистая дистрофия гепатоцитов, гликогеноз ядер гепатоцитов 1-й зоны ацинуса, у части животных — полнокровие центральной вены и синусоид, также были обнаружены Рй-клетки в синусоидах, стеатоз отдельных гепатоцитов 3-й зоны ацинуса (рис. 5, 6 (см. цветную вклейку)). В целом отмечалась более сохранная гистологическая картина, без явлений баллонной дистрофии гепатоцитов.
На фоне введения препарата сравнения — сим-вастатина в дозе 1 мг/кг также отмечались сохранение нормального балочного строения печени подопытных животных, зернистая дистрофия большинства гепатоцитов, гликогеноз ядер 1-й зоны ацинуса, стеатоз части гепатоцитов 3-й зоны, а также баллонная дистрофия единичных гепатоцитов в 3-й и 2-й зонах, четко выраженных воспалительных изменений не наблюдалось (рис. 7, 8 (см. цветную вклейку)). На фоне терапии комбинацией ГП-5 и симвастатина были обнаружены аналогичные изменения (рис. 9 (см. цветную вклейку)).
ВЫВОДЫ
При СД 1-го типа с экзогенной гиперхолестерине-мией в условиях эксперимента в течение месяца формируется поражение печени, характеризующееся главным образом баллонной дистрофией гепа-тоцитов и гликогенозом ядер гепатоцитов, а также нарушается жировой обмен, что проявляется гипер-холестеринемией, гипертриглицеридемией, увеличением уровня ЛПНП и ЛПОНП. Кроме того, наблюдается активация ПОЛ, что проявляется ростом уровня МДА в сыворотке крови. Отмечается связь между уровнем гликемии и степенью выраженности нарушения липидного обмена, а также с глубиной поражения печени. Указанные изменения удается в определенной мере корригировать при применении ГП-5, симвастатина и их комбинации. Следует отметить более значимые эффекты монотерапии ГП-5: гепатопротективное действие по данным гистологии печени, гипогликемизирующее действие, а также корригирующее действие на показатели липидного обмена, сравнимое с гиполипидемичес-ким эффектом симвастатина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабак О.Я. Заболевания печени у пациентов с сахарным диабетом: современная тактика и стратегия терапии // Здоровье Украины. — 2008. — № 6/1. — С. 14-15.
2. БалаболкинМ.И. Диабетология. — М.: Медицина, 2000. — 672 с.
3. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете // Сахарный диабет. — 1999. — № 1. — С. 4-6.
4. Ивашкин В.Т., Шульпекова Ю.О. Неалкогольный стеатогепатит // РМЖ. Болезни органов пищеварения. — 2000. — Т. 2. — С. 41-45.
5. ЛазебникЛ.Б., ЗвенигородскаяЛ.А., Морозов И.А. и др. Клиникоморфологические изменения печени при атерогенной дислипидемии и при лечении статинами // Тер. арх. — 2003. — № 8. — С. 51-55.
6. Львова Л. Здоровый консерватизм [Электронный ресурс]. — Режим доступа: Ьнр;//™жмг.ргоу1$ог.сот.иа/агсЫуе/2001АМ22/аг1:_16.Ы:т?^е^
7. Туркина Т.И., Марченко Л.Ф., Сапелкина Л.В. Эссенциальные фосфолипиды в комплексном лечении детей, больных сахарным диабетом 1-го типа // Мед. научн. и уч.-метод. журн. — 2002. — № 9. — С. 82-87.
о
