CC BY
19
Вопросы ли агностики
Возможности ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА ПРИ ВНУТРИУТРОБНОМ ИНФИЦИРОВАНИИ ГЕРПЕТИЧЕСКИМИ ВИРУСАМИ
3. А. Осипова, Е. А. Мурина, Н. В. Скрипченко, О. А. Аксенов
фгу нии детских инфекций росздрава, санкт-петербург
В статье представлены подходы к диагностике этапов инфекционного процесса при внутриутробных инфекциях, основанных на результатах модифицированной реакции связывания комплемента, позволяющих выявлять как антиген возбудителя, антитела различных классов, так и ранние специфические иммунные комплексы. Установлено, что у ребенка или у матери «свободные антитела» при повторных обострениях инфекционного процесса относятся к подклассу lgG3, заменяясь антителами подкласса lgGc_2 и далее lgG4 при купировании основного заболевания. Подобная схема замещения антител в различных подклассах lgG позволяет при обследовании новорожденного и его матери ретроспективно дифференцировать разницу в превалировании антител в определенных подклассах lgG и по ней рассчитать примерное время инфицирования возбудителем плода. Чем далее подкласс иммуноглобулинов G матери отстоит по указанной схеме от подкласса lgG антител ребенка, тем раньше во время беременности было внутриутробное инфицирование плода.
Ключевые слова: внутриутробные инфекции, герпетические вирусы, иммуноглобулины G
Potentialities for Success in Stepwise Diagnosing Intrauterine Fetus Cases Infected with Herpetic Viruses
Osipova Z. A., Murina E. A., Skripchenko N. V. and Aksyonov O. A.
Research Institute of Infantile Infections Russian Federation Ministry of Public Health, St. Petersburc
The article discloses the approaches and methods for the stepwise diagnosing infected intrauterine fetus. The selected methods are based on the princi ple of tracing the modified complement fixation reaction and permit revealing just as the antigen activator so the antibodies of diverse classes and the early specific immune complexes. The researchers have fixed the fact that the free antibodies existing in a fetus or lying-in woman, in cases of recurrent exacerbation of the infectious process, can be rated in subclass lgG?. These antibodies tend to be replaced by antibodies falling within the lgG,_2 class and further the lgG4 category in cupping off the main disease. This pattern of substitution of antibodies placed in the lgG classes makes possible examining a newborn and his/her mother retrospectively differentiate with respect the extent of predominancy of antibodies rated in the lgG subclasses and reckon the approximate moment of the pathogen entering the fetus. The farther the subclass of the immunoglobulins G contained in women in child birth stand apart from the above-mentioned subclass lgG and infants antibodies (according the above pattern), the earlier an LntrauterLne fetus may become Lnfected durLng the pregnancy perLod. Key words: intrauterine infections, herpetic viruses, immunoglobulins G
Сложность клинической диагностики оппортунистических инфекций у человека, таких как герпес 1 и 2-го типов, цитомегалия, краснуха, хламидиоз, токсоплазмоз, микоплазмоз и других, особенно при персистенции возбудителей, значительно повышает актуальность этио-диагностических аспектов этих нозологических форм. Стертость клинической симптоматики, большая частота микст форм определяют особую важность разработки оригинальных методических приемов как для расшифровки этиологии, так и для установления фазы и прогноза этих заболеваний [1 — 3]. В последние годы значительно расширились возможности этиологической диагностики вирусных инфекций. Новые высокоинформативные тесты выявления антителообразования у больных, тестирование вирусных антигенов в иммунофермент-ных реакциях, определение генетических компонентов в ПЦР-тесте повышают частоту этиологического подтверждения вирусных и близких к ним по патогенезу инфекционных заболеваний.
В НИИ детских инфекций в последние годы разработан ряд тестов по экспресс-диагностике вирусных инфекций на основе модифицированной реакции связывания комплемента (м-РСК), позволяющих выявлять как антигены возбудителей и антитела к ним различных классов, так и ранние специфические иммунные комплексы [4—7]. Унификация этих тестов в плане
возможного использования при многих инфекционных заболеваний дала основание для разработки системы комплексной дифференциальной этиологической диагностики. В то же время расширение спектра этиологических факторов, безусловно, ставит вопрос об определении фазы инфекционного процесса, особенно при внутриутробных инфекциях, имеющих хроническое прогредиентное течение, и разграничение истинного антителообразования как следствия инфекционного поражения, отличие от бустер-эффекта, и появления антител к близкородственным группам возбудителей [8].
Известно, что вирусогенез при инфекции является динамичным процессом, включающим в себя вирусную репродукцию и систему элиминации вирионов из организма. Это сопровождается последовательным появлением в крови или других биологических материалах у больного вирусных антигенов, как в мо-но-форме, так и в структуре вирионов, специфических иммунных комплексов и свободных антител в различных подклассах иммуноглобулинов. Подтверждение инфекции базируется на выявлении этих факторов, и для правильной диагностики инфекционного заболевания в каждом отдельном случае необходимо одномоментное определение всех указанных параметров. Такая диагностика особенно важна у детей первых месяцев жизни, так как внутриутробное инфицирование
Таблица 1. Характеристика свойств антител в различных подклассах иммуноглобулинов
Антитела в подклассе иммуноглобулина Свойства антител в данном подклассе
Наличие активности антител в нативной сыворотке Разрушение прогреванием при 56' — 30 мин (авидность) Сорбция на белок А стафилококка Разрушение аминокислотой цистеином
1дМ* +++ +++ отс. ++++
!д°-з +++ отс. отс. ++
|дО-1—2 ++ отс. +++ отс.
|дО-4 отс. усил. усил. усил.
+++ — наличие эффекта, отс. — отсутствие эффекта, усил. — усиление эффекта, по сравнению с показателями нативной сыворотки, * — подклассы подтверждены в специальном исследовании
плода часто приводит к развитию у новорожденного хронического течения заболеваний. В настоящее время доказано проникновение через плацентарный барьер вирусов, особенно при неблагоприятном течении беременности [9, 10].
Очевидно, что в части случаев попадание инфекта в плод не ведет к острой внутриутробной инфекции за счет включения в процесс защитных факторов, таких как материнские антитела и антитела плода, интерфе-роны матери и плода и плацентарный интерферон [9, 11]. Инфекция внутриутробно развивается у плода как хроническая или персистирующая. В то же время рождение как стрессорная реакция для новорожденного может активировать хроническую или персистирую-щую внутриутробную инфекцию с развитием обострения в первые недели после рождения. Такое обострение, как правило, приводит к поражению ЦНС, так как вероятность попадания возбудителя в мозг внутриутробно чрезвычайно высока из-за большей биомассы мозга, в сравнении с другими органами и незрелостью гематоэнцефалического барьера [12, 13].
Материалы и методы исследования
Обследовались дети (608 человек) в возрасте от 7 дней до 10 месяцев жизни с внутриутробными инфекциями 1 и 2-го типов (герпес, цитомегалия и инфекционный мононуклеоз) и их матери (578 человек).
Объектом исследования служили биоматериалы от детей и их матерей, больных различными вирусными инфекциями, — кровь (п = 1186) и ликвор (п = 239). Использовались стандартные методы тестирования противовирусных антител методом классического им-муноферментного анализа (ИфА), а также разработанная модифицированная реакция связывания комплемента (м-РСК) для диагностики антигенов возбудителей, специфических иммунных комплексов (СИК) и антител (АТ) в различных подклассах иммуноглобулинов (1д) в биологических материалах больных [7].
Принцип м-РСК заключался в постановке реакции связывания комплемента в одном разведении исследуемого биологического материала (сыворотка крови, ликвор) с конечным цифровым учетом реакции. Методологические особенности метода м-РСК:
— уровень остаточного гемолиза после проведения стандартной РСК для определения антител тестировался количественно по уровню оксидазных ферментов, вышедших из гемолизированных эритроцитов, с помощью метода используемого при постановке ИфА (ортофенилендиамин + перекись водорода с учетом результатов при длине волны 495 нм);
— при использовании м-РСК тестировались антитела и антигены возбудителей;
— снижение цифрового показателя по отношению к контролю в такой модификации характеризовало на-
Таблица 2. Активность специфических антител, определяемая методом м-РСК, и содержание их в подклассах иммуноглобулинов в различные фазы герпетической и цитомегаловирусной инфекции
Подкласс 1д с наличием антител к ВПГ и ЦВМ Титр антител (в обратных величинах) к ВПГ и ЦМВ в различных фазах инфекций
Первично-острая п = 334 Паст-инфекция п = 139 Хроническая п = 205 Повторное обострение п = 97
1дМ 86,3 ± 6,4 19,2 ± 4,8 6,2 ± 0,8 12,6 ± 3,8
|дО-1—2 6,3 ± 0,6 52,7 ± 3,4 11,6 ± 7,4 0
!д°-з 0 0 12,4 ± 3,2 36,3 ± 4,2
|дО-4 0 0 39,6 ± 6,2 0
личие в пробе антител или антигена и выражалось в относительных единицах (о. е.);
— увеличение цифрового показателя после проведения реакции выше уровня контрольных проб означало выход эндогенного комплемента из раннего специфического иммунного комплекса, образованного возбудителем со специфическими антителами (СИК) и количественно характеризовало величину этого комплекса, выраженного в относительных единицах (о. е.);
— дифференцирование антител по классам и подклассам иммуноглобулинов (1дМ, 1дС1—2, 1д03 и 1дС4) проводили по особенностям их свойств: термоинактивация (характеристика авидности), сорбция на белок А стафилококка и разрушение аминокислотой — солянокислым цистеином (табл. 1).
Дифференцирование антител в различных подклассах иммуноглобулинов проводили по характеристике свойств выявляемых антител: их способности сорбироваться на белок А стафилококка, разрушаться аминокислотой — солянокислым цистеином и прогреванием при 56°С в течение 30 мин [6].
Результаты и их обсуждение
На основании использования метода м-РСК проводилась этиологическая верификация различных вирусных инфекций, а также определялась стадия инфекционного процесса у детей первого года жизни.
С помощью метода м-РСК было обследовано 608 новорожденных и детей первого года жизни и 578 матерей. Проводили этиологическую диагностику инфекций, вызванных вирусами простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ), цитомегалии (ЦМВ) и Эпштей-на-Барр (ВЭБ).
Обследование детей с длительной лимфаденопати-ей на инфекцию, вызванную вирусом Эпштейна-Барр, позволило выявить данную этиологию заболевания у 63% пациентов. При этом антиген ВЭБ тестировался только у 21,2% детей, СИК — у 27,7%, серологически ВЭБ-инфекция подтверждалась у 35,3% и суммарно по наличию в крови специфических антител и СИК — у 15,7% больных. Очевидно, что дополнительное определение вирусных антигенов и СИК почти в 2 раза повышает этиологическую расшифровку инфекционного мононуклеоза. Этиологически подтвержденный инфекционный мононуклеоз с тяжелым течением сопровождается обнаружением у больных вирусных антигенов и СИК в большем количестве, чем свободные антитела. Доля выявления антигена при тяжелом течении ВЭБ-инфекции составила в первые 5 дней заболевания 30%, СИК — 42%, а антитела прослеживались только у 20% больных. В то время как при средне-тяжелой форме эти показатели были соответственно 16, 32 и 35% (р < 0,01).
При постнатальном менингоэнцефалите, предположительно вызванным вирусами герпеса, этиология была установлена в 67,4% случаев, причем из подтвержденных случаев антиген вируса герпеса 1- и 2-го серо-типов выявлялся в первые 5 дней заболевания у 18,2% больных, СИК — у 37,0%, антитела — у 26,2%, а одновременно антитела и СИК — у 18,4% детей. При обнаружении у больных вируса цитомегалии лабора-
торная картина отличалась от случаев, связанных с вирусами герпеса 1- и 2-го серотипов, признаками активации ЦМВ. В первые 5 дней заболевания у 39,7% пациентов выявлялся антиген и у 48,9% — антитела, СИК фиксировался в 50,1%, а одновременно антитела и СИК — у 40,4% детей.
В ходе скринингового исследования было выявлено, что первично-острая инфекция (простой герпес, цито-мегалия и инфекционный мононуклеоз) сопровождалась существенным нарастанием в крови антител со свойствами, характеризующими антитела класса 1дМ, которые затем сменялись антителами класса 1д©3. При повторных обострениях хронической инфекции, включая неонатальное обострение врожденной инфекции (обследовано 298 больных), имело место появление в крови преимущественно высокоавидных антител (74,9%), не сорбирующихся на стафилококке, разрушающихся цистеином, что характеризовало их как антитела подкласса 1дС3. Через 3—4 месяца антитела этого класса сменялись на антитела подкласса 1дС1—2.
При переходе первично-острой фазы или обострении инфекционного процесса в клинически манифестное хроническое течение заболевания антитела указанных подклассов исчезали и определялись антитела, не сорбирующие комплемент, которые были отнесены к подклассу 1дС4. Смена антител по типу 1дМ— 1д©3—1дС1—2—1дС4 была характерна для различных вирусных инфекций. Так, при первичной герпетической и цитомегаловирусной инфекции имело место образование специфических антител, главным образом в классе 1дМ, и средняя активность их в обратных величинах титра составила 86,3 + 6,4 ед. (табл. 2).
При паст-инфекции в 68,9% случаев выявлялись антитела в подклассах 1дС1—2 с титром 52,7 + 3,4 ед., а при хронизации процесса — в 58,3% антитела, тестируемые в м-РСК, подкласса 1дС4 со всеми свойствами, указанными в таблице 1. Наличие обострений коррелировало с более выраженной активностью специфических антител в подклассе 1дС3, средний показатель которых достигал 36,3 + 4,2 ед.
Представленные выше характеристики антител при различных вирусных инфекциях и сравнение антител новорожденного ребенка с материнскими антителами дали возможность обосновать время инфицирования плода в течение беременности. Если инфицирование плода произошло в первые 2—3 месяца беременности, то при отсутствии спонтанного выкидыша и родов в дальнейшем обострение внутриутробной инфекции у новорожденного будет характеризоваться наличием антител к данному возбудителю, относящихся к подклассу 1дС3, при отсутствии их у матери. При инфицировании на 4—6 месяце беременности у матери на момент родов и развитии у ребенка острого процесса тестируются в основном антитела класса 1дС4, а у новорожденного в это время — антитела 1д©3 класса. Заражение плода в последние месяцы беременности (7—8) сопровождается выявлением у матери, так же как и у ребенка при обострении данной инфекции, антител класса 1дС3. И, наконец, наличие у матери и новорожденного антител класса 1дМ подтверждает
инфицирование плода в последний месяц беременности и интранатально.
На суммарном примере внутриутробных инфекций (простой герпес, цитомегалия и инфекционный моно-нуклеоз) у 342 новорожденных установлена частота инфицирования плода в различные периоды беременности: в первые три месяца беременности — у 11,9%, на 4—5 месяце беременности — у 33,3%, на 5 — 6 месяце — у 35,7% и у 19,1% — на 7—8 месяце беременности.
Снижение процента (19,1%) инфицированности плода на 7—8 месяце беременности обусловлено преждевременными родами, которые наступали в течение 7 месяцев беременности. Очевидно, что наиболее высокая частота инфицированности указанными инфекциями происходит в интервале 5—6 месяцев беременности (35,7%).
Заключение
С помощью метода м-РСК возможно тестирование антигенов, специфических иммунных комплексов и свободных антител при различных вирусных инфекциях у детей, что позволяет не только осуществлять этиологическую диагностику заболеваний, но и проводить определение этапности инфекционного процесса.
Определение подклассов антител позволяет установить: преимущественный синтез антител 1дМ класса при первично-острой инфекции, 1дС3 — при обострении процесса, а антител 1дС4 подкласса — при хроническом течении заболевания. Выявленное распределение антител по подклассам у новорожденных детей с внутриутробной герпетической инфекцией и их матерей позволяет ретроспективно устанавливать время инфицирования плода. Для этапной характеристики инфекционного процесса у детей раннего возраста рекомендуется одновременное проведение лабораторного исследования крови ребенка и матери на наличие специфических антител на самых ранних сроках заболевания с применением метода м-РСК.
Литература:
1. Диагностика и прогностическая ценность специфического иммунного ответа к вирусу цитомегалии у беременных женщин с привычным невынашиванием беременности / Г. Е. Сухих и др. // Акушерство и гинекология. — 1992. — № 3—7. — С. 30—33.
2. Evaluation of various plastic microtiter plates with measles, toxoplasma amd gamma-globulin antigens in enzime-linked immunosorbent assays / I. C. Sherarchi et al. // J. Clin. Microbiol. — 1984. — V. 19. — № 2. — P. 89—96.
3. Fever of undetermined origin. Role of cytomegalovirus and Ep-stein-Barr virus / M. Fiala et al. // West J. Med. — 1978. — V. 129. — № 4. — P. 263—266.
4. Аксенов О. А. Способ иммунологической экспресс-диагностики энтеровирусных инфекций / О. А. Аксенов, 3. А. Оси-пова, Е. А. Мурина // Патент на изобретение № 2034025 от 30.04.95.
5. Аксенов О. А. Способ дифференциальной диагностики различных форм ДНК-овых инфекций / О. А. Аксенов, 3. А. Оси-пова // Патент на изобретение № 2121683 от 10.11.98.
6. 3. А. Осипова. Способ иммуноферментного выявления фаз оппортунистических инфекций / 3. А. Осипова, О. А. Аксенов. // Патент на изобретение № 2134422 от 10.08.99.
7. Использование модифицированной реакции связывания комплемента для экспрессной диагностики вирусных инфекций у детей / О. А. Аксенов и др. // Клиническая лабораторная диагностика. — 1999. — № 7. — С. 35 — 38.
8. Петров Р. В. Иммунология. — М.: Медицина, 1987. — С. 416.
9. Мельникова В. ф. Патологическая анатомия поражений последа, вызванных вирусами ( респираторными и простого герпеса ) и микоплазмами: Автореф. дисс. ... д.м.н. — СПб., 1992. — 37 с.
10. Мельникова В. ф. Инфекционные плацентиты, особенности плаценты как иммунного барьера / В. ф. Мельникова, О. А. Аксенов // Архив патологии. — 1993. — № 5. — C. 78—91.
11. Changes in the fetal organs and the placenjta with intrauterine my coplasma infection / А. V. Zinserling et al. // Zentralbl. allg. Path. Pathol. Anat. — 1986. — № 132. — Р. 109—117.
12. Макарычева А. Д. Комплексная лабораторная оценка течения беременности. — М., 1982. — 200 с.
13. Ритова В. В. Роль вирусов в перинатальной и постнатальной патологии человека. — М., 1976. — 156 с.
Определение энтеровирусных и паротитных антигенов у детей
Е. А. Мурина, О. В. Голева, Н. В. Скрипченко, О. А. Аксенов
фгу нии Детских инфекций Росздрава, Санкт-Петербург
Разработан ускоренный тест (модифицированная реакция связывания комплемента — м-РСК) выявления антигенов у больных, позволяющий проводить экспресс-идентификацию вирусных агентов при энтеро- и паротитно-вирусных инфекциях. Проведен мониторинг циркуляции энтеровирусов в регионе, подтверждающий сведения об их цикличности, и показана сменность доминирующих и недоминирующих серотипов энтеровирусов. Выявлена эпидемиологическая закономерность: первоначальное появление доминирующих серотипов энтеровирусов у взрослого населения с последующим возрастанием их этиологической значимости у детей. Экспресс-выявление антигенов у больных с паротитно-вирусной инфекций позволяет определять не только паротитный антиген, но и специфические иммунные комплексы в слюне и прогнозировать характер течения инфекции и возможность установления прогностических критериев развития менингита на ранних сроках инфекции.
Ключевые слова: модифицированная реакция связывания комплемента, антиген, дети, серозный менингит, энтерови-рус, паротит
