CC BY
36
13. Брудастов Ю.А. Антикомплементарная активность бактерий. Автореф. дис...канд.мед.наук. - Челябинск. - 1992. - 22 с.
14. Волянський К).Л., Мироненко Л.Г, Калініченко С.В., и др. Стандартизація приготування мікробних суспензій. / Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я №163-2006. Міністерство охорони здоров'я України; Український центр наукової медичної інформації та патентно-ліцензійної роботи (Укрмедпатентінформ).
15. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. -М.:Медицина.-1992. -С.29-59.
16. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., и др. // Лабораторное дело. - 1986. - № 4. - С.112-114.
17. Кур’ята Н.В. Адгезивні та імуномодулюючи властивості бактерій роду ЬайоЬасіІш: Дис...канд. биол. наук: 03.00.07. - Одесса. - 2005. - 171 с.
18. Метод, указ. к лаб. работам по клинической биохимии. -Х.:УИУВ (каф.мед.биох.). - 1988. - 116 с.
19. Вишнякова Л. А., Резцова Ю.В.//ЖМЭИ. - 1990. - № 2. -С.108-109
20. Лабинская А.С., Блинкова А.П., Егцина А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. -М. Медицина. - 2004. - 576 с.
СТЕПЕНЬ АКТИВНОСТИ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ У ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ШТАММОВ ТОКСИНООБРАЗУЮЩИХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ
С.В. Калиниченко
Институт микробиологии и иммунологии имени И.И. Мечникова АМН Украины, г. Харьков РЕЗЮМЕ
Проведено изучение степени активности факторов патогенности циркулирующих токсинообразующих коринебактерий, выделенных от больных ЛОР-патологией, здоровых носителей и лиц, обсле дованных с профилактической целью.
Установлено, что все исследованные штаммы обладали высокой способностью к адгезии и инактивировали комплемент. У большинства исследованных штаммов активность ферментов колонизации и инвазии была на высоком уровне. Степень активности указанных факторов обуславливает, в значительной мере, эпидемиологическую значимость циркулирующих штаммов коринебактерий.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: факторы патогенности, токсинообразующие коринебактерии
THE LEVEL OF ACTIVITY OF PATHOGENICITY FACTORS OF THE TOKSINFORMING CORYNEBACTERIA CIRCULATORY STAINS
S. V. Kalinichenko
Mechnikov-Institute of Microbiology and Immunology of AMS of Ukraine, Kharkov SUMMARY
The level of activity of pathogenicity factors of circulatory toksinforming Corynebacteria, selected from patients with pathology of ear, nose and throat, healthy carriers and persons inspected with a prophylactic purpose, was studied.
It was found out, that all explored stains had a high capacity for adhesion and inactivated complement. The most explored stains had a high indexes of activity of colonization and invasion enzymes. The level of activity of the indicated factors cause, to a great extent, epidemiological consequence of Corynebacteria circulatory stains.
KEY WORDS: pathogenicity factors, toksinforming Corynebacteria УДК: 579.222+615.012
ВОЗМОЖНОЕ ВЛИЯНИЕ ФЕНОБАРБИТАЛА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕРАПИИ ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ
И.С. Леонова, В.И. Падалко
НИИ биологии Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина, Украина РЕЗЮМЕ
Установлено, что фенобарбитал, существенно не влияя на морфологию, смертность и интенсив-
ность дыхания клеток культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae, стимулирует накопление эргосте-рина в клетках культуры, изменяя тем самым их стресс-устойчивость. Этот факт может свидетельствовать о том, что продолжительное использование лекарственных средств, содержащих фенобарбитал, на фоне терапии кандидозов и микозов может оказывать влияние на эффективность применяемых при этом препаратов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дрожжи, эргостерин, фенобарбитал
Как известно, экзогенные факторы, в том числе и лекарственные препараты, способны оказывать существенное влияние на интенсивность метаболизма микроорганизмов, а значит, и модифицировать течение патологических процессов, инициируемых микроорганизмами (в частности, дрожжами рода Candida) [1].
На сегодня одним из наиболее успешных подходов к лечению кандидозов и микозов является применение группы препаратов, действующих на стериновый обмен возбудителей данных заболеваний [2-5]. Основной механизм действия этой группы препаратов заключается в ингибировании синтеза сте-ринообразования у микроорганизмов на уровне цитохром Р-450 - зависимого 14-а-деметилирования ланостерола [6, 7]. Под-
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служил дикий штамм пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae,полученный из коллекции ОАО Пивзавод «Рогань» (г. Харьков). Культура росла на среде следующего состава: глюкоза -
0,5%, сусло - 25%. Дрожжи культивировали в колбах объемом 250 мл при температуре 25°С и постоянном перемешивании [10, 11]. Объем среды составлял 50 мл. Для эксперимента биомассу отбирали на указанные в тексте сутки роста культуры. Фенобарбитал вносили в среду культивирования дрожжей в концентрации 0,01 мг/мл.
Количество клеток дрожжей подсчитывали общепринятым методом в камере Горяева. Соотношение «живых» и «мертвых» клеток определяли при помощи красителя три-панового синего (0,8%) [12].
Экстракцию стеринов из клеток дрожжей проводили по методу Бревика и Оводса в модификации Вудса [13]. Содержание эрго-стерина определяли спектрофотометрически в области длин волн 200-310 нм [14] на спектрофотометре Specord UV VIS «Carl Ziess Jena» (Германия) по методу [14] во всех экспериментальных вариантах на 10 и 14-е сутки роста культуры. Содержание эргостерина рассчитывали по максимуму поглощения при 281 нм, используя коэффициент молярной экстинкции 11500 М - 1 см-1 [13, 14].
Для изучения устойчивости клеток дрожжей к осмотическому шоку в культуру дрожжей вносили NaCl до конечной концентрации 1,3 М [15].
тверждением участия цитохрома Р-450 в 14-а-деметилировании ланостерола может служить тот факт, что кислород и NADPH-зависимое превращение ланостерола в 4,4-диметилзимосерин ингибируется антителами к цитохрому Р-450 [8].
Известно, что классическим индуктором цитохромов Р-450 является фенобарбитал [9], входящий в состав целого ряда лекарственных препаратов, применяемых в качестве успокоительных, снотворных и проти-восудорожных средств.
Учитывая вышеизложенное, в работе было изучено влияние фенобарбитала на интенсивность метаболических процессов клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, родственных патогенным дрожжам рода Candida.
Для изучения устойчивости клеток дрожжей к тепловому шоку культуру дрожжей помещали в пробирки и погружали в водный термостат с температурой 45°С
[16]. Экспозиция составляла 30 и 60 минут
[17].
В качестве показателя интенсивности метаболической активности культуры использовали эндогенное дыхание клеток дрожжей
[18], которое определяли полярографически по скорости потребления кислорода при помощи кислородного электрода Кларка [19].
Содержание белка определяли по методу Лоури и соавторов в модификации Миллера [20].
Сравнение средних величин в выборках с нормальным распределением проводили при помощи t-критерия Стьюдента с использованием компьютерного пакета программ «Statistika V.6». Различия считали достоверными при Р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В клетках S. cerevisiae стерины преимущественно локализованы в митохондриях и микросомах, с которыми связаны ферментные системы, участвующие в биосинтезе эргостерина [21]. Кроме того, небольшая часть стеринов содержится во внутриклеточных мембранах [22]. Основное значение стеринов и, в частности, эргостерина, на долю которого приходится до 80% всех стеринов клетки, связывают с ролью структурного компонента мембран [23]. Такие свойства клеточной мембраны, как текучесть [24], проницаемость [25, 26], устойчивость к лизису, эндо-
цитоз [27, 28], вязкость [25, 27] связаны с наличием в ней стеринов. Для поддержания дыхательной активности дрожжи предпочитают эргостерин другим стеринам [29]. Сте-рины принимают участие в транспорте ненасыщенных жирных кислот и поддержании равновесия между насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами в клетке дрожжей [30, 31]. Существует предположение, что образование эргостерина - ни что иное, как реакция детоксикации, защищающая микроорганизмы от излишнего количества жирных кислот [32]. Кроме того, благодаря способности к комплексообразованию стерины являются защитным фактором от токсического действия многих природных соединений и внешних воздействий [23, 30].
Имеются данные также о том, что стерины в мембранах влияют на функцию перме-азных систем клетки, определяя тем самым проницаемость мембраны для различных соединений [33].
Большое внимание исследователей привлекает и такая функция стеринов, как регу-
ляция роста клеток дрожжей [30].
Вышеприведенные данные свидетельствуют о значительной роли эргостерина в процессах жизнедеятельности дрожжей S. cerevisiae, поэтому изучение влияния лекарственных средств на синтез эргостерина в клетках дрожжей может представлять существенный интерес для медицины и фармакологии.
При изучении влияния фенобарбитала на накопление эргостерина установлено, что его содержание в клетках дрожжей при внесении фенобарбитала в среду культивирования значительно увеличивалось и превышало контроль в 1,8-2,5 раз с 7 по 16 сутки культивирования (рис. 1).
Для целей данной работы представляло интерес сравнение двух культур дрожжей S. cerevisiae, клетки которых накапливали разное количество эргостерина. Содержание эргостерина в первой было 16,0-17,0 нмоль на 107 клеток (культура К 1), а во второй 22,0-23,0 нмоль на 10 клеток (культура К 2).
*
40
30
20 *
10
0 Г
7
*
□ Контроль
□ ФБ
10
14
16
Продолжительность культивирования, сут.
Рис. 1. Содержание эргостерина в клетках Saccharomyces cerevisiae при росте на среде, содержащей фенобарбитал,
на различных этапах культивирования.
Инкубация клеток дрожжей в условиях теплового шока показала, что в культуре К 2 количество мертвых клеток было в 1,8 и 2 раза больше (через 30 и 60 минут культивирования), чем в культуре К 1 (рис. 2).
В случае осмотического шока через 30 и 60 минут инкубации в культуре К 2, количество мертвых клеток было в 1,7 и 1,6 раза больше, чем в культуре К 1 (рис. 3).
Таким образом, культура дрожжей, со-
держание эргостерина в клетках которой было выше (К 1), была более устойчива к действию таких стрессорных факторов, как осмотический и температурный шок. Исходя из этих данных, можно предположить, что фенобарбитал, индуцируя накопление эргостерина в клетках дрожжей, может опосредованно приводить к повышению устойчивости культуры к воздействию стресс-факторов.
60
40
Кол-во мертвых клеток,
°° 20
\м_
■ К 2 □ К 1
30 60
Длительность воздействия, мин.
80
Кол-во 60
мертвых
клеток. 40
%
20
0
1
Л1
■ К 2 □ К 1
30 60
Длительность воздействия, мин.
*
*
*
0
с
Рис. 2. Количество мертвых клеток в культуре 8. сегеу1з1ае с разным накоплением эргостерина после теплового шока
Исследование динамики роста популяции клеток в присутствии фенобарбитала в среде культивирования дрожжей показало снижение интенсивности роста культуры на 23% и 29% к 7 и 10 суткам соответственно. Существенного различия в динамике накоп-
Рис. 3. Количество мертвых клеток в культуре 8. сегеу181ае с разным накоплением эргостерина после осмотического шока
ления мертвых клеток в контроле и опыте не наблюдалось (рис. 4). Нами не было обнаружено и существенных морфологических изменений клеток дрожжей в условиях эксперимента (рис. 5).
20
□ Контроль — ФБ
4 7 10 14 16
Продолжительность культивирования, сут.
Рис. 4. Количество мертвых клеток в культуре ЗассЬаготусев сегеу1з1ае при росте на среде, содержащей фенобарбитал,
на различных этапах культивирования
Контроль Фенобарбитал
Рис. 5. Клетки дрожжей ЗассЬаготусез сегеу1з1ае, культивируемые на среде с фенобарбиталом (ФБ) (увеличение в 600 раз)
0
Измерения интенсивности потребления кислорода в культуре дрожжей на 7, 10, 14 и 16 сутки роста культуры не показали достоверных различий. Интенсивность потребления кислорода в культуре, растущей на среде с фенобарбиталом, оставалась на уровне контроля.
ВЫВОДЫ
Таким образом, на основании полученных нами данных можно полагать, что фенобарбитал в исследованной концентрации, суще-
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
ственно не влияя на морфологию, смертность и интенсивность дыхания клеток культуры дрожжей, может стимулировать накопление эргостерина в клетках, изменяя тем самым их стресс-устойчивость. Этот факт может свидетельствовать о том, что продолжительное использование препаратов, содержащих фенобарбитал, на фоне терапии кандидозов и микозов может оказывать определенное влияние на ход лечения этих заболеваний.
Henry K.W., Nickels J.T., Edlind T.D. // Antimicrob. Agents & Chemother. - 2000. - Vol. 44. - P. 26932700.
Mercer E.I. // Lipids. - 1991. - Vol. 26. - P. 584-597.
Ma D. // Progress in Drug Research. - 2001. - Vol. 57. - P. 45.
Hasenoehrl A. // 41st Interscience Conference on Antimicrobal Agents and Chemotherapy (ICAAC), 1619 Dec. 2002, Chicago, IL, USA.-Abstract 2143. '
Dorrell S. // Drug Discovery Today. - 2002. - Vol. 7. - № 6. - P.332-333.
Turi T.G., Loper J.C. // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267. - P. 2046-2056.
Wright G.D.,HonrkJ.F. //J. Bacteriol. - 1991. - Vol. 173. -№3. -P. 1035-1040.
Nose H., Fushimi H., Seki A., et al //J. Antibiot. (Tokio). - 2002. - Vol. 55. - № 11. - P. 969-974. Komissarova I.A., Nartsissov Y.R. //Bull Exp Biol Med. - 2001. - Vol. 131. - № 4. - P. 330-332.
10. Квасников Е.П., Щелокова И.Ф. Дрожжи: Биология. Пути использования. -К.:Наукова думка. -1991. - 328с.
11. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н. Методики по генетике дрожжей-сахаромицетов.-Л:Наука. - 1976. - 95 с.
12. Seglen P.O. //Meth. Cell Biol. - 1976. - Vol. 13. - P. 29-33.
13. Woods R.A. // J. Bacteriol. - 1971. - Vol. 108. - P. 69-71.
14. Яхимович P.И. Химия витаминов Д. -К.:Наукова думка. - 1978. - 248 с.
15. Андреищева Е.Н., Звягильская Р,А. // Прикл. биохим. и микроб. - 1999. - Т. 35. - № 3. - С. 23-256.
16. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М. и др. // Микробиология. - 2001. - Т. 70. - вып. 4. - С. 531-535.
17. Albertyn J., Hohmann S., Threvelem J.M., et al//Mol. and Cell.Biol.- 1994. - Vol. 14,- №6,- P.4135-4144.
18. Аливердиева Д.А. //Прикл. биохим. и микробиол. - 2001. - Т. 37. - № 1. - С. 90-95.
19. Зеленский М.И. Полярографическое определение кислорода в исследованиях по фотосинтезу и дыханию. -Л:Наука. - 1986. - 140 с.
20. Miller G.I. //Anal. Chem. - 1959. - Vol. 31. - № 5. - P. 964-966.
21. Михайлова Н.П., Вьюнов К.A. // Усп. соврем, биологии. - 1984. - Т.104. - вып 1(4). - С. 89-104.
22. Вентыря Э.Ю., Саулите JL А, Рапопорт А.П., и др. //Микробиология,- 1986.-Т.55. - в.1.-С.116-119.
23. Barton D.H., Come I.F., Bard М., et al//J. Chem. Soc. - 1974. -Vol. l.-P. 1326-1333.
24. Физиологическая регуляция метаболизма дрожжей / Под ред. М.Ф. Залашко. -Мн.:Навука и
тэхника. - 1991. - 332 с.
25. Гальцова Р. Д. Стеринообразование у дрожжевых организмов. -М.:Наука. -1980. - 224 с.
26. Daum G., Lees N.D., Bard М., Dixon R. //Yeast. - 1998. - Vol. 14. - P. 1471-1510.
27. Stolz J., Sauer N. //J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 247. -№26. - P. 18747-18752.
28. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. -М.:Наука. - 1982,- 56 с.
29. Hees-Peck A., PichlerH., Zanolan В., et al //Mol. Biol. Cell. - 2002. - Vol. 13. - P. 2664-2680.
30. Andreasen A.A., Stier T.J.B. // J. Cell Comp. Physiol. - 1953. - Vol. 41. - P. 23-26.
31. Синицкая H.A., Огородникова T.E., Михайлова Н.П. // Прикл. биохим. и микробиол. - 1993. - Т. 29. - вып. 5. - С. 675-684.
32. Робышева З.Н. // Итоги науки: Сер. вирусология и микробиология. - 1972. - Т.З. - С. 56-69.
33. Касумов А.Х. //Усп. совр. биологии. - 1977. - Т.83. -№ 1. - С. 23-37.
МОЖЛИВИЙ ВПЛИВ ФЕНОБАРБІТАЛУ НА ЕФЕКТИВНІСТЬ ТЕРАПІЇ ГРИБКОВИХ ІНФЕКЦІЙ
І.С. Леонова, В.І. Падалко
НДІ біології Харьківського національного університету імені В.Н. Каразіна, Україна
РЕЗЮМЕ
Досліджено, що фенобарбітал, істотно не впливаючи на морфологію, загибель клітин та інтенсивність дихання культури, може стимулювати накопичення ергостерину у клітинах культури, змінюючи таким чином їхню стрес-стійкість. Цей факт може свідкувати про те, що тривале використання лікарських засобів, що містять фенобарбітал, при кандидозах та мікозах може впливати на ефективність препаратів, що використовуються.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: дріжджі, ергостерин, фенобарбітал.
POSSIBLE INFLUENCE of FENOBARBIYAL ON EFFICIENCY OF THERAPY OF FUNGAL INFECTIONS
I.S. Leonova, V.I. Padalko
Scientific research institute of biology of V.N.Karazin Kharkov National University, Ukraine
SUMMARY
Fenobarbital was found out essentially not influencing morphology, death rate of cells and intensity of breath of cells culture. Fenobarbital can stimulate accumulation of ergosterol in cells of culture, changing their stress-stability. This fact can testify that long use of the preparations containing fenobarbital, at fungal infections can influence a course and treatment of diseases.
KEY WORDS: yeast, ergosterol, fenobarbital
УДК: 615.361.811.014:616.36-004.4
ВЛИЯНИЕ СОВМЕСТНОГО ВВЕДЕНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ И ГОЛОВНОГО МОЗГА НА ТЯЖЕСТЬ
