CC BY
29
ные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного интервала (ИКИ), качественные признаки — в виде относительной частоты и 95% доверительного интервала (ДИ).
Результаты наших исследований показали, что у больных с острым (45 человек) и хроническим (108 человека) гайморитами хламидийная инфекция была выявлена соответственно у 16 (36 %, 95% ДИ 22 — 50 %) и у 28 человек (26,6 %; 95% ДИ 17,7 — 34,2).
При сравнении гематологических и иммунологических показателей у больных с острым гайморитом независимо от наличия или отсутствия хламидийной инфекции статистически значимых различий получено не было.
При сравнении с контролем в обеих группах больных были обнаружены однонаправленные изменения лабораторных показателей. Так, у лиц с острым синуситом наблюдались лейкоцитоз (р = 0,002), относительные эозинофилия (р < 0,001) и лимфопения (р = 0,01). У больных с неподтвержденной хламидийной инфекцией имело место снижение абсолютной концентрации CD3+Т-лимфоцитов (р = 0,04) и повышение относительных и абсолютных показателей CD72+ В-лимфоцитов (р = 0,01).
При сравнении больных с хроническим гайморитом, ассоциированным и неассоциированным с хламидийной инфекцией, было выявлено значительно больше различий. У больных с наличием хламидий имело место снижение относительных показателей CD3 + Т-лимфоцитов и CD4 + Т-лим-фоцитов (р < 0,001) и повышение относительной величины CD16 + -лимфоцитов (р = 0,01), а так же фагоцитарного числа (р = 0,05) и индекса (р = 0,01). Концентрация отдельных классов иммуноглобулинов в обеих группах также статистически значимо различались между собой. Так, у лиц с идентифицированной хламидийной инфекцией концентрация 1дА была значительно ниже, чем у больных с отрицательными результатами анализов на хламидийный возбудитель (соответственно Ме1 = 200 МЕ/мл, Ме2 = 230 МЕ/мл. р = 0,05). Содержание 1дМ также было ниже у больных с хламидийной инфекцией (соответственно Ме1 = 180 МЕ/мл, Ме2 = 255 МЕ/мл, р = 0,007).
По сравнению со здоровыми лицами в обеих группах наблюдались лейкоцитоз (р < 0,001), эозинофилия (р < 0,001), снижение относительной доли лимфоцитов (р = 0,02), повышение относительных и абсолютных показателей CD72 + Т-лимфоцитов (р = 0,01).
Только при сравнении здоровых лиц с группой больных с идентифицированной хламидийной инфекцией отмечалось повышение относительного содержания сегменто-ядерных лимфоцитов (р = 0,02), CD3 + Т-лимфоцитов (р = 0,02), CD4 + Т-лимфоцитов (р = 0,002) и CD16 + Т-лимфоцитов (р = 0,05).
Таким образом, у больных с воспалительными заболеваниями гайморовых пазух хламидийная инфекция была выявлена у трети лиц. При острых воспалительных процессах в верхнечелюстных пазухах иммунный ответ на вне- и внутриклеточные микробные агенты был идентичен. У инфицированных и неинфицированных хламидиями больных хроническим гайморитом, несмотря на наличие ряда однотипных реакций иммунной системы, при хламидийном заражении наблюдается более выраженное угнетение клеточного и гуморального звеньев иммунитета.
Е.В. Персиянова', К.В. Киселев2, Г.К. Чернодед2
ВОЗДЕЙСТВИЕ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS И ИХ ТОКСИНОВ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ PG-PAL И PG-GLU1 В КАЛЛУСАХ ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО PANAXGINSENG C.A. MEY
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Владивосток) 2 Биолого-почвенный институт ДВО РАН (Владивосток)
Существенную роль в экологии бактерий псевдотуберкулеза — возбудителя сапронозов, и в эпидемиологии вызываемой ими инфекции играют растения. Микроорганизмы часто обнаруживаются на растительных субстратах, они размножаются на овощах и корнеплодах, а также в овощных соках, салатах при пониженной температуре (Сомов Г.П., 1979; Кузнецов В.Г., 1997). К настоящему времени имеются сведения о том, что между бактериями псевдотуберкулеза и растительными клетками развиваются сложные взаимоотношения (Тимченко Н.Ф. и соавт., 2004). С одной стороны, микроорганизмы реализуют патогенный потенциал (инвазивный и токсический), с другой — выявлено стимулирующее и ингибирующее воздействие растительных клеток на рост иерсиний. Однако сведений о взаимоотношениях между иерсиниями и растениями на молекулярном уровне мы не обнаружили.
Чтобы узнать ответную реакцию клеток растений на воздействие бактерий псевдотуберкулеза и их токсинов нами была изучена экспрессия защитных генов на примере клеток женьшеня, потому что из существующих растений в группе биоинженерии БПИ ДВО РАН защитные гены данного вида лучше всего изучены. Для подтверждения активации защитных реакций растений чаще всего исследуют экспрессию защитных белков: PR («pathogen-related») белков (Leubner-Metzger and Meins, 1999). На-
232
Межрегиональная научно-практическая конференция молодик ученых...
пример, фенилаланинаммиаклиаза (PAL) — один из основных ферментов, участвующий в синтезе фитоалексинов, защитных метаболитов растений, или глюканаза (GLU), фермент, участвующий в расщеплении полисахаридов, основных компонентов внешних покровов грибов и насекомых — массовых вредителей растений. Экспрессия данных ферментов многократно возрастает при активации защитных реакций и поэтому, нами были выбраны именно они. Ввиду этого, целью работы явилось изучение действия Y.pseudotuberculosis и их токсинов на экспрессию генов PG-PAL и PG-GLU1 в каллусах женьшеня Panax ginseng C.A.Mey.
На каллусы женьшеня в конце пассажа (на 30 день) наносили по 20 мкл термолабильного и термостабильного летальных токсинов и бактерий в концентрациях 60 мкг/мл, 2,5 мг/мл, 105 бактерий/мл соответственно. В качестве контроля наносили стерильный 0,85% раствор NaCl. Токсины выделяли из бактерий псевдотуберкулеза (штаммы 512 I серовар и 2517 III серовар) согласно методам (Тимченко Н.Ф. и соавт., 2004). Каллусы инкубировали в течение трех суток при температуре 23-250С. Для анализа дифференциальной экспрессии генов PAL и GLU в каллусах женьшеня линии GV под влиянием патогенных агентов на 1 и 3 сут эксперимента из растительных клеток выделяли тотальную РНК с помощью набора Yellow Solve (Силекс, Россия). Комплементарную ДНК (кДНК) получали, используя 1—3 мкг тотальной РНК, с помощью набора для обратной транскрипции с M-MLV ревертазой по рекомендациям производителя (Силекс, Россия). Реакцию обратной транскрипции проводили при 37 °С в течение 1—2 часов. Затем образцы кДНК (0,2 — 2 мкл) амплифицировали с использованием праймеров к гену актина женьшеня и дегенеративных праймеров к генам PAL и GLU. ПЦР проводили согласно методу (Kiselev et al., 2006; Bulgakov et al., in press). Интенсивность полученных сигналов обсчитывали в программном обеспечении гель документирующей системы (GEL DOC BIORAD, США). Обсчет и нормализацию по актину проводили по методу (Kiselev et al., 2006).
Важно отметить, что гены PAL растений — это мультигенное семейство, состоящее из около 30 — 40 генов (Cramer et al., 1989). Еще нет полного понимания в регуляции и функционирования генов PAL для основных модельных объектов, которые используются в молекулярной биологии растений. Например, для арабидопсиса Arabidopsis thaliana все гены PAL формируют 4 подсемейства, они отличаются по своим биохимическим свойствам, предполагается, что они участвуют в разных метаболических реакциях, иногда беря на себя функции первичного метаболизма, что не связано с защитными реакциями (Cochrane et al., 2004). Ранее не было данных о формах PAL женьшеня, поэтому на основе известных генов PAL растений нами сконструированы дегенеративные праймеры, которые работали бы со всеми возможными генами PAL женьшеня. Результаты секвенирования ПЦР продуктов, полученных с кДНК женьшеня, показали наличие около 30 генов PAL женьшеня, все они по аминокислотной последовательности формировали 3 подсемейства. Мы назвали их в порядке секвенирования: Pg-PAL1, Pg-PAL2, Pg-PAL3. Генов глюканаз меньше по числу существующих форм, но они также могут существовать в нескольких формах в геноме растений. Поэтому нами сделаны дегенеративные праймеры по известным формам глюканаз растений. Анализ секвенированых ПЦР продуктов с кДНК женьшеня показал, что в культурах женьшеня в основном экспрессируется только одна форма — Pg-Glu1. Доказано, что экспрессия этой формы увеличивается при стрессовых воздействиях, и поэтому ее отнесли к PR белкам (Kiselev et al., 2006).
Исследования показали, что уже в 1 сут. в клетках женьшеня при воздействии Y. pseudotuberculosis и термолабильным токсином наблюдалась повышенная экспрессия генов PAL. Экспрессия возрастала в 2 — 4 раза по сравнению с контролем. Повышенная экспрессия генов PAL сохранялась и на 3 сут. воздействия иерсиний. Больше всего возрастала экспрессия генов подсемейства Pg-PAL2, что, возможно, говорит о большей ее роли в синтезе защитных фитоалексинов. Также достоверно (в 2 — 3 раза), по сравнению с контролем, возрастала экспрессия глюканазы Pg-glu1 в 1 сут. эксперимента. Повышенная экспрессия гена Pg-glu1сохранялась и на 3 сут. воздействия иерсиний.
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что растительные клетки узнают патогенное воздействие Y.pseudotuberculosis и отвечают активацией своих защитных механизмов.
В.К. Покровский
ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ТЕРМОЛАБИЛЬНОГО ЛЕТАЛЬНОГО ТОКСИНА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Владивосток)
К настоящему времени есть сведения о нескольких белковых токсинах Y.pseudotuberculosis: термолабильном и термостабильном летальных белковых токсинах (ТлТYp| ТсТYp)| цитотоксине YopE, суперантигене YPM, факторах, нарушающих проницаемость сосудов кожи — PF-раннем и PF-позднем, ци-
Мeжpeгиoнaльнaя нayчнo-пpaктнчecкaя ганференция raoao^ix ученых...
233
