ВОЗДЕЙСТВИЕ ИМПУЛЬСНОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ ВЫСОКОЙ НАПРЯЖЕННОСТИ НА ДЕРМАЛЬНЫЕ ФИБРОБЛАСТЫ ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК 61.612

ВОЗДЕЙСТВИЕ ИМПУЛЬСНОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ ВЫСОКОЙ НАПРЯЖЕННОСТИ НА ДЕРМАЛЬНЫЕ ФИБРОБЛАСТЫ ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ

© 2020 В.А. Глущенков1-3, Л.Т. Волова2, И.А.Беляева1, В.В. Болтовская2, В.В. Россинская2 , А.И. Игнатенко1, И.Ф. Нефедова2, Л.Н.Кулагина2

1 Самарский национально-исследовательский университет имени академика С.П. Королёва,

г. Самара, Россия

2 Институт экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ, Самара, Россия 3 Самарский федеральный исследовательский центр Российской академии наук, Самара, Россия

Статья поступила в редакцию 12.10.2020

Изучено влияние импульсных магнитных полей (ИМП) с различными значениями напряженно-стей магнитного поля H, частоты разрядного контура f, количества импульсов n на дермальные фибробласты in vitro. Созданы специализированная магнитно-импульсная установка «МИУ-Био», измерительный стенд для создания и контроля заданных параметров ИМП. Проведено четыре серии экспериментов с продольным и поперечным воздействием ИМП при напряженности магнитного поля 3,76-106 - 8,7-106 А/м (500 и 1000 Дж) Установлено, что продольное воздействие ИМП в 500 Дж не приводит к гибели клеток и сохраняет их все структурные компоненты, является безопасным для первичных культур фибробластов. При использовании импульсных магнитных полей высокой напряженности (ИМП ВН) 1000 Дж как в продольном, так и в поперечном направлении приводит к нарушению адгезии клеток к культуральному пластику и изменениям в структуре дермальных фибробластов, вплоть до их гибели.

Ключевые слова: импульсное магнитное поле высокой напряженности, факторы воздействия: напряженность, частота, количество импульсов, дермальные фибробласты, морфология клеток. DOI: 10.37313/1990-5378-2020-22-5-14-22

ПОСТАНОВКА ВОПРОСА

Современная медицина требует новых подходов к диагностике и лечению социально значимых заболеваний. При этом на первый план выдвигается использование неинвазивных технологий, что может существенно улучшить результаты лечения и повысить качество жизни пациентов. В частности, в регенеративной медицине возрастает роль неинвазивных методов, связанных с использованием магнитных

Глущенков Владимир Александрович, кандидат технических наук, профессор кафедры обработки металлов давлением. E-mail: vgl@ssau.ru

Волова Лариса Теодоровна доктор медицинских наук, профессор. E-mail: volovalt@yandex.ru Беляева Ирина Александровна, кандидат технических наук, доцент. E-mail: belyaeva-ommr@yandex.ru Болтовская Виолетта Викторовна, кандидат медицинских наук. E-mail: violetta.boltovskaya@yandex Россинская Виктория Викторовна, кандидат медицинских наук, доцент. E-mail: rossinskaya_v_v@mail.ru Игнатенко Александр Ильич, инженер-конструктор НИЛ-41, E-mail: mc-alexsandro@bk.ru Нефедова Ирина Феликсовна, научный сотрудник Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ. E-mail: bobrovka2012@yandex.ru Кулагина Лариса Николаевна главный специалист биотехнологического отдела Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ. E-mail: LnKulagina07@mail.ru

полей в лечебной практике. В настоящее время широко применяются постоянные, переменные и импульсные магнитные поля (ПМП, ПеМП и ИМП) с невысокими значениями магнитной индукции (до 100 мТл) [1-5]. По мнению большинства авторов [6-10], в основе биологического и лечебного действия магнитных полей лежат изменения в состоянии клеточных мембран, ферментативных и рецепторных молекул, повышением проницаемости плазмо-леммы клеток.

Магнитные поля широко применяются в технике, но их параметры значительно отличаются от используемых в медицине. В последнее время на машиностроительных предприятиях внедрены процессы магнитно-импульсной штамповки, сборки, сварки [11]. Источником импульсных магнитных полей (ИМП) в этих процессах является индуктор [12], соединённый с магнитно-импульсной установкой (МИУ) [13]. В процессе разряда батареи конденсаторов МИУ на индуктор, в образованной таким образом разрядной цепи, протекает ток, характер изменения которого показан на рисунке 1.

Из приведенных осциллограмм видно, что характер протекающего тока зависит от сопротивления разрядной цепи: периодический разряд - затухающая синусоида или апериодический разряд.

(а)

LeCrov

7.5 кВ

(б)

17 L^Crov

/ \

\

ваш JOOW ЛЛ mVaT »t|**b|[ftc* .« »V |l Икб limy

Рис. 1. Осциллограмма разрядного тока при использовании: (а) - одновиткового индуктора (б) - многовиткового индуктора

Интенсивность магнитного поля зависит от

си2

количества энергии Ш = —-— , запасённой в

батарее конденсаторов магнитно-импульсной установки, которая для используемых индукторов определяет уровень напряженности. В таблице 1 представлены значения параметров ИМП наиболее часто используемых в технике.

Видно, что параметры ИМП получаемых в технике, при токах в разрядной цепи 10-100 кА, на порядки отличаются от значений, которые используются в цитируемых выше медицинских работах.

Целью данного исследования является изучение воздействия импульсного магнитного поля высокой напряженности на культуру дер-мальных фибробластов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Техническая составляющая. На рисунке 2 представлены схемы воздействия ИМП на клеточную культуру дермальных фибробластов человека. С помощью датчиков Холла получены картины распределения магнитного поля «Я» в двух координатах. Параметры используемой магнитно-импульсной установки приведены в таблице 2.

На рисунке 3 представлен внешний вид индукторов.

Эксперименты проводились при № = 500 Дж и 1000 Дж. Осциллограммы напряженности магнитного поля при № = 1000 Дж представлены на

рисунке 4. Частотные характеристики индуктора с замкнутым контуром и плоского индуктора составляют 18,9 кГц и 19,7 кГц соответственно, что находится в одном диапазоне частот.

Биологическая составляющая. Научное исследование воздействия магнитно-импульсной установки «МИУ-Био» было проведено на культуре дермальных фибробластов человека 7-го пассажа.

Забор первичного материала (биоптатов кожи) для выращивания культуры фибробластов производили у соматически здоровых и обследованных доноров после получения добровольного информированного согласия и одобрения Комитетом по биоэтике при СамГМУ. Фибро-бласты выращивали по методике первичных эксплантатов (К.Н. Гринберг и соавт., 1988) [14].

Для проведения эксперимента фибробласты снимали со дна культурального флакона стандартным методом и высевали в культуральные чашки Петри диаметром 3,5 см в дозе 1х104 кл./ см2. Культивирование проводили в условиях СО2-инкубатора (Sanyo - Incubator, МСО-18АС, Япония) при температуре 37°С, 5% СО2 и постоянной влажности в полной ростовой среде (среда 199 - 90%, эмбриональная телячья сыворотка - 10% (ООО «БиолоТ», РФ), гентамицин - 40 мкг/мл). Количество чашек - 40. По достижению клетками конфлуентного монослоя чашки были разделены следующим образом: 2 опытные серии (в каждой по 16 чашек) и 2 контрольные серии (в каждой по 4 чашки, на которые не было оказано воздействие магнитным полем); опытные серии делили на 2 подгруппы соответствен-

Таблица 1. Параметры импульсных магнитных полей, используемые в технике

H, А/м f, кГц t, c

(0,2- 10,0) ■ 106 10-100 10-4-10-5

Вектор магнитного поля напраэпек вдоль витков индуктора

Im

Распределение магнитного поля по ширине витка Кювета Индуктор

■20 .10 о 10 20

Расстояние :т оси (им)

Вектор магнитного поля направлен вдоль витков индуктора

Кювета с образцами

а)

Вектор магнитного поля - Hm (направлен вертикально)

Кювета с образцами

Относ/тел&ное распределение наивною лагя по ширине ин:ттора

-20 -15 -10 -5 0 6 10 1S го Рассеяние от оси (ыч)

б)

Рис. 2. Схемы воздействия ИМП на клеточную культуры дермальных фибробластов (а - индуктор с замкнутым контуром, б - плоский индуктор)

но энергии облучения. В 1 серии воздействие магнитным полем оказывали в продольном направлении, во 2 серии - в поперечном. Опытные чашки подвергали однократному облучению магнитно-импульсным полем при энергиях 500 Дж и 1000 Дж. Длительность наблюдения составляла 48 часов после воздействия ИМП ВН.

Проводили наблюдение за состоянием клеток в монослое и фотографирование их при помощи аппаратно-программного комплекса (АПК), состоящего из инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 («Olympus», Япония), цветной цифровой камеры Olympus SC100 («Olympus», Корея) и стационарного компьюте-

Таблица 2. Параметры магнитно-импульсной установки «МИУ-Био»

Запасаемая энергия W, кДж Напряжение разряда U, кВ Собственная частота разрядного тока f, кГц Со, мкф Lo, мкГн

1 1 - 5 60 82 0,09

Индуктор с замкнутым контуром „

Плоским индуктор

Рис. 3. Внешний вид индукторов с размещенной чашкой Петри

1 1 Г LeCroy

; / M 1 ЯШ

lu ж \ JT

к. А

1

__1_____

1 _1______

1 J_

iHv^i idïlYoriSf

13и СИЩ

20.С inj** Яор .7AI r^v

ВОН ¡SES*

ess us да u.TMus КЗ* £1346 us 1.ЩХ- 13.964 S KHz

a)

4 i; ^Akr, 1 I LeCrov

1 I

1 1

1 1

> I

1 _1_

Cl TViffT

IHVAJh

ÙmVeflise

i 80 mV

r -4ü mV

Л,

Tmrtutt -i» 6 u: Trw

ËÛÛ kt ÎSÙËJa Stop JWSiaV

XI =. 37.44*4 ps № 60.TÇ0i|JS Xî* в8 204Ву£ 1ftK* iSNMHfrKb

6)

Рис. 4. Осциллограммы напряженности магнитного поля (а - индуктор с замкнутым контуром, б - плоский индуктор)

ра. Для обработки изображений использовали программное обеспечение CellSens Standart 1.7 («Olympus Corporation», Япония). Непосредственно перед началом воздействия, а затем в конце эксперимента монослой окрашивали суданом IV и гематоксилином для общеморфологического анализа и витальными красителями для выявления жизнеспособных и поврежденных клеток (трипановый синий и флуоресцентный набор LIVE/DEAD ® (Invitrogen, США)). Ана-

лиз изображений окрашенных препаратов производили с помощью системы визуализации на основе исследовательского люминесцентного микроскопа Leica DMIL LED (Германия) с флуоресцентным блоком.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При осмотре контрольных чашек: монослой равномерный, характер роста в виде завит-

ков (рис. 5а). Клетки близко расположены друг к другу, имеют 2-3 отростка. Форма клеток веретенообразная, контуры четкие, цитоплазма гомогенная, слабо оксифильная. Ядра расположены в основном эксцентрично, содержат 2-3 ядрышка (рис. 5а), выявлены делящиеся клетки (рис. 5б). При окрашивании клеток витальным красителем трипановым синим все клетки прозрачные (жизнеспособные), окрашенных в синий цвет (поврежденных) не выявлено (рис. 5в). При обработке монослоя флуоресцентным набором LIVE/DEAD ® клетки приобрели зеленое свечение, что подтверждает их жизнеспособность; клетки со светящимся красным ядром единичные (рис. 5г).

Серия 1а. Воздействие ИМП ВН, продольное направление, напряженность магнитного поля 3,76 106 А/м (500 Дж)

При однократном воздействии магнитным полем в продольном направлении с энергией 500 Дж через 48 часа отмечено, что клетки изменили свое расположение на дне культурального пластика в результате воздействия силовых линий магнитного поля (рис 6а). Клетки сохранили свои характерные морфологические особенности, но стали более вытянутыми. Контуры клеток четкие, цитоплазма гомогенная (рис. 6 б).

Соотношение жизнеспособных и поврежденных клеток соответствовало таковому в контрольной культуре (рис. 6в, 6г).

* Ь ' 4 * I J i К \

. " и . ,,11 о;

• „. ■ <„ > t '! Л

/ ,4 , I > > , I1' .. I »

j' ! -я,., t f • .A', > >.-

» ■ -V " /V .{. " *• ' ' S- ! «'/, ' ' . ' . " '

'»•^îvjV/y, ' / V1" :t,

I .. .V< j ' " ' , ' 1

Серия 1б. Воздействие ИМП ВН, продольное направление, напряженность магнитного поля 4,42 106 А/м (1000 Дж.)

При продольном воздействии ИМП ВН с энергией 1000 Дж через 48 часов на дне чашки зафиксировано смещение клеток в монослое по ходу воздействия магнитного поля (рис. 7а), в клетках при обзорной окраске суданом IV и гематоксилином выявлены поврежденные клетки с разрушенными ядрами (кариопикноз, карио-рексис) (рис.7б). При окраске монослоя трипа-новым синим, были обнаружены поврежденные клетки, окрашенные в синий цвет (рис.7в). При обработке монослоя флуорофорами отмечали большое количество ядер с красной люминесценцией, что свидетельствовало об их повреждении (рис. 7г).

Серия 2а. Воздействие ИМП ВН поперечное направление, напряженность магнитного поля 7,1106 А/м (500 Дж)

При поперечном воздействии при 500 Дж через 48 часов при осмотре клеток в монослое наблюдали изменение характера роста клеток с изменением геометрического рисунка (рис.8а). При обзорных окрасках отметили, что клетки п стали более вытянутыми, отростки были длиннее, чем в контрольной серии. В некоторых клетках наблюдали зернистость цитоплазмы и просветление вокруг ядер (рис.8б). При окраске

• I $1 t

¥ .

/. / Л

/ / . %

' 9 »

/ é

Рис. 5. Контроль. Культура дермальных фибробластов. Сформированный равномерный монослой через 48 часов после посева. Окраска суданом IV и гематоксилином: а - характер роста фибробластов в монослое. Увеличение 100, б - делящаяся клетка отмечена стрелкой, увеличение 400; в - жизнеспособные клетки в монослое. Окраска трипановым синим. Увеличение 100. Инвертированный микроскоп; г - флуоресцентое окрашивание набором LIVE/DEAD®. Люминесцентный микроскоп увеличение 100

Рис. 6. Опыт. Культура дермальных фибробластов через 48 часов после продольного воздействия ИМП ВН с энергией 500 Дж. Окраска суданом IV и гематоксилином: а - выстраивание клеток под воздействием магнитных силовых линий, увеличение 100; б - морфологическая картина клеток после воздействия, увеличение 400; в - окраска трипановым синим, инвертированный микроскоп увеличение 100; г - флуоресцентое окрашивание набором LIVE/DEAD®. Люминесцентный микроскоп. увеличение 100

Рис. 7. Опыт. Культура дермальных фибробластов через 48 часов после п родольного воздействия ИМП ВН с энергией 1000 Дж: Окраска суданом IV и гематоксилином: а - смещение клеток в монослое под воздействием силовых линий, увеличение 100; б - морфологические изменения клеток, увеличение 400; в - окраска трипановым синим (поврежденные клетки отмечены стрелками). Инвертированный микроскоп увеличение 100; г - флуоресцентое окрашивание набором LIVE/DEAD ® (поврежденные клетки отмечены стрелками).

Люминесцентный микроскоп, увеличение 100

трипановым синим выявляли поврежденные клетки, окрашенные в синий цвет (рис. 8в). Обработка монослоя флуоресцентным красителем позволила обнаружить выявить погибшие клетки с красной люминесценцией ядер (рис. 8г).

Серия 2б. Воздействие ИМП ВН поперечное направление, напряженность магнитного поля 8,7106 А/м (1000 Дж)

При воздействии ИМП ВН энергией 1000 Дж в поперечном направлении в момент облучения крышка чашки Петри лопнула. Через 48 часов при окраске монослоя суданом IV и гематоксилином были обнаружены коагуляцион-ные участки в виде темных клубков с хаотично расположенными клетками, границы которых не визуализировались (рис. 9а). Большинство фибробластов в монослое деформированы, в их цитоплазме наряду с плотными имеются разряженные участки. Контакты между клетками нарушены. Также на поверхности культураль-ного пластика можно видеть фрагменты цито-

> I * •

.- . ** / / /

плазмы, лишенные ядер и обрывки отростков. В клетках ядра деформированы, визуально плотные, структура их не однородная, ядрышки отсутствовали (рис. 9б). Получить изображения клеток с помощью витальных красителей (трипановым синим и набором LIVE/DEAD®) не удалось, так как клетки в результате пробоподго-товки были смыты со дна культуральных чашек, что свидетельствовало об ослаблении адгезии клеток к культуральному пластику под действием данного режима.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках данной работы были спроектированы специализированная магнитно-импульсная установка и измерительный стенд, позволившие получить ИМП с разными параметрами воздействия. Разработаны и опробованы схемы воздействия ИМП на клеточную культуру дер-мальных фибробластов с использованием индукторов различных конструкций, для которых была получена топология поля.

//

. * . л щ * Г

1 • **

Рис. 8. Опыт. Культура дермальных фибробластов через 48 часов после поперечного воздействия

ИМП ВН с энергией 500 Дж: Окраска суданом IV и гематоксилином: а - выстраивание клеток в монослое под воздействием силовых линий магнитного поля, увеличение 100;

б - морфологические изменения клеток (участки зернистости цитоплазмы отмечены стрелкой), увеличение 400; в - окраска трипановым синим (поврежденные клетки отмечены стрелками). Инвертированный микроскоп, увеличение 100; г - флуоресцентое окрашивание набором LIVE/DEAD® (поврежденные клетки отмечены стрелками).

Люминесцентный микроскоп, увеличение 100

а

Рис. 9. Опыт. Культура дермальных фибробластов через 48 часов после поперечного воздействия

ИМП ВН с энергией 1000 Дж: а - появление коагуляционных участков монослоя (отмечен стрелкой), увеличение 100; б - морфофункциональные изменения клеток (разрывы цитоплазмы и ядер указаны стрелками), увеличение 400.

Окраска суданом IV и гематоксилином.

По результатам экспериментов установлено: Факт влияния импульсного магнитного поля высокой напряженности на биологический объект, а именно культуру дермальных фибробластов;

Воздействие ИМП ВН в продольном направлении при энергии 500 Дж не вызывает повреждения структуры фибробластов в культуре. Данный режим является безопасным для здоровых первичных культур клеток;

При поперечном воздействии как при 500 , так и при 1000 Дж имеет место повреждение данной популяции клеток вплоть до их гибели;

Намечены пути модернизации магнитно-импульсных установок, с целью управлениями параметрами воздействия ИМП на культуры клеток

БЛАГОДАРНОСТЬ

Авторы выражают благодарность Юсупову Р.Ю. за помощь в реализации технической составляющей данной статьи

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Пономаренко Г.Н. Общая физиотерапия: Учебник. // Москва издат. Группа «ГЭОТАР-Медиа», 2012. -368 с.

2. Улащик В.С. Общая физиотерапия: Учебник. 3-е изд. - Мн.: Книжный дом, 2008. - 512 с.

3. Улащик В.С. Магнитотерапия. теоретические основы и практическое применение. Минск: Бела-русская навука, 2015. - 379 с.

4. Куликов А.Г. Применение общей магнитотера-пии в клинической практике: учебное пособие. ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования». - М.: ФГБОУ ДПО РМАНПО, 2017 - 48 с.

5. Общесистемная магнитотерапия в онкологии //

Ю.Л. Рыбаков, Е.В. Кижаев, В.П. Летягин, Т.Г. Николаева // Медицинская физика. - 2005. - №2. - С.70-76.

6. Электромагнитное поле и его влияние на физиологические процессы в организме человека / О.А. Рудыкина, Р.А. Грехов, Г.П. Сулейманова, Е.И. Адамович // Вести. Волгоград. Гос. Унив-та. Сер. 11. Естественные науки. 2016. № 3(17).

7. Перов С.Ю. Исследование функционального состояния отдельных систем организма при воздействии низкоинтенсивного радиочастотного электромагнитного поля // Вестник новых медицинских технологий. 2015. Т.9. № 3.

8. Плетнев А.С. Магнитные поля в экспериментальной и клинической онкологии. Минск: Белорусская наука, 2016. 229 с.

9. Франциянц Е.М. Противоопухолевое действие магнитных полей и их влияние на боль в экспериментальной и клинической онкологии // Исследование и практика в медицине. 2019. Т.6. № 2 С. 86-89.

10. Лечебное применение магнитных полей / Максимов А.В., Кирьянова В.В., Максимова М.А. // Физиотерапия, Бальнеология и реабилитация. 2013. № 3. С. 34-39.

11. Глущенков В.А. Технология магнитно-импульсной обработки материалов. Самара: Издательский дом «Федоров». - 2014. - 208 с.

12. Глущенков В.А. Энергетические установки для магнитно-импульсной обработки материалов»: монография. Самара: Издательский дом «Фёдоров, 2013. 128 с.

13. Глущенков В.А. Индукторы для магнитно-импульсной обработки материалов» : учебное пособие. Самара : Учебная литература, 2013. - 148 с.

14. Гринберг К.Н. Культивирование фибробластов человека для диагностики наследственных болезней // Методы культивирования клеток: Сборник научных трудов. - Л.: Наука, 1988. - С. 250-257.

ACTION OF A HIGH-INTENSITY PULSED MAGNETIC FIELD ON A HUMAN DERMAL FIBROBLASTS IN CULTURE

© 2020 V.A. Glushchenkov13, L.T. Volova2, I.A. Belyaeva1, V.V. Boltovskaya2, V.V. Rossinskaya2, A.I. Ignatenko1, I.F. Nefedova2, L.N. Kulagina2

1 Samara National Research University named after Academician S.P. Korolyov, Samara, Russia 2 Institute of Experimental Medicine and Biotechnology of Samara State Medical University, Samara, Russia 3 Samara Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences, Samara, Russia

The influence of pulsed magnetic fields (PMF) with different values of field intensity H, discharge current frequency f and a number of pulses n on dermal fibroblasts was studied in vitro. A specialized pulse-magnetic installation «PMI-Bio» and a measuring stand for creating and monitoring the specified parameters of the PMF were created. Four series of experiments with longitudinal and transverse action of the PMF at a field intensity of 3.76.106 - 8.7.106 A/m (500 and 1000 J) were carried out. It was found that the longitudinal action of the PMF at 500 J does not lead to cell death, preserves all their structural components, and is safe for primary fibroblast cultures. The use of high-intensity pulsed magnetic fields (HI PMF) at 1000 J in both longitudinal and transverse directions leads to a violation of cell adhesion to the culture plastic and changes in the structure of dermal fibroblasts, up to their death. Key words: high-intensity pulsed magnetic field; impact factors: intensity, frequency, f number of pulses; dermal fibroblasts; morphology of cells. DOI: 10.37313/1990-5378-2020-22-5-14-22

Vladimir Glushchenkov, Candidate of Technical Sciences, Professor of the Department of Metal Forming by Pressure. E-mail: vgl@ssau.ru

Larisa Volova Doctor of Medical Sciences, Professor.

E-mail: volovalt@yandex.ru

Violetta Boltovskaya, Candidate of Medical Sciences.

E-mail: violetta.boltovskaya@yandex

Victoria Rossinskaya, Candidate of Medical Sciences,

Associate Professor. E-mail: rossinskaya_v_v@mail.ru

Irina Belyaeva, Candidate of Technical Sciences, Associate

Professor. E-mail: belyaeva-ommr@yandex.ru

Alexander Ignatenko, Design Engineer SRL-41.

E-mail: mc-alexsandro@bk.ru

Irina Nefedova, Researcher, Institute ofExperimentalMedicine and Biotechnology, Samara State Medical University. E-mail: bobrovka2012@yandex.ru

Larisa Kulagina Chief Specialist of the Biotechnology Department. Institute of Experimental Medicine and Biotechnology, Samara State Medical University. E-mail: LnKulagina07@mail.ru