CC BY
21
УДК 631.417.2:581.132
ВОЗДЕЙСТВИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НА СВЕТОВЫЕ РЕАКЦИИ ФОТОСИНТЕЗА ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
1Д.Т. Габбасова, аспирант, 1Д.Н. Маторин, д.б.н., 1 Л.Б. Братковская, к.б.н., 2А.А. Алексеев, к.б.н.
1Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, e-mail: dilara.gt@yandex.ru 2Северо-восточный федеральный университет, e-mail: aa.alekseev@s-vfu.ru
Проведена оценка влияния гуминовых веществ на световые реакции фотосинтеза микроводорослей Scenedesmus quadricauda с использованием параметров флуоресценции. Установлено, что гуминовые вещества обладают стимулирующим воздействием на рост микроводорослей только в стрессовых ситуациях. Анализ индукционных кривых флуоресценции показал, что гуминовые вещества оказывают некоторое положительное влияние на первичные процессы фотосинтеза. Измерение изменений эффективности процессов фотосинтеза по параметрам индукции флуоресценции является чувствительным методом, который может быть предложен для оценки разрабатываемых для сельского хозяйства гуминсодержащих препаратов.
Ключевые слова: гуминовые вещества, бихромат калия, фотосинтез, флуоресценция хлорофилла, микроводоросли, биотестирование, JIP-тест.
IMPACT OF HUMIC SUBSTANCES ON THE LIGHT REACTIONS OF PHOTOSYNTHESIS IN GREEN MICROALGA SCENEDESMUS QUADRICAUDA
1Ph.D. student D.T. Gabbasova, Dr.Sci. D.N. Matorin, lPh.D. L.B. Bratkovsky, 2Ph.D. A.A. Alekseev
1Moscow State Lomonosov University, e-mail: dilara.gt@yandex.ru 2North-Eastern Federal University, e-mail: aa.alekseev@s-vfu.ru
Assessment of the influence of humic substances on the light reactions of photosynthesis in microalgae Scenedesmus quadricauda using the parameters offluorescence conducted for the first time. It is found that humic substances have a stimulating impact on the growth in microalgae only in stressful situations. Analysis of the induction curves of fluorescence showed that humic substances have some positive influence on primary processes of photosynthesis. Measurement of changes in the efficiency ofphotosynthetic processes by the parameters offluorescence induction is a sensitive method that can be proposed to evaluate humic preparations developing for agriculture.
Keywords: humic substances, potassium dichromate, photosynthesis, chlorophyll fluorescence, microalgae, biotesting, JIP-test.
Гуминовые вещества (ГВ) почв выполняют ряд экологических функций, как в естественных, так и в антропогенных экосистемах [1-4]. Они могут образовывать комплексы с токсикантами, изолировать антропогенные органические соединения, окислять и редуцировать различные токсические формы, замедлять поглощение токсичных соединений и микроэлементов [5]. ГВ могут стимулировать рост растений вследствие усиления проницаемости клеточной мембраны, стимулирования дыхания, фотосинтеза, поглощения кислорода и фосфора [6-10].
Одним из общепринятых индикаторов состояния растительного компонента служит оценка изменений эффективности процессов фотосинтеза в ответ на воздействие окружающей среды. В настоящее время активно развивают флуоресцентные методы, которые позволяют работать нативным способом, т.к. они наиболее быстрые, удобные и информативные среди многих экспериментальных методов используемых для экологического мони-
торинга [11-14]. Нарушения в первичных процессах фотосинтеза непосредственно отражаются в изменении флуоресценции хлорофилла а. Флуоресцентные методы позволяют получить кинетики световой индукции флуоресценции с высоким разрешением и дают подробную информацию о состоянии электрон-транспортной цепи фотосинтеза.
Цель работы - оценка влияния ГВ на световые реакции фотосинтеза зеленых микроводорослей Scenedesmus quadricauda при нормальной и стрессовой ситуации с использованием современных флуоресцентных методов.
Объекты и методы исследования. Для измерения параметров индукции быстрой флуоресценции микроводорослей был использован портативный флуориметр Aqua-Pen-C 100 (Photon Systems Instruments, Чехия). Для количественного анализа характеристик процессов фотосинтеза на основе параметров кинетической кривой индукции флуоресценции был использован так называемый JIP-
тест [13]. JIP-тест использует следующие параметры кривой индукции флуоресценции: интенсивность при 50 мкс (Fo), 2 мс (Fj), 30 мс (Fi), 6 с (Fös), а также Fp (Fm, максимальная интенсивность флуоресценции) и Mo (площадь над кинетической кривой OJIP, но ниже уровня Fm).
Эти измеряемые величины использовали для расчета следующих параметров: Fv = Fm - Fo -максимальная переменная флуоресценция; Fv/Fm -максимальный квантовый выход первичной фотохимической реакции в открытых реакционных центрах фотосистемы II (ФС II): Fv/Fm = фро; Vj = (Fj -Fo)/Fv - относительная амплитуда O-J фазы, отражает количество закрытых реакционных центров (РЦ) по отношению к общему числу РЦ, которые могут быть закрыты; Vi = (Fi - Fj)/Fv - относительная амплитуда J-I фазы, связанная с промежуточным стационарным уровнем восстановления пула пластохинонов; фЕо - квантовый выход электронного транспорта (при t = 0): фЕо = [1 - (Fo/Fm)]*(1-Vj), где Vj = (Fj-Fo)/Fv; DIo/RC = (ABS/RC) - Mo(1/Vj) -общее количество энергии, рассеиваемой одним РЦ в виде тепла, флуоресценции или переноса к другой фотосистеме, при t = 0; ABS/RC - поток энергии, поглощаемый одним активным РЦ, характеризует относительный размер антенны (ABS): ABS/RC = Mo/Vj(1Vo) = (Mo/V j)/[(Fm-Fo)/Fm)] ; PIABS - индекс производительности, показатель функциональной активности ФС II, отнесенный к поглощаемой энергии: PIabs = [1-(Fo/Fm)]/(Mo/Vj)* *[(Fm-Fo)/Fo]*[(1-Vj)/Vj].
Измерения световых зависимостей флуоресценции проводили на импульсном флуориметре Water-PAM (Walz, Германия). У микроводорослей, адаптированных к темноте, регистрировали максимальный квантовый выход ФС II (Fv/Fm). Проводили измерения быстрых световых зависимостей различных параметров флуоресценции на свету при последовательном увеличении интенсивности от 0 до 800 мкЕ/м2с [13, 14]. В конце каждого сеанса освещения при определенной интенсивности с ис-
пользованием насыщающей вспышки (0,8 с, 3000 мкЕ/м2х), регистрировали параметры Fм, а также выход флуоресценции на свету Ft. На основании всех параметров рассчитывали относительную скорость нециклического электронного транспорта ЕТЯ = Y • Е1 • 0,5, где Y = ^м' - Ft)/ Fм, - квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в ФС II, Е1 - освещенность (мкЕ/м2 с); нефотохимическое тушение NPQ = ^м^м) - 1. Измерения проводили в пятикратной повторности. Перед измерением все образцы выдерживали в темноте в течение 30 минут.
Образцы гуминовых (ГК) и фульвокислот (ФК) черноземных почв были любезно предоставлены координатором российского отделения Международного Гуминового сообщества (ШББ, США), проф. И.В. Перминовой.
Культуры одноклеточных пресноводных микроводорослей quadricauda, которые являются сертифицированным тест-объектом для биотестирования, были выращены на среде Успенского-1. Микроводоросли культивировали при температуре 24±2°С при периодическом освещении (12 часов свет 30 цЕ/м2с: 12 часов темнота). Инкубацию микроводорослей с ГВ и бихроматом калия проводили в тех же условиях, что и при их выращивании.
Результаты. Было исследовано влияние ГВ на скорость роста микроводорослей quadricauda, которую оценивали по параметру флуоресценции ^о). Параметр Fo связан с обилием клеток микроводорослей [13, 14]. Обнаружено, что ГВ черноземных почв в нормальных условиях не обладали выраженным стимулирующим воздействием на рост микроводорослей 5. quadricauda (рис. 1А). При внесении эталонного токсиканта бихромата калия наблюдалось ингибирование скорости роста микроводорослей (рис. 1Б). При добавлении ГВ было обнаружено, что они обладают выраженным защитным действием. Можно предположить, что ГВ действуют на рост только в стрессовых ситуациях.
Рис. 1. Изменение количества клеток микроводорослей Б. цнайпсанйа по параметру Ро в присутствии ГК, ФК черноземных почв (10 мг/л) и бихромата калия (2,5 мг/л) через 72 часа инкубации. А - значение Fo в присутствии ГК и ФК черноземных почв, Б - значение Fo в присутствии бихромата калия, в сочетании бихромата калия с ГК и ФК черноземных почв
О 200 400 600 600 1000
О 200 400 600 800 1000
Освещенность, мкЕ/м2с Освещенность, мЕ/мгс
Рис. 2. Изменения световых кривых параметров флуоресценции микроводорослей S. quadricauda при влиянии ГК и ФК черноземных почв в концентрации 10 мг/л через 24 часа
инкубации. А - относительная скорость нециклического электронного транспорта (ЕТЯ), Б -нефотохимическое тушение флуоресценции (NPQ). 1 - контроль, 2 - ФК черноземных почв, 3 -
ГК черноземных почв
Параметры флуоресценции хлорофилла микроводорослей S. (¡11(1(1141(111(1(1 при воздействии ГВ черноземных почв в концентрации 10 мг/л через 24 часа инкубации,
Изменения в функционировании фотосинтетического аппарата при действии ГВ исследовали с помощью световых зависимостей параметров флуоресценции (рис. 2). При измерении относительной скорости нециклического электронного транспорта (ETR) обнаружили, что ГВ ведут к увеличению его скорости. При этом ГК черноземных почв в большей степени стимулировали электронный транспорт по сравнению с ФК. Также установлено, что ГК влияют на состояние фотосинтетических мембран, что привело к увеличению нефотохимического тушения флуоресценции (NPQ), отражающего изменение электрохимического протонного градиента на мембране. При этом ФК практически не оказывали воздействие на состояние фотосинтетических мембран.
Детальное исследование воздействия ГВ на световые реакции фотосинтеза были проведены при регистрации индукционных кривых флуоресценции в миллисекундном интервале времени. Индукционные кривые представляют собой увеличение интенсивности флуоресценции после включения действующего света, отражающее постепенное восста-
новление переносчиков электронов между двумя фотосистемами. Измерение флуоресценции на разных фазах кривой позволяет судить о протекании различных стадий фотосинтеза. В таблице приведены параметры, рассчитанные из индукционных кривых флуоресценции хлорофилла клеток микроводорослей quadricauda в присутствии ГВ [13-15].
Исследование параметров индукционных кривых флуоресценции подтверждают тот факт, что ГВ могут оказывать влияние на функционирование фотосинтетического аппарата микроводорослей quadricauda. ГВ оказывали стимулирующее воздействие на фотосинтез микроводорослей. Это отражено в изменении параметра Бу/Бм - максимального квантового выхода ФС II, связанной с разложением воды и выделением кислорода. Значение данного параметра в присутствии ГК увеличивалось до 13%. При этом ФК не оказали выраженного стимулирующего воздействия (таблица).
При действии ГВ снизилась доля активных реакционных центров ФС II с низкой скоростью восстановления вторичного акцептора 0в (участок, связывающий пластохинон). Это отражено в уменьшении коэффициента V; (фаза от Бо до Б;). При изучении параметра VI, являющегося индикатором состояния редокс-состояния пула пластохинона в темноте, обнаружили, что ГВ не влияли на наличие окисленных молекул пластохинона сайта
Параметр индекса производительности (Р1авб) в присутствии ГК увеличился вдвое, что говорит о степени увеличения функциональной активности ФС II в 2 раза. Это происходит из-за повышения доли активных РЦ и снижения тушения возбужденных состояний в антенне. Повышение доли активных РЦ приводит к уменьшению размера антенны (ABS/RC). Увеличение активных РЦ и квантовой эффективности переноса электронов от QA -(фЕо) приводит к снижению диссипации энергии в виде тепла ф1о/ЯС).
% от контроля
Параметр ФК черноземных почв,% ГК черноземных почв,%
Бо 103 103
Бу/Бм 103 113
V; 100 86
VI 100 96
фЕо 103 126
Р1АВ8 112 215
АВ8ЖС 96 80
БЬЖС 93 68
В последнее время препараты на основе ГВ используют в сельском хозяйстве для улучшения состояния растений [16-18]. Наше исследование показало, что они могут положительно воздействовать на состояние фотосинтетических процессов модельного тест-объекта микроводорослей 5. Quadricauda [19]. Добавление ГВ приводило к увеличению скорости нециклического электронного транспорта (ЕТЯ), индекса производительности фотосинтеза (Р1лбз), максимального квантового выхода первичной фотохимической реакции ^у^м). Было
установлено, что ГК воздействуют на состояние фотосинтетических мембран клеток (увеличение NPQ). В нормальных условиях ГВ мало влияли на рост микроводорослей (Fo), но при экстремальных условиях физиологическая активность ГВ повышалась.
Таким образом, измерение изменений эффективности процессов фотосинтеза по параметрам индукции флуоресценции является чувствительным методом, который может быть предложен для оценки разрабатываемых для сельского хозяйства гуминсодержащих препаратов.
Литература
1. Nardi S., Pizzeghello D., Schiavon M., Ertani A. Plant biostimulants: physiological responses induced by protein hy-drolyzed-based products and humic substances in plant metabolism // Scientia Agricola, 2016, V. 73, № 1. - P. 18-23.
2. Полиенко Е.А. Экологическая оценка влияния гуминовых препаратов на состояние почв и растений: автореф. дисс. к.б.н. - Ростов-на-Дону, 2016. - 24 c.
3. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. - М.: Изд-во МГУ, 1990. - 325 с.
4. Горовая А.И., Орлов Д.С., Шелбенко О.В. Гуминовые вещества: строение, функции, механизм действия, протекторные свойства, экологическая роль. - Киев: Наукома думка, 1995. - 303 с.
5. Pandey A.K., Pandey S.D., Misra V., Devi S. Role of humic acid entrapped calcium alginate beads in removal of heavy metals // Journal of hazardous materials, 2003, V. 98, № 1. - P. 177-181.
6. Russo R.O., Berlyn G.P. The use of organic biostimulants to help low input sustainable agriculture // Journal of Sustainable Agriculture, 1991, V. 1, № 2. - P. 19-42.
7. Gulser F., Sonmez F., Boysan S. Effects of calcium nitrate and humic acid on pepper seedling growth under saline condition, 2010, V. 31, №. 5. - P. 873-876.
8. Pizzeghello D., Francioso O., Ertani A., Muscolo A., Nardi S. Isopentenyladenosine and cytokinin-like activity of different humic substances // Journal of Geochemical Exploration, 2013, V. 129. - P. 70-75.
9. Gholami H., Samavat S., Ardebili Z.O. The alleviating effects of humic substances on photosynthesis and yield of Plan-tago ovate in salinity conditions // International Research Journal of Applied and Basic Sciences, 2013, V. 4, № 7. - P. 16831686.
10. Olaetxea M., Mora V., Garcia A.C., Santos L.A., Baigorri R., Fuentes M., Garcia-Mina, J.M. Root-Shoot Signaling crosstalk involved in the shoot growth promoting action of rhizospheric humic acids // Plant signaling and behavior, 2016, V. 11, № 4. - P. e1161878.
11. Lazar D., Schansker G. Models of chlorophyll a fluorescence transients // Photosynthesis in silico. Springer Netherlands, 2009. - P. 85-123.
12. Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Qiang S., Goltsev V. Simultaneous in vivo recording of prompt and delayed fluorescence and 820-nm reflection changes during drying and after rehydration of the resurrection plant Haberlea rhodopensis // Biochim. Biophys. Acta., 2010, V. 1797. - P. 1313-1326.
13. Маторин Д.Н., Рубин А.Б. Флуоресценции хлорофилла высших растений и водорослей. - М.-Ижевск: ИКИ-РХД, 2012. - 256 с.
14. Гольцев В.Н., Каладжи М.Х., Кузманова М.А., Аллахвердиев С.И. Переменная и замедленная флуоресценция хлорофилла А - теоретические основы и практическое приложение в исследовании растений. - М.-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2014. - 220 с.
15. Strasser R.J., Tsimilli-Michael M., Srivastava A. Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient // Chlorophyll a Fluorescence, 2004. - P. 321-362.
16. Христева Л.А. Стимулирующее влияние гуминовой кислоты на рост высших растений и природа этого явления / Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. - Харьков, 1957, т. 1. - С. 75-94.
17. Комаров А.А. Некоторые рассуждения о действии гуминовых препаратов на растения // Агрохимический вестник, 2009, № 6. - С. 28-29.
18. Овчаренко М.М. Гуматы - активаторы продуктивности сельскохозяйственных культур // Агрохимический вестник, 2001, № 2. - С. 13-14.
19. Габбасова Д.Т., Маторин Д.Н., Конюхов И.В., Сейфуллина Н.Х., Заядан Б.К. Оценка воздействия ионов хромата на морские микроводоросли Phaeodactylum tricornutum // Микробиология, 2017, Т. 86, № 1. - С. 62-71.
