CC BY
259
М. Л. Куранова, А. Е. Павлов, И. М. Спивак, С'. В. Сурма,
Б. Ф. Щеголев, П. А. Кузнецов, В. Е. Стефанов
ВОЗДЕЙСТВИЕ ГИПОМАГНИТНОГО ПОЛЯ НА ЖИВЫЕ СИСТЕМЫ*
Вопросы воздействия магнитных и электромагнитных полей на биологические объекты изучаются достаточно давно. И, если механизмы действия ионизирующего излучения рассмотрены детально [1, 2], то механизмы воздействия электромагнитного излучения ниже теплового порога до сих пор не известны.
Особый интерес представляет изучение воздействия сверхслабых электромагнитных и магнитных полей, энергия квантов поля которых находится ниже характеристической энергии химического превращения. Данных, подтверждающих наличие биологического действия подобных полей, достаточно [3, 4], однако сам механизм воздействия поля достоверно не известен.
Предпринималось множество попыток объяснения физической природы биологических эффектов сверхслабых полей [5-13], однако все они сталкиваются с необходимостью экспериментального подтверждения. Отсутствие ясных представлений о постановке эксперимента оставляет все разработки на уровне гипотез. Известно, что электромагнитный фон очень сильно различается не только в пространстве, но и во времени.
Одной из основных проблем, с которой сталкиваются экспериментаторы, является невозможность стандартизировать условия проведения экспериментов [14]. Этот фактор лежит в основе низкой воспроизводимости опытов. По-видимому, условия «нулевого» магнитного поля позволяют унифицировать проведение экспериментов. Кроме того, исследования «магнитного вакуума» играют важную роль в изучении возможности адаптации человека к условиям открытого космоса.
Для понимания биологического действия ослабленного геомагнитного поля исследователями применяются 2 принципиально различных похода. Первый основан на принципе активной компенсации геомагнитного поля, например с помощью трех пар взаимно перпендикулярных колец (кольца Гельмгольца), и заключается в создании магнитного поля, равного по величине, но противоположного по направлению геомагнитному. Недостатки такого подхода следующие: во-первых, область практически однородного скомпенсированного магнитного поля крайне невелика и составляет ~ 20% от объема, ограниченного кольцами, что серьезно затрудняет размещение там лабораторного животного; во-вторых, сам биологический объект полностью открыт для всевозможных наводок переменных электромагнитных полей техногенного характера 50-100 и 400 Гц, а также высокочастотных наводок.
Второй подход — это экранирование замкнутого объема материалом с большой магнитной проницаемостью. В данном случае техногенные наводки не страшны, однако при использовании в качестве экранов аморфных магнитомягких материалов требуется размещение биологических объектов по оси экранирующих цилиндров или в центре
*Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №09-04-01208), Министерства образования и науки России (грант №2.1.1/485) и программы ПРАН (Генофонды и генетическое разнообразие).
© М. Л. Куранова, А. Е. Павлов, И. М. Спивак, С. В. Сурма, Б. Ф. Щеголев, П. А. Кузнецов, В. Е. Стефанов, 2010
экранирующих сфер, что продиктовано особенностью прохождения магнитно-силовых линий в таких материалах.
В наших исследованиях были использованы оба этих подхода. При изучении воздействия ослабленного геомагнитного поля на уровне целого организма в компенсационную установку помещалось лабораторное животное — крыса линии ВИИ. Было обнаружено, что в условиях компенсированного поля у животного наблюдались резкие колебания АД (артериальное давление) и ЧСС (частота сердечных сокращений), но систематизировать данные эффекты не удалось вследствие влияния индивидуальных особенностей лабораторных животных на степень и характер проявления магнитобиологического эффекта. Сложности интерпретации результатов на уровне целого организма явились побудительным мотивом для проведения экспериментов на более простом по организации биологическом уровне.
В качестве моделей были выбраны две клеточные линии: эпителиоидная карцинома ИеЬа и первичные фибробласты человека УН-10. Предполагалось, что растущие в условиях нормального геомагнитного поля клетки будут воспринимать его экранирование как стрессорное воздействие и, возможно, демонстрировать классический клеточный ответ на повреждение. К настоящему времени механизм глобального клеточного ответа хорошо изучен [15]: большинство генов, продукты которых вовлечены в него, клонированы и секвенированы. Основным белком, вовлеченным в процессы поддержания клеточной стабильности, является антионкоген Р-53, появление которого в фосфори-лированной форме может служить маркером запуска глобального клеточного ответа на повреждение [16-18].
Известно, что любое клеточное изменение требует энергетических ресурсов. Источником АТФ в клетке являются митохондрии, которые в нормально пролифирирующих клетках культуры образуют сеть, выполняющую интегрирующую функцию в «энергетической системе» клетки. В работе [19] показано, что структура митохондриальной сети является крайне пластичной и способна к реорганизации при действии повреждающих агентов. Таким образом, для предварительного анализа реакции клетки на гипо-геомагнитное поле нами было выбрано исследование Р-53 статуса и митохондриальной сети изучаемых клеток.
Материалы и методы исследования
Компенсация геомагнитного поля. Компенсация геомагнитного поля осуществлялась с помощью трех пар взаимно перпендикулярных колец Гельмгольца. Для управления токами в обмотках колец установки был разработан и создан трехканальный усилитель тока, позволяющий раздельно регулировать каждую из трех компонент вектора индукции магнитного поля.
Экранирование геомагнитного поля. Для исследования влияния сверхслабых магнитных полей на биологические объекты клеточного и субклеточного уровней была создана экранирующая камера, представляющая собой цилиндр (_0 = 26 см, Ь = 84 см), покрытый десятками слоев экранирующего материала, изготовленного на основе сплава из аморфного магнитомягкого материала АМАГ-172. Общее количество слоев равно 40. Все слои «намотаны» в одну сторону и сгруппированы в 4 независимых пакета по 10 слоев в каждом с воздушными промежутками 3 мм между пакетами. С одного торца у цилиндра фиксированная заглушка, с другого — съемная крышка. Заглушка и крышка имеют экранирующее покрытие, идентичное покрытию цилиндра. Конструкция съемной крышки позволяет избежать появления «магнитных дыр» в экране. Внутри камеры предусмотрена подставка из немагнитного материала, позволяющая
устанавливать биологические объекты в центре экранирующей камеры. Многослойная организация магнитного экрана позволила получить коэффициент экранирования, равный 250 по постоянной составляющей внешнего магнитного поля, ослабляя магнитное поле земли (48 мкТл) до величины 0,192 мкТл в центре закрытой камеры. Принимая во внимание заявленные производителем магнитомягкого материала АМАГ-172 его частотные характеристики, следует отметить высокую степень экранирования и от любых высокочастотных помех и наводок.
Приборы для измерений и обработка данных. Измерения магнитных полей проводились однокоординатным магнитометром FLUXMASTER (1 нТл to 200 мкТл) производства Германии, а также трехкоординатным магнитометром HB0302.1A (Россия) с разрешающей способностью 0,1 мкТл, снабженного специально разработанным для PC (персонального компьютера) программным обеспечением для контроля как составляющих, так и суммарного вектора магнитного поля в режиме реального времени. Для регистрации переменных составляющих электромагнитного поля в рабочих объемах используются преобразователи (датчики) индукции магнитного поля НВ-0303 и НВ-0303.1 с рабочим диапазоном частот (плоский участок АЧХ) соответственно 5-10000 Гц и 1-1000 кГц. Для снятия данных с указанных датчиков (оцифровки и ввода сигнала в компьютер) используется PC-осциллограф PCS-500 фирмы Welleman (Бельгия). Анализ частотного спектра осуществлялся с помощью программного пакета PC-Lab 2000SE.
Исследования воздействия магнитного поля на гомеостаз сердечно-сосудистой системы биологического объекта (лабораторная крыса): 1) АД и его вариабельности; 2) ЧСС и ее вариабельности — в зависимости от исходного состояния (уровень АД, тип наркоза, состояние антиоксидантной системы) этого объекта проводилось с помощью оригинального АД- и ЧСС-измерительного комплекса, созданного на основе датчика для прямого измерения артериального давления Baxter, и оригинальной компьютерной программы KardioPlus, которая позволяет оценивать частоту сокращения сердца, а также изменение влияния на вариабельность ритма разных регуляторных систем.
Микроскопия и анализ изображений. Анализ фиксированных на предметных стеклах клеток проводили при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM-5 Pascal (C. Zeiss, Германия), оборудованного объективом 63/1.4 и аргоновым лазером (458/488 нм).
Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка и представление графиков проводились с использованием пакета программ Excel (Microsoft).
Модельные системы. Для экспериментов в условиях компенсации использовались как широко известные крысы линии Wistar, так и обычный модельный объект для исследования фармакологического действия гипотензивных препаратов — гипертензив-ные крысы линии SHR. Для контроля брали крыс линии WKY, близкой к опытной. Животное помещалось на немагнитный столик в геометрическом центре установки, где поле наиболее однородно. Крыса наркотизировалась раствором оксибутирата натрия внутрибрюшинно. Датчик ЧСС и АД вводился в бедренную артерию животного, сигнал с которого поступал на усилитель и через аналого-цифровой преобразователь РПГ-ВЧ на персональный компьютер, где и анализировался.
Клетки выращивали в пластиковых флаконах на чашках Петри (Nunclon, США) и предметных стеклах, помещенных в чашку Петри, на среде F-10 или DMEM (Био-лот, Россия или Sigma, США) с добавлением 10%-ной фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Sigma) и антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрепто-
мицина) при 37°С в атмосфере с содержанием 5% СО2. Клетки HeLa — эпителиоидная карцинома человека, полученная из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Клеточный штамм VH-10 — диплоидные фибробласты крайней плоти мальчика 11 лет, используемые в исследовании в качестве клеток здорового донора [20, 21]. Клетки любезно предоставлены профессором А. Кольман (A. Kolman, Стокгольмский университет, Швеция).
Регистрация Р-53. Иммунофлуоресцентный анализ Р-53 проводили на фиксированных клетках. Выращенные на покровных стеклах до субконфлуэнтного состояния клетки фиксировали 4%-ным раствором формальдегида в PBS (фосфатный буфер) на льду в течение 10 мин. После интенсивной промывки PBS клетки пермеабилизировали в 0,5%-ном растворе Тритона X-100 (Sigma) в PBS в течение 5 мин, промывали PBS и помещали на 30 мин в 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma) в PBS. Для визуализации дикого типа и большинства мутантных форм белка Р-53 методом непрямой иммунофлуоресценции клетки сначала в течение 60 мин инкубировали с коммерческими поликлональными кроличьими антителами к человеческому белку Р-53 (1:50 Santa Cruz, США), затем — 30 мин с козьими антителами к кроличьему гамма-глобулину, сконьюгированными с флуоресцеинизотиоционатом (FITC, Sigma), в разведении 1:300. Между инкубациями с антителами стекла промывали 30 мин в 0,1%-ном растворе Tween 20 (Sigma) в PBS. После окрашивания препараты заключали в раствор пропилгаллата в 90%-ном глицерине, препятствующий выгоранию флуоресценции.
Исследование митохондриальной сети. Окрашивание митохондрий производили на живых клетках. Клетки линий HeLa и VH-10 выращивались на покровных стеклах в чашках Петри. Митохондрии окрашивали коммерческими красителями MitoTracker® Orange CM-H2TMRos и MitoTracker® Green FM (Molecular Probes, USA), которые флюоресцировали лишь при попадании в митохондрию. Краситель инкубировали c культурой клеток в концентрациях Orange — 100 нМ, Green — 50 нМ в течение 40 мин в инкубаторе, затем отмывали чистой культуральной средой. После окрашивания препараты заключали в раствор пропилгаллата в 90%-ном глицерине, препятствующий выгоранию флуоресценции. Клетки помещали в экранирующую камеру на 0,5, 1 и 3 ч, вне камеры находились контрольные клеточные культуры, экспозиция проводилась в термостате при 37°С и предварительно прогретой камере. Через заданные промежутки времени экспериментальные и контрольные клетки прижизненно окрашивались MitoTracker® Orange CM-H2TMRos и MitoTracker® Green. Визуально подсчитывалось количество клеток с реорганизующейся митохондриальной сетью в 10 полях зрения на каждый препарат при сравнительно одинаковой плотности посева. Составлялись таблицы зависимости количества клеток от времени экспозиции в камере.
Обработка H2O2. Клетки обрабатывались H2O2 в концентрации 500 мкM в течение 1 ч перед окрашиванием в стандартных условиях культивирования.
Результаты исследования и их обсуждения
Лабораторные ж.ивотные. Проведенные опыты показали, что динамика изменения регистрируемых параметров у гипертензивных и нормотензивных крыс под воздействием компенсационного поля направлена в противоположные стороны. У нормо-тензивных животных наблюдалось повышение уровня артериального давления (со 140 до 163 мм рт. ст.) с последующим медленным снижением до исходного уровня. Параллельно (а возможно, упреждающе) наблюдалось увеличение частоты сердечных сокращений. И если уровень артериального давления через 100-110 мин восстанавливался до исходного уровня, то частота сердечных сокращений оставалась высокой.
В таких же условиях у гипертензивной крысы (линия ВИИ) уровень артериального давления под воздействием компенсационного поля монотонно снижался (со 165 до 137 мм рт. ст.). Одновременно наблюдался рост частоты сердечных сокращений. Момент выключения компенсационного поля сопровождался развитием аритмии и резким снижением артериального давления. В течение последующих 100-120 мин регистрируемые параметры восстанавливались до исходного уровня.
Однако данные отклонения были нерегулярными и плохо воспроизводимыми в различных сериях опыта. Вероятно, это связано с тем, что ответ целого организма является комплексным, и различные его системы взаимно компенсируют стрессорное воздействие с целью сохранения общего гомеостаза. Таким образом, выделить мишень действия поля на организменном уровне достаточно сложно. Это стало причиной поиска более просто организованной модели, которой, например, является клеточная культура.
Клеточные культуры. Клеточные культуры сейчас — основная модель для исследований действия различных факторов на биологические объекты.
К настоящему времени сформулировано достаточно подробное представление об активации и взаимодействии различных сигнальных путей клетки в ответ на стрессорные условия. Наиболее полно изучены клеточные реакции на повреждение ДНК.
Большинство повреждений ДНК не являются результатом только ошибок репликации. Множество повреждений возникает в любое время клеточного цикла под действием как экзогенных, так и эндогенных факторов. Так, ультрафиолетовые лучи вызывают образование пиримидиновых димеров, 6,4-фотопродуктов, аддуктов, разрывов и прочие повреждения ДНК. Под действием химических агентов происходят разного рода модификации нуклеотидов, возникают межнитевые сшивки, конформационные дефекты [22].
Наиболее подробно изучены эффекты действия ионизирующего рентгеновского излучения [1, 2], в результате которого в молекуле ДНК возникают двунитевые разрывы [23, 24]. Они могут приводить к клеточной гибели или стабильным хромосомным перестройкам [25-27], что и является главной причиной летального и мутагенного действия ионизирующей радиации. Появление в ДНК двунитевых разрывов запускает каскад внутриклеточных реакций, опосредуемых различными сигнальными путями, и приводит к развитию глобального клеточного ответа на повреждение, включающего активацию специфических чекпойнтов, возникающих в ответ на повреждение ДНК. Следствием этого являются возможная остановка клеточного цикла, усиление репарационных процессов и изменение конформации хроматина [1, 25-27].
Известно, что любое клеточное изменение требует энергетических ресурсов. Источником АТФ в клетке являются митохондрии, которые в нормально пролифирирующих клетках культуры образуют сеть, выполняющую интегрирующую функцию в «энергетической системе» клетки. Показано [19], что структура митохондриальной сети является крайне пластичной и способна к реорганизации в ответ на действие повреждающих агентов. В качестве модели мы исследовали два типа клеток — нормальные и опухолевые, поскольку ответ этих типов клеток на повреждение может различаться. В качестве маркеров реакции клетки на стрессорные воздействия был выбран белок Р-53, так как он является основным белком, вовлеченным в процессы поддержания клеточной стабильности, появление которого в фосфорилированной форме может служить маркером запуска глобального клеточного ответа на повреждение ДНК [16-18] и состояние митохондриальной сети исследуемых клеток.
Изучение влияния гипогеомагнитных условий на культуры клеток ИеЬа и УН-10 проводили в два этапа. Первым шагом было определение присутствия белка Р-53 в
детектируемых количествах. Через 1 ч после экспозиции клеток в экранированных геомагнитных условиях, как в клетках линии ИеЬа, так и УН-10, в ядрах выявляется яркое специфическое зеленое свечение, соответствующее появлению детектируемых
Рис. 1. Выявление белка Р-53 в клетках культуры УИ-10:
А — свечение Р-53 в ядрах клеток, экспонированных в течение 1 ч в условиях экранирования; Б — отсутствие свечения в клетках контроля
Рис. 2. Выявление митохондриальной сети интерколирующим красителем MitoTracker® Green FM
Клеточная культуры VH-10. A — контроль: упорядоченная, регулярная митохондриальная сеть; Б — состояние митохондриальной сети после трехчасовой экспозиции в условиях экранирования
1Q4
61,10%
Время экспозиции
Рис. 3. Среднее количество клеток в культуре (в процентах) с реорганизованной митохондриальной сетью после 0,5, 1 и 3 ч экспозиции в гипомагнитных условиях
Темные столбцы — опыт, светлые — контроль
данных методом количеств белка Р-53 (рис.1). Это свидетельствует о стабилизации белка Р-53 в ядре клетки и показывает, что Р-53 и опосредуемые им сигнальные пути активно вовлечены в адаптацию клетки к условиям уменьшения геомагнитного поля. Наблюдаемый эффект на обеих клеточных линиях был одинаков, но в дальнейшем мы продолжим работу на первичных фибробластах УИ-10, так как эти клетки крупнее и результаты более наглядны.
Следующим этапом было выявление состояния митохондриальной сети в контроле и после различных экспозиций в условиях экранированного геомагнитного поля. Во всех клетках, экспонированных на 1 и 3 ч в условиях экранирования, наблюдалась реорганизация митохондриальной сети, которая в норме упорядочена и располагается преимущественно вокруг ядра (см. рис. 1; 2). Уже через час после помещения клеток в измененные условия, митохондриальная сеть распадалась, образуя как одиночные скопления, так и крупные нерегулярные конгломераты в цитоплазме клетки (рис. 1, А; 2, Б). Количество клеток с такой реорганизованной сетью росло с увеличением времени экспозиции (рис. 3). Следует отметить, что и в контрольной группе также встречались клетки с нерегулярной митохондриальной сетью, но их число не велико.
Выводы
1. В условиях экранированного геомагнитного поля на клетках линии ИеЬа и УИ-10 показано, что белок Р-53 и опосредуемые им сигнальные пути активно вовлечены в адаптацию клетки к условиям гипогеомагнитного поля.
2. Обнаруженный эффект по исследованным параметрам оказался сходным с клеточным ответом на повреждение ДНК.
* * *
Авторы выражают глубокую признательность за сотрудничество и помощь сотрудникам лаборатории экспериментальной физиологии и фармакологии «Федерального центра сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова» и коллегам из Института конструкционных материалов «Прометей».
1. Belyaev Ya. I., Harms-Ringdahl M. Effects of gamma-rays in the 0,5-50 cGy range on the conformation of chromatin in mammalian cells // Radiat. Res. 1996. Vol. 145. P. 687-693.
2. Heussen C., Nackerdien Z., Smit B. J., Bohm L. Irradiation damage in chromatin isolated from V-79 Chinese hamster lung fibroblasts // Radia. Res. 1987. Vol. 110. P. 84-94.
3. Polk C. Biological effects of low-level low-frequency electric and magnetic fields // IEEE Trans. on Educ. 1991. Vol. 34. P. 243-249.
4. Berg H., Zhang L. Electrostimulation in cell biology by low-frequency electromagnetic fields // Electro-Magnetobiol. 1993. Vol. 12. P. 147-163.
5. Smith S. D., McLeod B. R., Liboff A. R. Calcium cyclotron resonance and diatom mobility // Bioelectromagnetics. 1987. Vol. 8. P. 215-227.
6. Lednev V. V. Possible mechanism for the influence of weak magnetic fields on biological systems // Bioelectromagnetics. 1991. Vol. 12. P. 71-75.
7. Blanchard J. P., Blackman C. F. Clarification and application of an ion parametric resonance model for magnetic field interactions with biological systems // Bioelectromagnetics. 1994. Vol. 15. P. 217-238.
8. Liboff A. R., McLeod B. R., Smith S. D. Resonance transport in membranes, in electromagnetics in biology and medicine // Ed. by C. T. Brighton, S. R. Pollack. San Francisco: San Francisco Press, 1991. P. 67-77.
9. Binhi V. N. Interference of ion quantum states within a protein explains weak magnetic field’s effect on biosystems // Electro-Magnetobiol. 1997. Vol. 16. P. 203-214.
10. Brocklehurst B., McLauchlan K. A. Free radical mechanism for the effects of environmental electromagnetic fields on biological system // Int. J. Radiat. Biol. 1996. Vol. 69. P. 3-24.
11. Бинги В. Н., Савин А. В. Физические проблемы действия слабых магнитных полей на биологические системы // УФН. 2003. Т. 173, №3. С. 265-300.
12. Binhi V. N. Nuclear spins in primary mechanisms of biomagnetic effects // Biophysics. 1995. Vol. 40. P. 677-691.
13. Prato F. S., Carson J. J. L., Ossenkopp K. P., Kavaliers M. Possible mechanism by which extremely low frequency magnetic fields affect opioid function // FASEB J. 1995. Vol. 9. P. 807-814.
14. Lacy-Hulbert A., Wilkins R. C., Hesketh T. R., Metcalfe J. C. No effect of 60 Hz electromagnetic fields on myc or P-actin expression in human leukemic cells // Radiat. Res. 1995. Vol. 144. P. 9-17.
15. Siegel R. M., Lenardo M. J. Apoptosis signaling pathways // Curr. Prot. Immun. 2002. Vol. 11. P. 9.
16. Kim S. T., Kastan M. B. Involvement of the cohesin protein Sms1 in ATM-dependent and independent response to DNA damage // Genes Dev. 2002. Vol. 16. P. 560-570.
17. Lane D. The p53 pathway // Genome Inform. 2007. Vol. 19. P. 194.
18. Kuribayashi K., El-Deiry W. S. Regulation of programmed cell death by the p53 pathway // Adv. Exp. Med. Biol. 2008. Vol. 615. P. 201-211.
19. Bernard G., Bellance N., James D. Mitochondrial bioenergetics and structural network organization // J. Cell Science. 2007. Vol. 120, N 5. P. 838-848.
20. Kolman A., Bohusova T., Lambert B., Simons J. W. Induction of 6-thioguanine-resistant mutants in human diploid fibroblasts in vitro with ethylene oxide // Envir. Molec. Mutagen. 1992. Vol. 19, N2. P. 93-97.
21. Nygren P., Fridborg H., Csoka K., Sundstrom C. et al. Detection of tumor-specific cytotoxic drug activity in vitro using the fluorometric microculture cytotoxicity assay and primary cultures of tumor cells from patients // Int. J. Cancer. 1994. Vol. 56, N 5. P. 715-720.
22. Stiff T., O’Driscoll M., Rief N., Iwabuchi K. et al. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation // Cancer Res. J. 2004. Vol. 64, N7. P. 2390-2396.
23. Chovanec. M., Naslund M., Spivak I. et al. Rejoing of DNA strand breaks induced by propylene oxide and epichlorohydrin in human diploid fibroblasts // Envir. Molec. Mutagen. 1998. Vol. 32. P. 223-228.
24. Huang L., Shyder A. R., Morgan W. F. Radiation-induced genomic instability and its implications for radiation carcinogenesis // Oncogene. 2003. Vol. 22, N 37. P. 5848-5854.
25. Fei P., El-Deiry J. P53 and radiation responses // Oncogene. 2003. Vol. 22, N37. P. 57745783.
26. Zhou B.-B., Bartek J. Targeting the checkpoint kinases: chemosensitization versus chemo-protection // Nature Reviews Cancer. 2004. Vol. 4. P. 216-225.
27. Iliakis G., Wang Y., Guan J., Wang H. DNA damage checkpoint control in cells exposed to ionizing radiation // Oncogene. 2003. Vol. 22, N 37. P. 5834-5847.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2010 г.
