Воздействие асептического стимулятора Дорогова (АСД-2Ф) на количественные параметры роста тканевых культур почек мышей Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 616.61-092.4:611.61.018

воздействие асептического стимулятора дорогова (асд-2Ф) на количественные параметры роста тканевых культур почек мышей

© 2010 г. В. П. Пащенко, Н. А. Назаренко, Э. В. Рехачева, *А. В. Пащенко

Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск *Фирма «Сервье», г. Москва

Изучены биологические свойства препарата АСД-2Ф с использованием первичной культуры ткани почек взрослых животных - мышей. Влияние АСД-2Ф исследовали при его внесении в питательную среду 199 на весь срок культивирования тканей, после нейтрализации препарата соляной кислотой и при кратковременном воздействии на ткань. Установлено, что при концентрации 0,1-0,3 % АСД-2Ф в среде уменьшает как образование клеточных зон роста, так и их величину. После нейтрализации препарата соляной кислотой цитостатическое действие его наблюдается и при более высоких дозах. При кратковременном однократном воздействии на фрагменты ткани ингибирующее действие АСД-2Ф сохраняется при дальнейшем их культивировании. Ключевые слова: культура ткани in vitro, почки, стимулятор Дорогова, препарат АСД-2Ф, влияние на рост, клетки.

Запатентованный препарат АСД-2Ф (асептический стимулятор Дорогова) является продуктом сухой перегонки сырья животного происхождения (разработка научно-внедренческого центра АгроВет-защита, производитель ООО АРЕАЛ МЕДИКАЛ, Москва) [3, 4, 6]. Он утвержден Департаментом ветеринарии в качестве биологического стимулятора, содержит ряд биологически активных веществ: «соединения с активной сульфгидрильной группой, производные алифатических аминов, карбоновые кислоты, алифатические и циклические углеводороды, производные аминов и воду», имеет темно-коричневый цвет, обладает специфическим запахом и щелочной реакцией. Выпускаемый в настоящее время препарат обладает широким спектром биологического действия и рекомендуется для «перорального и наружного применения». Препарат используется в качестве асептического средства, «ускоряет процессы заживления кожных покровов и трофических язв, регенерацию поврежденных тканей», обладает «противовоспалительным действием», может использоваться «для стимуляции роста и развития животных» [1, 2, 7]. В исследованиях [12, 13] обосновано использование его для лечения опухолевых заболеваний. Было показано, что под влиянием АСД-2 опухоль (карцинома Уокера-256 крыс) развивалась почти в 2 раза медленнее, чем в контроле, и сопровождалась увеличением сроков жизни опытных животных [13]. По мнению авторов, «низкая токсичность данного лечебного средства, отсутствие ингибирующего влияния на пролиферирующие ткани, иммуностимулирующее действие выделяют его в группу с принципиально иным механизмом цитоста-тического действия». Препарат нашел определенное применение и в медицинской практике, что, на наш взгляд, требует углубленного изучения, поскольку механизм его действия исследован недостаточно, рекомендуемые дозы обоснованы на основании эмпирического опыта, особенности влияние этого препарата на ткани не изучены. Не вполне согласуется декларируемая инструкций к применению препарата «стимуляция роста и развития» со способностью его задерживать рост опухолевой ткани.

Цель исследования — установить особенности влияния препарата на некоторые параметры роста культур клеток почки взрослых животных in vitro при непосредственном его действии на ткань при различных его концентрациях в среде.

Методы

Исследовался стандартный препарат АСД-2Ф. Для оценки био-

логического действия его использовали ткани почек белых беспородных мышей весом 18—20 г, первичные культуры из которых наиболее доступны и хорошо изучены [9]. После декапитации и частичного обескровливания почки животных извлекали и после удаления капсулы и фрагментов мозгового вещества измельчали ножницами в растворе Хенкса, содержащем по 200 ЕД пенициллина и стрептомицина. После чего фрагменты ткани переносили на перфорированные миллипоровые фильтры (Millipore, pore size: 0,22 uM) и культивировали их по методике множественных тканевых культур [8, 10, 11, 14]. На перфорированной миллипоровой подложке диаметром 12 мм размещали 68 микрофрагментов ткани размером 0,10—0,05 мм2. При культивировании в таком режиме клетки, выселившиеся из центрального эксплантата, создают на поверхности миллипорового фильтра монослой — зону роста, которая состоит из эпителиоподобных клеток и единичных фибробласто-подобных клеток. Первые признаки образования зоны роста вокруг фрагментов ткани наблюдаются через 72 ч культивирования. В дальнейшем она увеличивается за счет митотического деления клеток в самой зоне роста, а также миграции клеток из центрального эксплантата. Вокруг фрагмента ткани могут быть от одного до 3—4 очагов роста, которые при дальнейшем культивировании могут сливаться.

Культивирование эксплантированных на подложку фрагментов ткани осуществляли в закрытых резиновыми пробками пробирках в 1 мл среды 199 с 12 % сыворотки рогатого скота и 100 ЕД пенициллина и стрептомицина при температуре 38 0С в течение 5 дней. Пробирки размещали в неподвижных штативах (ШСА-1) в наклонном положении под углом 30 в бактериологическом термостате с водяной рубашкой. В питательную среду АСД-2Ф вносили в виде раствора в среде 199. Влияние препарата АСД-2Ф изучали при его внесении на весь срок культивирования (5 дней), после нейтрализации препарата соляной кислотой (0,1 н НС1), а также при кратковременном (10 мин) его действии на фрагменты ткани перед эксплантацией.

На весь срок культивирования АСД-2Ф (рН-9) вносили в питательную среду в количестве 0,005; 0,010; 0,020; 0,040; 0,083; 0,166 и 0,330 %. При внесении препарата в количестве 0,005; 0,010; 0,020 и 0,040 % рН среды не отличалась от контрольной пробы (рН-7,2). В этом случае при значительном разведении АСД-2Ф рН изменялась за счет разведения и буферных свойств питательной среды. Исходный 100 % раствор АСД- 2Ф имеет рН-9,5, поэтому пробы 0,166 и 0,330 % имели более щелочную реакцию

— рН-7,4 и 7,6 соответственно.

Содержание препарата в среде при нейтрализации его 0,1 н соляной кислотой составило 0,125; 0,240; 0,365 и 0,470 %. При этом рН питательной среды была 7,2.

Препарат АСД-2Ф используется также для обработки наружных повреждений и промывания

слизистых. В связи с этим мы изучили особенности кратковременного воздействия АСД-2Ф на фрагменты ткани почек перед их культивированием. Время экспозиции и разведение АСД-2Ф избрали в пределах рекомендуемых инструкцией доз, а также с учетом полученных нами результатов при постоянном воздействии. Кратковременное влияние препарата на фрагменты ткани изучали в течение 10 мин в четырех чашках Петри с 20 мл среды 199, куда вносили определенное количество АСД-2Ф и миллипоровые фильтры с эксплантированными на них фрагментами тканей почек (n = 136). В первую чашку Петри поместили АСФ-2 в концентрации 0 % (контроль), во вторую — 0,15 %, третью — 0,45 % и четвертую

— 1,00 %. После экспозиции фильтры с культурами дважды промывали в среде 199 и помещали в пробирки для культивирования.

После инкубации в термостате в течение 5 дней культуры на поверхности фильтров промывали в физрастворе и фиксировали в смеси Буэна в течение 1 мин, затем промывали в двух 900 спиртах, потом погружали в воду и окрашивали гематоксилином Карцци (1 ч) и эозином (30 сек.). После чего фильтры с культурами промывали в этиловом спирте, обезвоживали и просветляли в ксилоле, затем погружали в канадский бальзам на предметном стекле, покрывая их сверху покровным стеклом (Canada Balsam, Schuchardt Munchen).

Влияние препарата на клетки оценивали по двум количественным параметрам роста культур: а) показателю выросших клеточных колоний по отношению к исходному числу эксплантированных фрагментов ткани (в процентах); б) среднему размеру площадей зон роста культур, образовавшихся около первичных эксплантатов ткани за 5 дней культивирования (также в процентах по отношению к контролю). Эти зоны роста образуются в процессе культивирования путем как миграции клеток из центрального эксплантата, так и деления клеток в самой зоне роста. Можно предполагать, что они в большинстве своем могут относиться к камбиальным и органным стволовым клеткам. Полученные данные сравнивали с контрольной пробой, куда препарат не вносился. Площадь клеточной колонии определяли, используя рисовальный аппарат РА-7у 4.2 (ЛОМО) с последующим сканированием зарисованных контуров колоний и оценкой их площади с помощью компьютерной программы оценки площадей [6]. Растворы АСД-2Ф вносили в среду с помощью микродозатора (Hamilton Bonaduz AG). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы «Microsoft ЕхсеЬ> и пакетов программы «Statistica-6». Для сопоставления параметров использовали непараметрические критерий Wilcoxone при уровне значимости р < 0,05.

Результаты

Результаты исследования показали, что при концентрации АСД-2Ф 0,001-0,020 % в среде и культивировании в течение 5 дней число выросших

культур почек не отличалось от показателя контроля (рис. 1). При концентрациях препарата 0,040 и 0,083 % наблюдалось незначительное увеличение количества выросших культур. При концентрации 0,040 % оно было на 16,5 % больше показателя контроля, при 0,166 % происходило резкое (на 43,0 %) уменьшение количества культур и при концентрации 0,330 % — полное подавление их образования в среде.

Рис. 1. Показатели выросших культур ткани почек по отношению к исходному их количеству при различной концентрации АСД-2 в среде за 5 дней культивирования: 1 — контроль; 2 — 0,005 %; 3 — 0,010 %; 4 - 0,020 %; 5 - 0,040 %; 6 - 0,083 %; 7 - 0,166 %; 8 - 0, 330 % АСД-2Ф - полное подавление образования культур (р1-5 = 0,01; р1-7 < 0,001)

Угнетение образования клеточных культур на поверхности миллипорового фильтра, возможно, вызвано защелачиванием среды. Незначительное увеличение количества культур в диапазоне концентрации АСФ-2Ф 0,040 %, вероятно, связано с некоторой активацией роста клеток. Каких-либо особенностей влияния препарата на морфологические свойства клетки и структуру зоны роста - появление аномальных клеток и патологических митозов - не выявлено.

Распределение размеров выросших клеточных колоний, оцениваемых по площади зоны роста, имеет асимметричный вид, приближаясь к экспоненциальному распределению. В связи этим для сопоставления мы использовали кроме арифметической средней и ряд других точечных статистических оценок их размера (таблица).

Из данных таблицы видно, что внесение в среду на весь срок культивирования АСД-2Ф в концентрации 0,010-0,040 % вызывает снижение размера площади клеточных колоний, затем после незначительного увеличения площади при дозе препарата 0,083 % происходит резкое ее уменьшение до полного прекращения образования клеточных культур при кон-

центрации 0,330 % (р

1 - 2,3,4,5,7

0,001).

Таким образом, при использовании АСД-2Ф наблюдается некоторое увеличение роста клеточных колоний при его концентрации в питательной среде в диапазоне 0,040-0,080 % и резко выраженное цитостатическое действие при более высоких концентрациях (0,166-0,330 %).

Показатели выросших клеточных колоний к исходному количеству эксплантированных фрагментов ткани почек и размера площади клеточных колоний по отношению к контролю при различных концентрациях АСД-2Ф представлены на рис. 2.

Рис. 2. Изменения показателей выросших клеточных колоний (ряд 2) и размера площади клеточных колоний (средняя геометрическая) (ряд 1) по отношению к контролю в пробах с различной концентрацией АСД-2: 1 - контроль; 2 - 0,005 %; 3 -0,010 %; 4 - 0,020 %; 5 - 0,040 %; 6 - 0,083 %; 7 -0,166 %; 8 - 0, 330 %

На рисунке видна высокая степень корреляционной зависимости этих показателей (г = 0,77).

Поскольку, на наш взгляд, резко выраженное угнетение роста культур клеток было связано со щелочными свойством АСД-2Ф, далее мы изучили его влияние на рост клеток после нейтрализации соляной кислотой, что, видимо, происходит в желудке при пероральном его применении.

При нейтрализации для оценки брали две серии пробирок. В одну из них вносили нейтрализованный раствор АСД-2Ф (рН-7,2), в другую параллельную серию пробирок - такое же количество препарата без нейтрализации (исходный рН-9,5). Культивирование проводили в течение 5 дней при температуре 38 °С. Результаты опыта представлены на рис. 3 и 4.

Как видно из данных этих рисунков, нейтрализация АСД-2Ф приводит к уменьшению угнетения роста культур, но его подавляющее рост культур действие наблюдается при более высоких концентрациях. Так, при внесении в среду препарата в концентрации 0,125 % число выросших культур в 4 раза превышает таковое при использовании исходного рас-

Изменение размера площади клеточных колоний (средняя геометрическая и медиана, мм2) при различных концентрациях АСД-2Ф (п =136)

Статистический Содержание АСФ-2Ф в питательной среде

показатель Контроль 1 0,005% 2 0,010% 3 0,020% 4 0,040 % 5 0,083% 6 0,166% 7 0,330% 8

Геометрическая 0,088 0,065 0,056 0,057 0,046 0,057 0,035 0

Медиана 0,078 0,058 0,039 0,045 0,036 0,051 0,027 0

80,0%

12 3 4 5 Пробы

Рис. 3. Показатели выросших клеточных колоний по отношению к исходному количеству эксплантированных микрофрагментов ткани (п = 136) при нейтрализации АСД-2Ф соляной кислотой, р1-23 < 0,001 (ряд 1), в сравнении с исходным (без нейтрализации) раствором АСД-2Ф, р12 < 0,001 (ряд 2): 1 - контроль; 2 -0,12 %; 3 - 0,24 %; 4 '- 0,36 %; 5 - 0,47 % АСД-2Ф

А B

Рис. 4. Гистограмма распределения культур по величине при нейтрализации АСД-2Ф (А) и без нейтрализации (В): ряд 1 -контроль; ряд 2 - 0,12 % АСД-2Ф; ряд 3 - 0,24 % АСД-2Ф

твора АСД-2Ф, полное подавление образования культур имеет место и при дозе препарата 0,360-

0,470 %. На гистограмме (см. рис. 4) представлены особенности распределения культур по величине при нейтрализации АСД-2Ф и без нее, видно, что при нейтрализации наблюдается повышение числа культур средней величины, тогда как при внесении исходного препарата их количество резко снижено.

В опытах с кратковременным воздействием препарата (без нейтрализации) было установлено (рис. 5), что эффект контакта фрагментов тканей с препаратом сохраняется и в процессе последующего культивирования, при этом также наблюдается уменьшение как количества растущих культур, так и их размеров.

1 2 3 4 Пробы

Рис. 5. Показатели выросших колоний (к исходному количеству эксплантатов) (ряд 1), р14 < 0,001, и средних размеров клеточных колонии в опытах (ряд 2) по отношению к контрольной пробе, р1-3 = 0,02; р1-4 < 0,001, при кратковременном контакте с растворами АСД-2Ф: 1 - контроль; 2 - 0,15 %; 3 - 0,45 %; 4 - 1,00 % АСД-2Ф

Сопоставление показателей выросших клеточных колоний и их средней величины выявило, что при концентрации АСД-2Ф 0,15 % имеет место увеличение числа клеточных колоний на 28,0 %, которое не сопровождается увеличением размера их зоны роста, что может предположительно рассматриваться как определенное преимущественное влияние препарата на пролиферацию клеток, растущих в клеточной колонии, а не на их миграцию из центрального эксплантата.

Обсуждение результатов

Проведенные исследования влияния некоторых билогических свойств препарата АСД-2Ф на культивируемые ткани почек взрослых животных позволили установить, что он обладает действием, подавляющим рост клеток ткани почек при культивировании in vitro, и вызывает полное угнетение роста культур при концентрациях в питательной среде 0,2-0,3 %. При кратковременном (10 мин) воздействии на фрагменты ткани почек АСД-2Ф также вызывает преимущественно угнетение рос-та культур при концентрациях в среде 0,5— 1,0 %. Нейтрализация препарата соляной кислотой сопровождается уменьшением его ингибирующего действия на рост культур, но не устраняет его влияния при более высоких дозах. При кратковременном культивировании в пределах изученных доз АСД-2Ф не оказывает какого-либо достаточно выраженного действия на цитологические показатели самих клеток, растущих в культуре. Исследования показали, что препарат АСД-2Ф в культуре ткани почек, несмотря на присутствие сульфгидрильных групп, не обладает достаточно значимым стимулирующим влиянием на культивируемые клетки.

На наш взгляд, АСД-2Ф имеет сравнительно небольшой диапазон доз перехода от физиологически обратимого угнетения роста к дозам токсического действия. В ряде случаев дозы препарата, рекомендуемые в инструкции по применению для внутреннего употребления и обработки участков слизистых оказались близки к концентрациям, угнетающим активный рост тканевых культур почки.

Список литературы

1. Алеутская Л. К. АДС-2 как адаптоген для детей в условиях Севера / Л. К. Алеутская, Н. Н. Алеутский, И. Н. Алеутская // Север. Дети. Школа : IX Ломоносов. междунар. чтения : материалы II науч.-практ. конф. — Архангельск, 1997. — С. 3—4.

2. Графов Д. АСД-2Ф при субклинических микотоксикозах бройлеров / Д. Графов, Б. Бессарабов, Л. Гонцова // Птицеводство. — 2007. — № 5. — С. 29—30.

3. Дерябина З. И. Химико-фармакологическая характеристика препарата АСД / З. И. Дерябина // Труды ВНИЭВ. — 1963. — Т. 25. — С. 326—339.

4. Дорогов А. В. Влияние препарата АСД Ф-2 на течение окислительных процессов в организме / А. В. Дорогов, З. И. Дерябина // Труды ВНИЭВ. — 1968. — Т. 35. — С. 332—333.

5. Иванова А. Т. Иммунотерапия онкологических больных : монография / А. Т. Иванова, И. А. Иванов,

A. А. Иванов. - М. : Печатное дело, 1995. - 208 с.

6. Николаев А. В. О химическом составе и новых фракциях препарата АСД / А. В. Николаев // Труды ВНИЭВ.

- 1958. - Т. 22. - С. 317-326.

7. Определение показателей качества препарата АСД-2 / В. Е. Абрамов [и др.] // Ветеринария. - 2004. -№ 9. - С. 13-16.

8. Пащенко В. П. Влияние физиологических экстремальных и патологических состояний организма на рост тканей при культивировании : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Пащенко Владимир Петрович. - Архангельск, 1994. - 47 с.

9. Пащенко В. П. Изучение токсичности стоматологических базисных полимеров методом тканевых культур / В. П. Пащенко, Т. Н. Юшманова, А. Н. Сивков, Л. Т. Галиева // Экология человека. - 2003. - № 2. -С. 13-15.

10. Пащенко В. П. Разработка компьютерной программы по морфометрии / В. П. Пащенко, А. В. Пащенко, Д. В. Бегун // Сборник научных работ молодых ученых и студентов (56-й научной сессии АГМА). - Архангельск, 1998. - С. 94.

11. Пащенко В. П. Устройство для эксплантации микрофрагментов ткани на подложку для целей культивирования /

B. П. Пащенко // Информационный бюллетень клеточные культуры. - СПб., 1999. - Вып. 14. - С. 56-57.

12. Постоев Н. Б. Применение антисептика - стимулятора Дорогова при опухолях кожи и молочных желез у собак / Н. Б. Постоев, О. А. Стародубова // Ветеринария.

- 2008. - № 9. - С. 54.

13. Противоопухолевое средство : пат. SU 2099063 С1 Рос. Федерация / Алеутский Н. Н., Назаренко Н. А., Ре-хачева Э. В. ; заявка А61К35/34 ; опубл. 20.12.1997, Бюл. № 35.

14. Устройство для посадки на подложку микрофрагментов биологических тканей : пат. SU 1785530, А3,

C12M3/00 / Пащенко В. П. ; заявка 4898950/3 ; опубл. 30.12.1992, Бюл. № 48.

THE INFLUENCE OF ASEPTIC STIMULATOR OF DOROGOV (ASD-2F) ON QUANTHITIVE PARAMETERS OF GROWTH OF TISSUE CULTURES MICE KIDNEY

V. P. Pashchenko, N. A. Nazarenko, E. V. Rekhatcheva, *A. V. Pashchenko

Northern State Medical University, Arkhangelsk *Company «Servie», Moscow

It was hold the study of biological properties of preparation ASD-2F with using the primary culture of kidney tissue of adult mica. The development of ASD-2F was studied by carrying it in the nutrition environment 199 on all date of cultivating, after the neutralization of the preparation by hydrochloric acid and by short-time influence on the tissue. It was determined, that by holding of ASD-2F in environment on the concentration of 0,1 -0,3% in depress the formation of the zones of cell growth and their size. After the neutralization of the preparation by hydrochloric acid its cytostatic influence remain, but in higher dozes. After the one short-time influence of the preparation on the fragments of tissue, its retarding influence remain in the time of its cultivation.

Key words: tissue culture in vitro, kidney, stimulator of Dorogov, preparation ASD-2F, influence to growth, cells.

Контактная информация:

Пащенко Владимир Петрович — доктор медицинских наук, профессор кафедры нормальной физиологии и восстановительной медицины Северного государственного медицинского университета

Адрес: 163000, г. Архангельск, пр. Троицкий, д. 51

Тел.(8182) 28-57-94

E-mail: paschenkow@mail.ru

Статья поступила 12.03.2010 г.