Воздействие антибиотиков и фунгицидов на цианобактерию Nostoc punctiforme (Kutz. ) Hariot и сопутствующие микроорганизмы Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 58.071

раздел БИОЛОГИЯ и ЭКОЛОГИЯ

ВОЗДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ И ФУНГИЦИДОВ НА

ЦИАНОБАКТЕРИЮ NOSTOC PUNCTIFORME (KUTZ.) HARIOT И СОПУТСТВУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

© Е. Ю. Егупова*, В. Б. Багмет, Ш. Р. Абдуллин

Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Тел.: +7 (347) 229 97 06.

*Етай: [email protected]

Изучено воздействие антибиотиков (тетрациклин, фуразолидон, ципролет) и фунгицидов (флуконазол, амфотерицин В) широкого спектра действия на штамм цианобактерии Nostoc punctiforme (Kutz.) Напо1 и сопутствующие микромицеты и бактерии. Штамм Св31ж Nostoc punctiforme (Kutz.) Hariot был выделен из пещеры Северная (Свердловская область, Россия). Концентрации всех исследованных антибиотиков свыше 50 мкг/мл подавляли жизнедеятельность цианобактерии. Сопутствующие микромицеты наиболее эффективно подавлялись амфотери-циномВ, бактерии - комбинированным препаратом (амфотерицин В + ципролет). Исследуемый штамм цианобактерии оказался более чувствителен к антибиотикам, чем к фунгицидам. Возможно, это вызвано физиологическим сходством бактерий и цианобактерий, а также их сим-биотической взаимосвязью.

Ключевые слова: Nostoc punctiforme, антибиотики, фунгициды, бактерии, микромицеты

Введение

Многие цианобактерии обладают свойствами, позволяющими использовать их в биотехнологии, в частности, для получения полезных метаболитов [1] или создания искусственных цианобактериальных сообществ [2]. В связи с этим возникает необходимость в получении аксеничных культур цианобакте-рий. Это является сложным процессом, поскольку эти организмы составляют консорциумы, включающие кроме самих цианобактерий сопутствующую микрофлору. Существуют методики по очистке водорослей от сопутствующих микроорганизмов [35], при этом некоторые водоросли сами обладают фунгицидной и фунгистатической активностью [6]. Однако культуры цианобактерий весьма специфичны, так как некоторые микроорганизмы могут прочно связываться с их клеточной стенкой или находиться в слизистом чехле (гликокаликсе) циа-нобактерий, в связи с чем подбор метода очистки является сложной задачей. Отмечено, что развитие этих организмов в аксеничных культурах происходит медленнее и приводит к морфологическим и физиологическим изменениям [3]. Поэтому изучение воздействия различных, отличающихся по механизму и спектру действия антибиотиков и фунгицидов на цианобактерии для выделения чистых культур является актуальной задачей. Цель работы - изучение воздействия антибиотиков и фунгицидов на рост и развитие представителей вида N^'0 ртсЫ-Азгтв (КШг.) Нат^ и на сопутствующие микроорганизмы.

Материал и методы исследования

Для эксперимента использовали штамм N^'0 ртсиАзгтв (КШг.) Нат^ Св31ж, выделенный из пещеры Северная (Свердловская область, Россия). Культуры выращивали на жидкой минеральной

среде Громова №6 [7]. В исследовании использовали антибиотики (тетрациклин, фуразолидон, ципролет) и фунгициды (флуконазол, амфотерицин В) широкого спектра действия. Отдельные антибиотики, фунгициды и их комбинации добавляли в жидкую питательную среду, разливали в пробирки и вносили исследуемый штамм цианобактерии. Для контроля использовали минеральную среду без антибиотиков и фунгицидов. Перед посевом цианобактерии в среду с антибиотиками и фунгицидами небольшое количество биомассы растирали в пробирке для разрушения окружающих колонии слизистых чехлов, с которыми могут быть связаны сопутствующие микроорганизмы и их споры. Штаммы культивировали при дневном освещении в течение 7 суток при комнатной температуре, затем оценивали их рост визуально и под световым микроскопом. Для выявления роста сопутствующей микрофлоры штаммы после культивирования в среде с антибиотиками и фунгицидами пересевали на картофельный агар с глюкозой (10 г/л).

Результаты и обсуждение

Концентрации всех исследованных антибиотиков свыше 50 мкг/мл подавляли жизнедеятельность цианобактерий - не образовывались гормогонии, клетки приобретали более светлую окраску. Тетрациклин в концентрации 100 мкг/мл и 200 мкг/мл полностью разрушал клетки цианобактерий, при этом было отмечено наличие акинет, не прораставших при их пересеве на чистую среду без антибиотика. Бактериальная флора даже при концентрации 200 мкг/мл не была полностью подавлена, также во всех вариантах опыта активно развивались колонии грибов (табл.).

Фуразолидон оказал статическое воздействие, при этом уже при концентрации 10 мкг/мл появлялись акинеты, концентрация 100 мкг/мл оказалась

ISSN 1998-4812

Вестник Башкирского университета. 2017. Т. 22. №1

87

летальной. При использовании антибиотика были обнаружены колонии грибов, бактериальная флора развивалась хорошо при концентрации 200 мкг/мл. Возможно, это связано с тем, что этот препарат активен в отношении грамотрицательных аэробных

микроорганизмов, тогда как клеточные стенки циа-нобактерий подобны клеточным стенкам грамотри-цательных бактерий [7], в меньшей степени к антибиотику чувствительны грамположительные микроорганизмы и некоторые простейшие и грибы [8].

Таблица

Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и фунгицидам_

Антибиотики мкг/мл Жизнеспособность организмов

и фунгициды Штамм Св31ж | Микромицеты | Бактерии

Контроль

Амфотерицин В

Тетрациклин

Флуконазол

Фуразолидон

Ципролет

0 ++ + ++

100 ++ - +

150 + - +

200 + - +

250 + - +

300 ++ - +

400 ++ - +

500 ++ - ++

750 ++ - ++

1000 + - ++

5 ++ + +

10 ++ + +

20 + + +

30 ++ + +

40 + + +

50 + + +

100 - + +

200 - + +

100 + - +

150 + - ++

200 + - ++

250 + - ++

300 + - ++

400 ++ - +

500 ++ - +

750 ++ - ++

1000 ++ - ++

5 + + +

10 + + +

20 + + +

30 + + +

40 + + +

50 + + +

100 - + +

200 - + +

5 + + +

10 + + +

20 + + +

30 + + +

40 + + -

50 + + -

100 - + -

200 - + -

200+30 + + -

200+40 + + -

300+30 + + -

300+40 + + -

400+30 + + -

400+40 + + -

200+30 + + -

200+40 + + -

300+30 + + -

300+40 + + -

400+30 + + +

400+40 + + -

Флуконазол + ципролет

Амфотерицин В + ципролет

Примечание: цианобактерии: ++ - рост активный, образование гормогониев; + -бактерии: ++ - более 10 КОЕ в чашке Петри; + - менее 10 КОЕ в чашке Петри;

рост сдержанный,; — гибель организма; микромицеты и - - организм отсутствует.

88

БИОЛОГИЯ и ЭКОЛОГИЯ

Использование ципролета помогло в очистке от бактериальной микрофлоры, начиная с концентрации 40 мкг/мл. При 30 мкг/мл оставался один вид бактерии. Во всех образцах развивались колонии грибов. Указанные концентрации антибиотика никак не сказывались на жизнедеятельности цианобакте-рии.

Фунгициды (амфотерицин В и флуконазол) способствовали очищению штамма от грибов при концентрации 100 мкг/мл. Амфотерицин В при концентрациях до 750 мкг/мл не оказывал влияния на рост и развитие цианобактерии. С повышением концентрации до 1000 мкг/мл наблюдалась задержка скорости роста штамма. Начиная с концентрации 400 мкг/мл, наблюдалось обильное образование аки-нет. Флуконазол также не оказывал влияния на жизнедеятельность цианобактерии при концентрациях до 750 мкг/мл, с повышением концентрации отмечались морфологические изменения в сторону уменьшения клеток и образование акинет. Граница летального воздействия для обоих фунгицидов так и не была установлена. По-видимому, это связано с целенаправленным механизмом воздействия флукона-зола: угнетение грибкового 14 альфа-ланостерол-ди-метилирования, опосредованного цитохромом Р450, что является неотъемлемым этапом биосинтеза грибкового эргостерола [9], а также с фунгицидным действием амфотерицина В, основанном на связывании эргостерола, образованию пор в мембране грибов и разрушении их клеток [10].

Для максимально эффективной очистки штамма Nostoc punctiforme (КШг.) Нат^ от микрофлоры использовали комбинированный препарат из наиболее активного антибиотика (ципролет) и фунгицидов (флуконазол и амфотерицин В).

Во всех вариантах опыта с комбинированными препаратами развивались микромицеты, и подавлялось развитие бактерий. Возможно, это связано с неполным разрушением слизистых чехлов цианобак-терий.

Было выявлено, что при очистке штамма Nostoc punctiforme (Kutz.) Нат^ от бактерий с использованием антибиотиков начинали массово развиваться микромицеты, хотя в контроле такого развития не наблюдалось. Применение фунгицидных препаратов привело к обратному эффекту - увеличению числа колоний бактерий. Возможно, это вызвано тем, что при использовании антибиотика или фунгицида часть микрофлоры уничтожалась, и начинали активно развиваться бактерии или микромицеты, занимая освободившуюся экологическую нишу. Исследуемый штамм Nostoc punctiforme (КШг.) Нат^ оказался более чувствителен к антибиотикам, чем к фунгицидам. Возможно, это вызвано физиологическим сходством бактерий и цианобактерий, а также

тем, что цианобактерии и некоторые виды бактерий находятся в симбиотической взаимосвязи [11].

Выводы

Таким образом, выявлен наиболее эффективный фунгицид (амфотерицин В, концентрация выше 100 мкг/мл), который, полностью подавляя микромицеты, оказывал на штамм Св31ж цианобактерии Nostoc punctiforme (Kutz.) Hariot минимальное воздействие. Полное очищение исследуемого штамма от бактериальной флоры удалось достичь с помощью комбинированных препаратов (амфотерицин B и флуконазол, концентрации выше 200 мкг/мл + ципролет (30 и 40 мкг/мл)). При ингибировании роста бактериальной микрофлоры начинают активно развиваться микромицеты, при использовании фунгицидов массово развиваются бактерии. Исследуемый штамм Nostoc punctiforme (Kutz.) Hariot оказался более чувствителен к антибиотикам, чем к фунгицидам.

ЛИТЕРАТУРА

1. Rezanka T., Dembitsky V. M. Metabolites produced by cyano-bacteria belonging to several species of the family Nostocaceae // Folia Microbiol. 2006. V. 51. Pp. 159-182.

2. Жубанова А. А., Ерназарова А. К., Кайырманова Г. К., За-ядан Б. К., Савицкая И. С., Абдиева Г. Ж., Кистаубаева А. С., Акимбеков Н. Ш. Конструирование циано-бактериаль-ного консорциума на основе аксеничных культур циа-нобактерий и гетеротрофных бактерий для биоремедиации нефтезагрязненных почв и водоемов // Физиология растений. 2013. Т. 60. №4. С. 588-595.

3. Сиренко Л. А., Сакевич А. И., Осипов Л. Ф., Лукина Л. Ф., Кузьменко М. И., Козицкая В. Н. и др. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. Киев: Наукова думка, 1975. 248 с.

4. Guillard R. R. L. Purification methods for miсrоаlgае // Andersen R. A. Algal culturing techniques. Elsevieг Aсаdеmiс Press. 2005. Р. 117-132.

5. Рябова А. С., Назарова Т. А., Кузьмина Л. Ю., Абдуллин Ш. Р. Действие антибиотиков и ультрафиолетового излучения на цианобактерии, диатомеи и зеленые водоросли // Известия Уфимского научного центра РАН. 2015. №4. C. 131133.

6. Абдуллин Ш. Р., Багмет В. Б., Кузьмина Л. Ю., Рябова А. С., Назарова Т. А. Фунгицидная активность некоторых микроводорослей пещер // Вестник БашГУ. 2014. №4. С. 1216-1218.

7. Громов Б. В. Ультраструктура сине-зеленых водорослей. Л.: Наука, 1976. 91 с.

8. Сипливый В. А., Дронов А. И., Конь Е. В., Евтушенко Д. В. Антибиотики и антибактериальная терапия в хирургии. Киев, 2006. 100 с.

9. Лабинский Р. В., Дашко М. А. Использование препарата «дифлюзол» в лечении микозов разной этиологии // Микология и демодекоз. 2007. №2. С. 1-4.

10. Общая характеристика и классификация антимикробных препаратов (АМП). Особенности механизмов действия. URL: http://www.antibiotic.ru/rus/de/users/learn/05/5.shtml

11. Krings M., Hass H., Kerp H., Taylor T. N., Agerer R., Dotzler N. Endophytic Cyanobacteria in a 400-Million-Year-0ld Land Plant: A Scenario for the Origin of a Symbiosis // Palaeobot. Palynol. 2009. V. 153. P. 62-69.

Поступила в редакцию 06.10.2016 г.

ISSN 1998-4812

BeciHHK EamKHpcKoro yHHBepcHTeTa. 2017. T. 22. №1

89

THE INFLUENCE OF ANTIBIOTICS AND FUNGICIDES ON THE CYANOBACTERIUM NOSTOC PUNCTIFORME (KUTZ.) HARIOT AND RELATED MICROORGANISMS

© E. Yu. Egupova*, V. B. Bagmet, Sh. R. Abdullin

Bashkir State University 32 Zaki Validi Street, 450076 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.

Phone: +7 (347) 229 97 06.

*Email: [email protected]

Selection of cyanobacteria axenic strains is an actual problem and it is difficult one because these organisms form consortia with different bacteria and micromycetes. The influence of antibiotics (tetracycline, furazolidone, tsiprolet) and fungicides (fluconazole, amphotericin B) of wide spectrum of activity on the strain of cyanobacterium Nostoc punctiforme (Kutz.) Hariot and concomitant micromycetes and bacteria was studied. Nostoc punctiforme (Kutz.) Hariot strain Sv31j was isolated from the cave Severnaya (Sverdlovsk region, Russia). All studied antibiotics in concentrations of more than 50 ^g/ml inhibited the activity of cyanobacteria. The most effective fungicide completely inhibiting the micromycetes (ampho-tericin B in concentration above 100 ^g/ml) had minimal effect on the studied strain of cyanobacteria. Complete purification of Nostoc punctiforme (Kutz.) Hariot Sv31j strain from bacterial flora was achieved using the combined drugs (amphotericin B and fluconazole in concentration above 200 ^g/ml and tsiprolet in concentrations of 30 or 40 ^g/ml). The studied strain Nostoc punctiforme (Kutz.) Hariot was more sensitive to antibiotics than the fungicides. The authors suppose that it is due to the physiological similarity of bacteria and cyanobacteria and due to symbiotic relationships between them.

Keywords: Nostoc punctiforme, antibiotics, fungicides, bacteria, micromycetes.

Published in Russian. Do not hesitate to contact us at [email protected] if you need translation of the article.

REFERENCES

1. Rezanka T., Dembitsky V. M. Folia Microbiol. 2006. Vol. 51. Pp. 159-182.

2. Zhubanova A. A., Ernazarova A. K., Kaiyrmanova G. K., Zayadan B. K., Savitskaya I. S., Abdieva G. Zh., Kistaubaeva A. S., Akimbekov N. Sh. Fiziologiya rastenii. 2013. Vol. 60. No. 4. Pp. 588-595.

3. Sirenko L. A., Sakevich A. I., Osipov L. F., Lukina L. F., Kuz'menko M. I., Kozitskaya V. N. i dr. Metody fiziologo-biokhimicheskogo issledovaniya vodoroslei v gidrobiologicheskoi praktike [Methods of physiological and biochemical studies of algae in hydrobiological practice]. Kiev: Naukova dumka, 1975.

4. Guillard R. R. L. Andersen R. A. Algal culturing techniques. Elsevieg Asademis Press. 2005. Pp. 117-132.

5. Ryabova A. S., Nazarova T. A., Kuz'mina L. Yu., Abdullin Sh. R. Izvestiya Ufimskogo nauchnogo tsentra RAN. 2015. No. 4. Pp. 131-133.

6. Abdullin Sh. R., Bagmet V. B., Kuz'mina L. Yu., Ryabova A. S., Nazarova T. A. Vestnik BashGU. 2014. No. 4. Pp. 1216-1218.

7. Gromov B. V. Ul'trastruktura sine-zelenykh vodoroslei [Ultrastructure of blue-green algae]. Leningrad: Nauka, 1976.

8. Siplivyi V. A., Dronov A. I., Kon' E. V., Evtushenko D. V. Antibiotiki i antibakterial'naya terapiya v khirurgii [Antibiotics and antibiotic therapy in surgery]. Kiev, 2006.

9. Labinskii R. V., Dashko M. A. Mikologiya i demodekoz. 2007. No. 2. Pp. 1-4.

10. Obshchaya kharakteristika i klassifikatsiya antimikrobnykh preparatov (AMP). Osobennosti mekhanizmov deistviya. URL: http://www.antibiotic.ru/rus/de/users/learn/05/5.shtml

11. Krings M., Hass H., Kerp H., Taylor T. N., Agerer R., Dotzler N. Palaeobot. Palynol. 2009. Vol. 153. Pp. 62-69.

Received 06.10.2016.