CC BY
22
DOI: 10.23868/201906020
воздействие ангиотензина ii на созревание яйцеклеток коров in ViTRo
И.Г. Сметанина, Л.В. Татаринова
Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал Федерального научного центра животноводства — ВИЖ имени акад. Л.К. Эрнста, Калужская область, Боровск, Россия
effect of angiotensin ii on maturation of oocytes of cows iN vitro
I.G. Smetanina, L.V. Tatarinova
All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry, and Nutrition of Animals — Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry, Borovsk, Kaluga oblast, Russia
e-mail: sme.irina2011@Yandex.ru
Физиологическая функция ангиотензина II, в частности, его роль в созревании яйцеклеток коров, до конца не ясна. Цель работы: определить влияние различных концентраций ангиотензина II на созревание ядра яйцеклеток коров in vitro в бессывороточной среде aMEM с гормональными добавками или без них.
В первой серии экспериментов яйцеклетки коров созревали in vitro в среде aMEM, содержащей ангиотензин II в концентрациях 10-11, 10-9, 10-7 М и гормональные добавки. Во второй серии экспериментов яйцеклетки культивировали в среде aMEM с ан-гиотензином II в концентрации 10-7 М без гормональных добавок. Критерием успешного созревания ядра считается способность яйцеклеток достигать стадии метафазы II. Результаты экспериментов показали, что ангиотензин II в концентрациях 10-11, 10-9, 10-7 М не оказывал воздействия на созревание ядра яйцеклеток in vitro в том случае, если среда созревания содержала гормональные добавки (57,1% яйцеклеток с первым полярным тельцем в контроле и 64,6% в опыте; 60,8% и 58,6%; 65,2% и 66,7%, соответственно). В отсутствие гормональных добавок ангиотензин II в концентрации 10-7 М подавлял выделение первого полярного тельца (43,6% в контроле и 29,3% в опыте, P<0,05).
Полученные данные позволяют сделать предварительный вывод о том, что гормоны нивелируют ингибирующий эффект ангиотензина II на созревание ядра яйцеклеток коров in vitro.
Дальнейшие исследования необходимы для изучения механизмов, посредством которых ангиотензин II регулирует созревание яйцеклеток коров. Вопрос об ангиотензине II как о возможной составляющей культуральных сред остается открытым.
ключевые слова: яйцеклетки, созревание in vitro, ангио-тензин II, коровы.
Введение
Многие вещества, воздействующие на созревание яйцеклеток млекопитающих в организме, неиден-тифицированы, поэтому, полноценность созревших in vitro яйцеклеток ниже, чем созревших in vivo. Для полноценного созревания яйцеклеток in vitro необходимо определить эти вещества, с тем, чтобы их можно было использовать в качестве регуляторных добавок в систему культивирования.
Ренин-ангиотензиновая система (РАС), включает в себя, в частности, ангиотензин II (Анг II) — наиболее активный пептид РАС и его рецепторы. Известно, что предшественник ангиотензина II — ангиотензиноген, синтезируется печенью и расщепляется с помощью фермента ренина, секретируемого специализированными клетками почек, до декапептида и ангиотен-зина I (Анг I). Ангиотензин-превращающий фермент, имеющийся в большом количестве в эндотелиальных клетках, расщепляет Анг I до Анг II.
РАС отвечает за многие процессы в организме млекопитающих, в том числе за регуляцию давления крови, метаболизм воды и электролитов и стимуляцию пролиферации эндотелиальных клеток кровеносных сосудов в мышечной ткани. Кроме этого, доказано участие РАС
Physiological function of angiotensin II, in particular, the role of angiotensin II in the maturation of cows' eggs is not sufficiently evaluated. The purpose of this study was to evaluate the effect of different concentrations of angiotensin II on the maturation of the nuclei of cows' eggs in vitro in serum-free medium aMEM with hormonal additives or without them.
In the first series of experiments, the cows' eggs matured in vitro in a medium containing hormonal additives with three different concentrations of angiotensin II (10-11, 10-9, 10-7 M). The criterion of successful maturation was the ability of the eggs to reach the stage of metaphase II. Our results demonstrate that angiotensin II in concentrations of 10-11, 10-9, 10-7 M does not affect the maturation of the egg nucleus in vitro if the maturation medium contained hormonal additives (57,1% eggs with the first polar body in the control vs 64,6% in the experiment; 60,8% vs 58,6%; 65,2% vs 66,7%, respectively).
In the second series of experiments, the eggs were cultured in a medium without hormonal additives, where angiotensin II was added to a concentration of 10-7 M. Angiotensin II at a concentration of 10-7M significantly suppressed the release of the first polar body (43,6% in the control vs 29,3% in the experiment, P<0,05).
This allows us to make a preliminary conclusion that the hormones cancel the inhibitory effect of angiotensin II on the maturation of the nucleus of cows' eggs in vitro.
Further research is needed on the mechanisms by which angiotensin II regulates the maturation of cows' eggs. The question of angiotensin II as a possible component of culture media remains open.
Keywords: eggs, maturation in vitro, angiotensin II, cows.
в синтезе и секреции эстрогенов и простагландинов, регуляции роста фолликулов яичника, овуляции и атре-зии, что позволило ввести концепцию «локальной» или «тканевой» РАС [1-6]. Однако физиологическая функция Анг II в яичниках до сих пор не ясна в полном объеме; широкая видовая вариабельность делает ее понимание еще более сложной.
Установлено, что ближе к овуляции в яичниках уровень Анг II повышается после введения кроликам хориони-ческого гонадотропина человека (хГч) [7], коровам — лютеинизирующего гормона (ЛГ) [3, 8], а женщинам — человеческого менопаузального гонадотропина (чМг) и хГч [9]. Недавно впервые было обнаружено, что уровень Анг II в фолликулярной жидкости человека коррелирует с количеством созревших ооцитов, полученных после стимуляции яичников для эстракорпорального оплодотворения [10]. Показано, что у свиней Анг II напрямую стимулирует созревание яйцеклеток in vitro из маленьких и средних фолликулов [11]. В тоже время, Анг II не воздействует на созревание ядра яйцеклеток коров in vitro, когда ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) культивировали в отсутствие фолликулярных клеток. однако, если яйцеклетки культивировали в присутствии текальных клеток, Анг II нивелировал их ингибирующее действие [12].
Одной из причин видового различия физиологической роли РАС может являться разная клеточная локализация Анг II рецепторов в овариальных фолликулах [2].
Описано два основных подтипа Анг II рецепторов — АТ1 и АТ2. Считается, что АТ1 рецепторы опосредуют множество известных эффектов Анг II: сокращение гладкой мускулатуры, секреция альдостерона и регуляция кровяного давления. Ат2 рецепторы индуцируют апоптоз фибробластов мыши и клеток феохромоцитомы крысы [13], а также репродуктивные функции, включая стероидогенез, созревание яйцеклеток и овуляцию [1, 14].
В первоначальных исследованиях по изучению локализации Анг II рецепторов в фолликулах коров с помощью меченного радиоактивным йодом Анг II было обнаружено, что он связывается преимущественно или эксклюзивно с клетками теки [5, 12, 15]. Однако, как оказалось, лигандный метод не обладает достаточной чувствительностью для детектирования Анг II, связанного с клетками гранулезы. Используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени, удалось определить матричную РНК (мРНК) АТ1 и Ат2 рецепторов как в клетках теки, так и в гранулезных клетках коров, и в гранулезных клетках неатретических фолликулов коров. Количество АТ2 рецепторов было больше, чем в гранулезе атретиче-ских. Важно отметить, что синтез мРНК Ат2 рецепторов в гранулезе активировался фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) [16]. Методом иммуногистохимии те же авторы обнаружили Анг II как в клетках теки, так и гранулезы, что согласуется с данными ПЦР [16]. У свиней Анг II был найден в zona pellucidae и гранулезных клетках. Распределение АТ1 рецептора соответствовало локализации самого Анг II, а АТ2 рецептор в основном находился в строме и текальных клетках фолликулов [11].
Выраженные различия, связанные с локализацией и синтезом Анг II рецепторов в разных клетках овариаль-ных фолликулов, определяют межвидовую вариабельность физиологической роли РАС.
В связи с тем, что роль Анг II в созревании яйцеклеток коров оценена неполно, цель работы состояла в определении воздействия разных концентраций ДнгП на ядерное созревание яйцеклеток коров in vitro в бессывороточной среде aMEM с гормональными добавками или без них.
Материал и методы
Для созревания яйцеклеток использовали модифицированную методику, описанную ранее [17-20].
Яичники коров транспортировали с мясокомбината в лабораторию в течение 2-3 ч. при 30°С в фос-фатно-солевом буфере Дюльбекко (ПанЭко, Россия). Яйцеклетки извлекали из антральных фолликулов диаметром 2-8 мм методом рассечения, отбирали яйцеклетки с многослойным компактным кумулюсом, в каждую лунку 4-луночных планшетов (Nunc, Дания) вносили 30 ОКк в 500 мкл среды созревания следующего состава: аМЕМ (Sigma, США), 0,2 мМ пирувата натрия (Sigma, США), 2 мМ глутамина (Sigma, США) и 100 ед./ мл пенициллин/стрептомицина (ПанЭко, Россия). Чтобы исключить воздействие белков, факторов роста и других компонентов сыворотки на созревание яйцеклеток их инкубировали в бессывороточной среде.
Для определения эффектов разных концентраций Днг II на ядерное созревание яйцеклеток коров in vitro было поставлено 2 серии экспериментов. В первой серии экспериментов в среду созревания добавляли 1 мкг/мл гипо-физарного свиного ФСГ (ФСГ-супер, ООО Агробиомед, ВниИфБиП с/х животных, Россия), 0,3 ед./мл хГч (Московский эндокринный завод, Россия) и Анг II (Sigma, США) до конечных концентраций 10-11, 10-9, 10-7 М;
во второй серии экспериментов в среду созревания добавляли Анг II до конечной концентрации 10-7 М. Контролем служили среды без Анг II. 100Х сток Анг II готовили разведением пептида в фосфатном-солевом буфере Дюльбекко до концентрации 10-5 М, аликвотировали и хранили при -20°С. Все эксперименты проводили в трех-шести повторах, результаты которых суммировали.
Через 22 ч. инкубирования яйцеклеток при температуре 38,5°С в атмосфере 5% СО2 их освобождали от клеток кумулюса с помощью 0,5% раствора гиалуро-нидазы (Sigma, США) и механического пипетирования. Выделение первого полярного тельца (ППт, морфологический критерий достижения яйцеклетками стадии метафазы II) оценивали под световым микроскопом (МБС-10, Россия) при увеличении х98. Ранее нами было показано, что присутствие первого полярного тельца является высокодостоверным показателем, характеризующим завершение ядерного созревания; коэффициент корреляции между наличием ППТ и стадией М II составлял 0,95 (P<0,01) [21].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением t-критерия Стьюдента.
Результаты
В первой серии экспериментов яйцеклетки коров созревали in vitro в среде с гормонами, куда добавляли Анг II в трех разных концентрациях, во второй серии экспериментов в среде без гормонов, куда Анг II вносили в максимально используемой концентрации. Результаты экспериментов показали, что Анг II в концентрациях 10-11, 10-9, 10-7 М не влиял на созревание ядра яйцеклеток in vitro в том случае, если в среду созревания были включены гормональные добавки (табл. 1). Однако, если в среду созревания гормональные добавки не включали, Анг II в концентрации 10-7 М достоверно подавлял выделение ППт (табл. 2). Полученные данные позволяют сделать предварительный вывод о том, что гормоны аннулируют ингибирующий эффект Анг II при созревании ядра яйцеклеток коров in vitro.
Обсуждение
В наших экспериментах продемонстрировано, что Анг II в концентрациях 10-11, 10-9, 10-7 М не воздействовал на выделение ППТ в бессывороточной среде с гормональными добавками. Однако, когда в среду созревания гормоны не включали, Анг II в концентрации 10-7 М достоверно ингибировал достижение яйцеклетками стадии М II. На основании полученных результатов можно предположить, что гормоны нивелируют ингибирующее действие Анг II на созревание ядра яйцеклеток в безбелковой бесклеточной (без сокультивирования с клетками кумулюса, гранулезы, теки или яйцевода) системе.
Известны две основные работы, в которых исследовалось воздействие Анг II на созревание яйцеклеток коров в in vitro системе [12, 22]. J.C. Giometti с соавт. (2005) показали, что Анг II в концентрациях 10-11, 10-9, 10-7 М в безбелковой среде 199 hEpES без гормонов в отсутствие фолликулярных клеток (клеток теки) не оказывал влияния на процент яйцеклеток, достигающих стадии разрушения зародышевого пузырька, метафазы I (M I) и М II после 7, 12 и 18 ч. культивирования, соответственно [12]. В том случае, когда клетки теки были добавлены в культуральную систему, Анг II в минимальной концентрации 10-11 М был способен аннулировать ингибирующий эффект, производимый этими клетками на созревание ядра яйцеклеток коров [12]. J.R. Stefanello с соавт. (2006) подтвердили выводы своих коллег [22]. Анг II аннулировал ингибирующий эффект фолликулярных
Таблица 1. Воздействие различных концентраций Анг II на созревание ядра яйцеклеток коров, инкубированных in vitro в среде с гормонами
Гпиппя Климритпямиа ЧислО
гамет Анг II в опытной группе яйцеклеток яйцеклеток с ППТ, n (%)
Контрольная 191 109 (57,1)
Опытная 10-11 М 212 137 (64,6)
Контрольная 189 115 (60,8)
Опытная 10-9 М 133 78 (58,6)
Контрольная 92 60 (65,2)
Опытная 10-7 М 90 60 (66,7)
Примечание: 10 11 М — сумма результатов от пяти опытов, 10 9 М — сумма результатов от трех опытов, 10 7 М — сумма результатов от трех опытов
Таблица 2. Воздействие Анг II на созревание ядра яйцеклеток коров, инкубированных in vitro в среде без гормонов
Группа Концентрация Число
гамет Анг II в опытной группе яйцеклеток яйцеклеток с ППТ, n (%)
Контрольная 94 41 (43,6)а
Опытная 10-7 М 92 27 (29,3)6
Примечание: сумма результатов от шести опытов. а, б — различия достоверны, Р<0,05
клеток (клеток теки) на ядерное созревание ядра яйцеклеток коров независимо от присутствия в среде гонадо-тропинов. Авторы сделали вывод, что Анг II воздействует на созревание яйцеклеток коров опосредованно, через клетки теки, а напрямую его действие не проявляется независимо от времени культивирования.
Данные, полученные в наших экспериментах, противоречат результатам работ J.C. Giometti с соавт. (2005) [12] и J.R. Stefanello с соавт. (2006) [22], однако это можно объяснить множеством причин, в том числе используемой средой культивирования, источником гормонов, породой скота, стадией эстрального цикла и т. д.
В то же время в опытах, проведенных на яйцеклетках свиней [11] и овец [23, 24], было установлено, что, с одной стороны, действие Анг II проявлялось напрямую в бесклеточной культуральной системе, как и в наших исследованиях, но, с другой стороны, в отличие от нашей работы, Анг II улучшал созревание яйцеклеток как в бессывороточной [11], так и в среде с сывороткой [23, 24], дополненной гормонами.
В последние годы изучение роли Анг II в процессах созревания яйцеклеток проводят на модели
ЛИТЕРАТУРА:
1. Yoshimura Y., Karube M., Aoki H. et al. Angiotensin II induces ovulation and oocyte maturation in rabbit ovaries via the AT2 receptor subtype. Endocrinol. 1996; 137: 1204-11.
2. Yoshimura Y. The ovarian renin-angiotensin system in reproductive physiology. Front. Neuroendocrinol. 1997; 18: 191-247.
3. Acosta T.J., Bersha B., Ozawa T. et al. Evidence for a local endothelin-angiotensin-atrial natriuretic peptide system in bovine mature follicles in vitro: effects on steroid hormones and prostaglandin secretion. Biol. Reprod. 1999; 61: 1419-25.
4. Acosta T.J., Ozawa T., Kobayashi S. et al. Periovulatory changes in the local release of vasoactive peptides, prostaglandin F2a, and steroid hormones from bovine mature follicles in vivo. Biol. Reprod. 2000; 63: 1253-61.
5. Schauser K.H., Nielsen A.H., Winther H. et al. Localization of the renin-angiotensin system in the bovine ovary: cyclic variation of the angiotensin II receptor expression. Biol. Reprod. 2001; 65: 1672-80.
6. Ferreira R., Oliveira J.F., Fernandes R. et al. The role of angiotensin II in the early stages of bovine ovulation. Reproduction 2007; 134: 713-9.
7. Yoshimura Y., Koyama N., Karube M. et al. Gonadotropin stimulates ovarian renin-angiotensin system in the rabbit. J. Clin. Invest. 1994; 93: 180-7.
культивирования овариальных фолликулов. Показано, что использование аналога Анг II рецептора (ATII-Rc) достоверно повышало эффективность in vitro созревания яйцеклеток у мышей при использовании мультифолликулярной культуральной системы. In vitro культивирование овариальных фолликулов считается перспективной биоинженерной техникой для получения полноценных ооцитов из замороженных овариальных тканей раковых больных [25].
Дальнейшие исследования необходимы для выяснения механизмов, посредством которых Анг II влияет на созревание яйцеклеток у млекопитающих. Вопрос об Анг II как о возможной составляющей культуральных сред остается открытым.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Госзадания AААА-А18-118021590132-9 № 0445-2019-0030.
конфликт интересов
Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
8. Shimizu T., Berisha B., Schams D. et al. Changes in the messenger RNA expressions of the endothelin-1 and angiotensin systems in mature follicles of the superovulated bovine ovary. J. Reprod. Dev. 2007; 53: 655-62.
9. Lightman A., Tartatzis B.C., Rzasa P.J. et al. The ovarian renin-angiotensin system: renin-like activity and angiotensin II/III immunoreactivity in gonadotropin-stimulated and un-stimulated human follicular fluid. Am. J. Obstet. Gynecol. 1987; 156: 808-16.
10. Cavallo I.K., Dela Cruz C., Oliveira M.L. et al. Angiotensin-(1-7) in human follicular fluid correlates with oocyte maturation. Hum. Reprod. 2017; 32(6): 1318-24.
11. Li Y.H., Jiao L.H., Liu R.H. et al. Localization of angiotensin II in pig ovary and its effects on oocyte maturation in vitro. Theriogenology 2004; 61: 447-59.
12. Giometti J.C., Bertagnolli A.C., Ornes R.C. et al. Angiotensin II reverses the inhibitory action produced by theca cells on bovine oocyte nuclear maturation. Theriogenology 2005; 63: 1014-25.
13. Yamada T., Horiuchi M., Dzau V.J. Angiotensin II type 2 receptor mediates programmed cell death. PNAS USA 1996; 93: 156-60.
14. Kuji N., Sueoka K., Miyazaki T. et al. Involvement of angiotensin II in the process of gonadotropin-induced ovulation in rabbits. Biol. Reprod. 1996; 55: 984-91.
15. Brunswig-Spickenheier B., Mukhopadhyay A.K. Characterization of angiotensin II receptor subtype on bovine thecal cells and its regulation by luteinizing hormone. Endocrinol. 1992; 131: 1445-52.
16. Portela V.M., Goncalves P.B.D., Veiga A.M. et al. Regulation of angiotensin type2 receptor in bovine granulosa cells. Endocrinol. 2008; 149: 5004-11.
17. Сметанина И.Г., Татаринова Л.В., Кривохарченко А.С. Влияние состава культуральных сред на созревание ооцитов и развитие эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. Онтогенез 2000; 31(2): 139-43. [Smetanina I.G., Tatarinova L.V., Krivokharchenko A.S. Influence of the culture medium composition on cattle oocyte maturation and embryogenesis in vitro. Russian Journal of Developmental Biology 2000; 31(2): 139-43].
18. Кривохарченко А.С., Сметанина И.Г., Татаринова Л.В. Оплодотворение и последующее развитие ооцитов крупного рогатого скота после сокращенной инкубации со сперматозоидами. Онтогенез 2001; 32(4): 283-7. [Krivokharchenko A.S., Smetanina I.G., Tatarinova L.V. Fertilization and subsequent development of cattle oocytes after reduced incubation with spermatozoa. Russian Journal of Developmental Biology 2001; 32(4): 283-7].
19. Сметанина И.Г., Татаринова Л.В., Кривохарченко А.С. Оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота in vitro в безбелковой культуральной системе. Онтогенез 2006; 37(6): 438-43. [Smetanina I.G., Tatarinova L.V., Krivokharchenko A.S. In vitro fertilization of bovine oocytes in protein-free culture system. Russian Journal of Developmental Biology 2006; 37(6): 438-43].
20. Сметанина И.Г., Татаринова Л.В., Кривохарченко А.С. Влияние гормонов на созревание ооцитов крупного рогатого скота in vitro. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2014; 157(5): 655-8. [Smetanina I.G., Tatarinova L.V., Krivokharchenko A.S. Effects of hormones on in vitro maturation of cattle oocytes. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2014; 157(5): 655-8].
21. Сметанина И.Г., Кривохарченко А.С., Иванова Л.Б. и др. Созревание in vitro ооцитов крупного рогатого скота, взятых из яичников различного морфофункционального состояния. Онтогенез 2002; 33(3): 201-5. [Smetanina I.G., Krivokharchenko A.S., Ivanova L.B. et al. In vitro maturation of cattle oocytes taken from ovaries with different morphofunctional state. Russian Journal of Developmental Biology 2002; 33(3): 201-5].
22. Stefanello J.R., Barreta M.H., Porciuncula P.M. et al. Effect of angiotensin II with follicle cells and insulin-like growth factor-I or insulin on bovine oocyte maturation and embryo development. Theriogenology 2006; 66: 2068-76.
23. Naderi M.M., Borjian Boroujeni S., Sarvari A. et al. The Effect of Media Supplementation with Angiotensin on Developmental Competence of Ovine Embryos Derived from Vitrified-warmed Oocytes. Avicenna J. Med. Biotechnol. 2016a; 8: 139-44.
24. Naderi M.M., Borjian Boroujeni S., Sarvari A. et al. The Effect of Angiotensin on the Quality of In Vitro Produced (IVP) Sheep Embryos and Expression of Na(+)/K(+)/ATPase. Avicenna J. Med. Biotechnol. 2016b; 8(1): 9-15.
25. Kim Y.J., Kim Y.Y., Kang B.C. et al. Induction of multiple ovulation via modulation of angiotensin II receptors in vitro ovarian follicle culture models. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2017; 11(11): 3100-10.
Поступила: 28.02.2019
