CC BY
19
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
цитометр Navios™ (Beckman Coulter). Фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови оценивали, анализируя особенности их взаимодействия со смесью стафилококков. Содержание цитокинов в сыворотке крови (IL-10, МСР-1 и TGF-ß) определяли, используя тест-системы для ИФА (Bender MedSystems, США). Исследование иммунных клеток крови выявило снижение количество NK (CD3-CD161+) клеток в группе Б по сравнению с другими группами крыс. При этом процентное содержание NKT (CD3+CD161+) было выше у животных, у которых коррекция дисбиоза не проводилась (группа К1). При анализе биоптатов селезенки обращало на себя внимание низкое содержание FoxP3+CD25+ лимфоцитов у животных из группы К1 (по сравнению с остальными крысами) на фоне повышения содержания этой популяции клеток в группах А, Б и Е по сравнению с К2. Выявлена тенденция к снижению пула В-лимфоцитов (CD45RA+) в селезенке животных из групп Е и А. Содержание противовоспалительного и регуляторного цитокина IL-10 в сыворотке крови было минимальным в группе К1, а в группах Б и Е содержание IL-10 было выше, чем у крыс из групп А и К2. Не было обнаружено достоверных различий в количестве МСР-1 и TGF-ß в сыворотке крови животных из различных групп. Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови была наиболее низкой у крыс из группы К1 и у крыс из групп А и Б, однако она была выше, чем в группе К2. Таким образом, выявлены общие тенденции и специфические особенности изменений в иммунитете при коррекции дисбиотических нарушений с использованием аутопроби-отических энтерококков, бифидобактерий и анаэробного консорциума. Последний воспроизводит положительные эффекты нескольких моноштаммовых аутопробиотиков.
Работа поддержана грантом РНФ № 16-15-10085.
ЭКСПРЕССИЯ HLA-DR НА NK-КЛЕТКАХ АССОЦИИРОВАНА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО С МЕНЕЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ С ПОВЫШЕННОЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Ерохина С.А., Стрельцова М.А., Каневский Л.М., Коваленко Е.И.
Институт биоорганической химии РАН, Москва, Россия
В норме в периферической крови человека содержится небольшая доля NK-клеток, экспрессирующих HLA-DR, которая увеличивается при стимуляции NK-клеток IL-2 in vitro. In vivo повышенный уровень HLA-DR+ NK-клеток регистрируется при определенных патологических состояниях, таких как иммунодефицит на фоне HIV-инфекции, рассеянный склероз, IgA-нефропатия. Функциональное значение этой молекулы на NK-клетках все еще обсуждается: есть доказательства того, что NK-клетки могут использовать HLA-DR для презентации антигенов, в других работах HLA-DR рассматривается как маркер активации или пролиферации NK-клеток. Целью данной работы было изучение взаимосвязи между экспрессией HLA-DR и стадиями развития NK-клеток, а также их функциональной активностью. Работа проводилась на свежевыделен-ных NK-клетках и клетках, полученных в системе активации in vitro с использованием IL-2 и клеток K562, экс-прессирующих мембраносвязанный IL-21 (K562-mbIL21). Данная комбинация стимулов используется для наращивания NK-клеток в целях иммунотерапии.
Анализ экспрессии HLA-DR на различных стадиях дифференцировки свежевыделенных NK-клеток по-
казал, что в целом доля HLA-DR-позитивных клеток в периферической крови была значительно выше среди менее дифференцированных NK-клеток CD56bright, чем среди относительно более зрелых клеток CD56dim. Однако у некоторых людей наблюдалась достаточно высокая доля HLA-DR-положительных NK-клеток в терминально дифференцированной субпопуляции CD56dimCD57+ (группа 2). Индивидуумы из группы 2 также показали более высокий уровень NKG2C+ NK-клеток в HLA-DR-положительной субпопуляции по сравнению с HLA-DR-отрицательной. CD56dimCD57+NKG2C+ фенотип указывает на то, что экспрессия HLA-DR может быть в данном случае связана с так называемыми NK-клетками памяти. Функциональный тест показал, что свежевыделенные HLA-DR-позитивные NK-клетки продуцируют IFNy интенсивнее, чем HLA-DR-отрицательные, как в субпопуляции CD56bright, так и в субпопуляции CD56dim.
При стимуляции свежевыделенных NK-клеток IL-2 и K562-mbIL21, но не растворимым IL-21, мы наблюдали многократное увеличение доли HLA-DR-положительных NK-клеток. Помимо увеличения экспрессии HLA-DR, большинство NK-клеток после 6 дней стимуляции демонстрировали фенотип CD56brightCD57—NKG2A+, который характеризует «ранние» NK-клетки. Кроме того, после стимуляции IL-2 и K562-mbIL21 NK-клетки HLA-DR+ все так же демонстрировали более интенсивную продукцию IFNy по сравнению с клетками HLA-DR-.
Таким образом, как в состоянии покоя, так и после активации экспрессия HLA-DR в основном была ассоциирована с менее зрелыми NK-клетками. Однако ее также можно обнаружить in vivo в терминально дифференцированных NK-клетках. Происхождение и особенности данной субпопуляции HLA-DR+CD56dimCD57+ еще предстоит выяснить. HLA-DR-позитивные NK-клетки как ex vivo, так и после стимуляции IL-2 и K562-mbIL21 характеризовались повышенной способностью к продукции IFNy.
Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант № 16-34-00836.
ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ФЕНОТИП ФИБРОБЛАСТОПОДОБНЫХ СИНОВИОЦИТОВ КОРРЕЛИРУЕТ С ТЯЖЕСТЬЮ ЗАБОЛЕВАНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ АНТИТЕЛО-ЗАВИСИМОГО АРТРИТА У МЫШЕЙ
Жданова А.С.1 2, Гоголева В.СЛ 2, Зварцев Р.В.1 2, Недоспасов С.А.1, 2, Друцкая М.С.1, 2
1ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва, Россия 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Ревматоидный артрит (РА) — хроническое воспалительное аутоиммунное заболевание, приводящее к прогрессирующему повреждению суставных и околосуставных структур, которое характеризуется образованием аутоантител и синовиальной гиперплазией. Важную роль в процессе разрушения суставов играют фибробластоподобные синовиоциты (FLS). В норме их функция заключается в производстве внеклеточных матриксных компонентов, которые поддерживают нормальный состав синовиальной жидкости и суставную поверхность. Однако показано, что во время воспалительного процесса эти клетки приобретают патогенный фенотип (Hardy R.S. et al., 2013). Активированные цито-кинами FLS являются главным источником IL-6 и других
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
цитокинов, хемокинов, а также молекул адгезии и металло-протеиназ, способствуя активации остеокластов, миграции и пролиферации клеток иммунной системы в очаг воспаления, что приводит к разрушению хрящевой и костной ткани (Шнайдер М.А. и соавт., 2016). Несмотря на растущий интерес к фибробластоподобным синовиоцитам и их роли в патогенезе РА, большинство работ произведено на культурах клеток, полученных от больных пациентов (Crowley T et al., 2017). Следовательно, изучение провоспалительных свойств FLS, выделенных из мышиных суставов, in vitro остается актуальной проблемой и имеет особый интерес не только для лучшего понимания патологии в экспериментальных моделях воспалительных заболеваний суставов, но также может представлять интерес для изучения новых подходов антицитокиновой терапии.
Цель. Изучить патогенный фенотип FLS, выделенных из воспаленных суставов мышей, больных артритом, в сравнении с фибробластоподобными синовиоцитами, полученными от здоровых доноров.
В работе сравнивали культуры FLS, полученные от мышей дикого типа и мышей, дефицитных по TNF, в экспериментальной модели антитело-зависимого артрита. На четвертом пассаже первичные клеточные культуры стимулировали TNF и оценивали уровень экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени в культурах, полученных из здоровых и артритных мышиных суставов. Также был произведен анализ продукции IL6 культурами после стимуляции TNF и без нее методом иммунофер-ментного анализа (ELISA).
Было установлено, что активированные TNF фибробла-стоподобные синовиоциты от артритных мышей характеризуются повышенной экспрессией провоспалительных ци-токинов, хемокинов и молекул адгезии в сравнении с FLS из здоровых суставов. При этом было обнаружено, что у фи-бробластоподобных синовиоцитов, полученных от TNF KO мышей, в которых был индуцирован артрит, уровень продукции IL-6 значительно снижен относительно артритной культуры дикого типа, но превышает уровень его продукции у FLS из здоровых суставов, что коррелирует с отсутствием внешних признаков развития артрита и пониженной продукцией системного IL-6 у TNF-дефицитных мышей.
Полученные результаты подтверждают, что мышиные фибробластоподобные синовиоциты сохраняют патологический фенотип на протяжении нескольких пассажей, и в дальнейшем культуры FLS, полученные из артритных суставов мышей, можно использовать для изучения и создания новых подходов анти-цитокиновой терапии ревматоидного артрита.
Работа была осуществлена при поддержке РНФ 1425-00160.
РОЛЬ КАТЕПСИНА G В МОДУЛЯЦИИ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ С УЧАСТИЕМ ЛОКАЛЬНЫХ РЕНИН-АНГИОТЕНЗИНОВЫХ СИСТЕМ
Замолодчикова Т.С.1, Толпыго С.М.1, Свирщевская Е.В.2
1 Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина, Москва, Россия 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
Многофункциональная сериновая протеаза имму-ноцитов катепсин G (Кат G), обладающая необычной
двойной трипсино- и химотрипсиноподобной специфичностью, синтезируется в нейтрофилах, моноцитах и тучных клетках. Кат G воздействует на функциональное состояние иммунных клеток, способствует миграции нейтрофилов и нейтрализации антигенов и считается фактором поддержания равновесия между защитой ткани и ее повреждением в условиях воспаления. Кат G является также компонентом ренин-ангиотензиновой системы (РАС), способен активировать ренин и обладает ангио-тензин-превращающими свойствами. Ангиотензин-II (А-II) является одним из ключевых медиаторов воспаления и, в качестве иммуномодулятора, может активировать инфильтрацию иммунокомпетентных клеток, воздействовать на клеточную пролиферацию, дифференци-ровку и хемотаксис. Локальная РАС слизистой тонкого кишечника представлена полным набором компонентов, локализованных, преимущественно в покровном эпителии, собственной пластинке (lamina propria) и мышечной пластинке (muscularis mucosae). Клетки иммунной защиты слизистой (нейтрофилы, тучные клетки, Т-лимфоциты) экспрессируют собственную клеточную РАС. Регуляция всех уровней функциональной активности кишечника осуществляется при непосредственном участии локальной РАС. Для установления возможной роли катепсина G в модуляции иммунных реакций с потенциальным участием ренин-ангиотензиновой системы, была проведена иммуногистохимическая локализация катепси-на G в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки (СОДПК) человека при отсутствии клинически выраженного воспаления и при воспалении (дуоденит II-III степени). В работе использовали моноклональные антитела к Кат G, меченые FITC и к компоненту рецептора CD14 (Novus Biologicals, USA). Биоптаты дуоденальной слизистой оболочки были получены в ходе эндоскопического обследования пациентов (диагноз — поверхностный проксимальный гастрит, дуодено-гастральный реф-люкс) с их информированного согласия.
В результате исследования были выявлены новые клеточные источники биосинтеза Кат G в СОДПК: межэпителиальные лимфоциты, лимфоциты собственной пластинки слизистой оболочки, большие глобулярные лимфоциты, кишечные макрофаги и специализированные эпителиоциты кишечных желез — клетки Панета. Биосинтез Кат G показан также в тучных клетках. В нашем исследовании мы впервые показали, что Кат G, традиционно рассматриваемый как один из эффекторов воспалительного процесса, конститутивно синтезируется в нормальной СОДПК, не имеющей клинически выраженных признаков воспаления. Полученные данные позволяют отнести Кат G к основным протеазам местного кишечного иммунитета. При воспалении уровень экспрессии катепсина G значительно возрастает за счет инфильтрата. В ходе двойного окрашивания биопсии воспалённой СОДПК антителами, специфичными к Кат G и к CD14 была выявлена ко-локализация Кат G и CD14 в значительной части иммуноцитов воспаленной слизистой оболочки, которые были идентифицированы как нейтрофилы и макрофаги. В некоторых случаях Кат G -специфическая флуоресценция обнаруживается на щеточной кайме энтероцитов и секрете бокаловидных клеток. В цитоплазме энтероцитов эпизодически встречаются мелкие гранулы, окрашивающиеся Кат G -специфическими антителами, что может быть следствием всасывания Кат G, сорбированного на щеточной кайме эн-тероцита путем эндоцитоза. Сорбция Кат G на щеточной
