CC BY
56
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009
С.А. Рамазанова,
кандидат биологических наук
С.З. Гучетль, кандидат биологических наук
Т.А. Челюстникова, старший научный сотрудник
Т.С. Антонова, доктор биологических наук
Е. В. Мошненко, кандидат биологических наук
ГНУ ВНИИ масличных культур Россельхозакадемии Россия, 350038, Краснодар, ул. Филатова 17 тел.: (861) 275-86-53, e-mail:antonova@au.ru
ВНУТРИСОРТОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ СОРТОВ СОИ СЕЛЕКЦИИ ВНИИМК
Ключевые слова: соя, сорта, внутрисортовой полиморфизм, ssr-локусов ДНК УДК 633.853.52: 575.113:631.52
Введение. Увеличивающееся с каждым годом количество новых сортов культурных растений требует более совершенных приемов их генотипирования. Микросателлитные маркеры - производные полимеразной реакции амплификации ДНК, обладают неоспоримыми преимуществами перед традиционными, вследствие их многочисленности, равномерного распределения по геному и возможности исследования их на любом этапе онтогенеза [1,2]. Современные технологии, созданные на основе анализа микросателлитных локусов ДНК, позволяют надежно идентифицировать сорта и гибриды почти всех сельскохозяйственных культур.
По данным многих авторов, высокий уровень полиморфизма у сои удалось выявить только по микросателлитным локусам [3-5]. Поэтому идентификация и паспортизация генотипов сои была сделана именно по этим маркерам [6]. Создание «генетического паспорта» сорта предполагает исследование генетического полиморфизма внутри сорта. Поскольку соя является самоопыляющейся культурой, предполагается, что культивируемые сорта генетически однородны. Американскими учеными было установлено, что для анализа нужно выделять ДНК из смеси фрагментов листьев с 30-50 растений сорта сои, для того чтобы избежать ошибок в связи с мутациями [7].
Для подтверждения предположения о генетической однородности сортов был исследован внутрисортовой полиморфизм сортов сои селекции ВНИИМК.
Материалы и методы. Для исследования были выбраны сорта Фора, Лада и Вилана. Семена сортов Лада и Фора проращивали в рулонах фильтровальной бумаги в темноте при температуре 22-25 °С. Уровень их внутрисортового полиморфизма изучали на 10 проростках каждого сорта по 8 SSR-локусам Satt2, Satt5, Satt9, Soypr1, Sat1, Sat36, Soyhsp176).
Из сорта Вилана были отобраны и индивидуально обмолочены 99 растений. По 1-2 семени каждого образца высевали в ящики с почвенно-песчаной смесью и выращивали в камере искусственного климата до фазы первого тройчатого листа. Выделяли ДНК из листьев каждого растения отдельно и анализировали также по 8-и микросателлитным локусам.
Выделение ДНК, ее амплификацию, электрофорез и визуализацию продуктов амплификации проводили по стандартным методикам в авторской модификации, описанными нами ранее [6].
Результаты и обсуждение. В лаборатории иммунитета ВНИИМК было проведено исследование полиморфизма микросателлитных локусов ДНК сои. На основании полученных данных об аллельном разнообразии изученных SSR-локусов составлены молекулярно-генетические формулы сортов сои селекции ВНИИМК, предложенные для использования в качестве «генетических пас-
портов» [6]. Работа по созданию такого паспорта сорта предполагает проведение популяционного исследования, основанного на анализе микросателлитных локусов ДНК определенного количества образцов растений исследуемого сорта.
Для идентификации и паспортизации сортов сои использовались девять SSR-локусов, проявивших высокий уровень полиморфизма [6]. По локусу Soygy2 полиморфизм нами ранее был выявлен только у дикорастущих форм сои, такие же данные были получены американскими учеными [3]. Поэтому уровень внутрисортового полиморфизма изучали по восьми локусам.
Анализ состояния 8 микросателлитных локусов ДНК сорта Фора показывает, что сорт генетически однороден. Это подтверждается полученными фореграммами продуктов амплификации ДНК этого сорта. На рисунке 1 представлены результаты электрофореза продуктов амплификации по четырем локусам Satt 9, Soypri, Satt 2 и Satt 5. Каждая дорожка - это амплифицированный фрагмент ДНК отдельного растения. Как видно из рисунка 1, все фракции имеют одинаковую длину пар нуклеотидов, т.е. различий в размерах фракций нет. На фореграммах, полученных по остальным 4 локусам, также видны все фракции одного размера. Полученные данные показывают, что у сорта сои Фора отсутствует внутрисортовой полиморфизм по 8 микросателлитным локусам.
12 3 4 5 6 7 S 9 Ю IV!
Рисунок 1 - Фореграммы продуктов амплификации ДНК сорта сои Фора по локусам Satt 9 (А), Soypri^), Satt 2 (В), Satt 5 (Г). Дорожки 1-9 ДНК отдельных растений, М-маркер молекулярного веса 100 bp DNA Ladder
Анализ микросателлитных последовательностей ДНК сорта Лада показал, что этот сорт является генетически неоднородным. По локусу Satt2 из 10 фракций ДНК каждого отдельного растения выделяется фрагмент на шестой дорожке (рис. 2А), он большего размера (по количеству пар нуклеотидов). По локусу Satt 9 фрагмент на первой дорожке отличается от остальных большим размером (рис. 2Б). По локусу Soyhsp 176 выделяется фракция на второй дорожке (рис. 2Г), она меньшей длины. А по локусу Satt5 у трех растений фракции ДНК большего размера - дорожки 5, 6 и 9 (рис. 2В).
На рисунке 2 (Д, Е) показаны результаты электрофореза продуктов амплификации по локусам Soypr1 и Sat1. Как видно из рисунков, все фракции имеют один и тот же размер, то есть по этим локусам сорт сои Лада характеризуется как мономорфный.
Таким образом, по четырем микросателлитным локусам из девяти сорт сои Лада оказался неоднороден. Это свидетельствует о внутрисортовом полиморфизме сорта Лада по изученным микросателлитным локусам. Семена сорта Лада различаются и фенотипически - по окраске оболочки, рубчика, наличию пигментации. Возможно, что выявленный внутрисортовой полиморфизм по представленным локусам связан с этими признаками. Но эта гипотеза требует дополнительных исследований.
Результаты анализа микросателлитных последовательностей ДНК сорта Вилана, также показали, что сорт неоднороден. Из 99 образцов у 7-и амплифицированные фрагменты ДНК отличались по размеру от остальных. По локусу Satt9 выделилось 6 образцов, а по локусу Soypri - один.
12 345678 9 ЮМ
А
Б
Рисунок 2 - Фореграмма продуктов амплификации ДНК сорта сои Лада
по локусам Satt 2(А), Satt 9(Б), Satt 5(В), Soyhsp176(r), Soyprl^), Sat1(E). Дорожки 1-10 ДНК отдельных растений, М - маркер молекулярного веса 100 bp DNA Ladder
Генетическая чистота сорта составила 92,93 %. Резерв семян из выделенных растений высеян в поле для дальнейшего изучения. Было отмечено, что растения на трех делянках были выше остальных и созрели на два дня позже. Далее эти все семь выделенных линий будут изучены в питомнике предварительного сортоиспытания с целью более детального изучения количественных и качественных признаков.
Выводы. Таким образом, анализ микросателлитных последовательностей ДНК показал, что сорта сои селекции ВНИИМК могут быть генетически неоднородными. Это необходимо учитывать при создании молекулярно-генетического паспорта сорта.
Список литературы
1. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях // Научно-методическое руководство / Под. ред. Сиволапа Ю.М. - Киев: Аграрна наука, 1998. - 156 с.
2. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г.Е. Сулимова. - 2004, [Электронный ресурс] - режим доступа: http://www.labsgi.by.ru
3. Maughan, P. Microsatellite and amplified sequence length polymorphism in cultivated and wild soybean / P. Maughan, M. Saghai-Maroof, G. Buss // Genom. - 1995. - V. 38. - P.715-723.
4. Глазко, В.И. Генетически детерминированный полиморфизм ферментов у некоторых сортов сои (Glicine max) и дикой сои (Glicine soja) // Цитол. и генетика. - 2000. - Т. 34. - № 2. - С. 83-90.
5. Rongwen, J. The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification / J. Rongwen, M.S. Akkaya, A.A. Bhagwat et al. // Theor. Appl. Genet. - 1995. - V. 90. - P. 43-48.
6. Рамазанова, С.А. Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК сортов сои селекции ВНИИМК / С.А. Рамазанова, С.З. Гучетль, Т.А. Челюстникова, Т.С. Антонова // Сб. докл. межд. науч.-практ. конф. «Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника» посвященной 120-летию со дня рождения академика В.С. Пустовойта, ВНИИМК, Краснодар, Россия, 19-22 июля 2006. - С. 234-239.
7. Diwan, N. Automated sizing of fluorescent-labeled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in soybean / N. Diwan, P.B. Cregan // Theor. Appl. Genet. - 1997. - V. 95. - № 56. - P. 723-733.
