CC BY
46
© БУЛЫГИН Г.В., КИШИНЕВСКИЙ М.В., БОЛЬШАКОВА Т.Ю., ШКИЛЬ Л.М. -УДК 612.112.94:616.72-002.77
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ Т- И В-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
Г.В. Булыгин, М.В. Кишиневский, Т.Ю. Большакова, Л.М. Шкиль.
(Институт медицинских проблем Севера СО РАМН, директор - член-корр. РАМН, д.м.н., проф. В.Т. Манчук, г. Красноярск; Красноярская государственная медицинская академия, ректор - акад. АН ВШ, д.м.н., проф. В.И. Прохоренков, кафедра клинической иммунологии, зав. - проф. Г.В. Булыгин)
Резюме. Изучены внутриклеточные ферменты в Т- и В-лимфоцитах больных ревматоидным артритом в динамике их лечения. При повышении активности патологического процесса отмечена активация реакций пентозофосфатного пути, гликолиза, аминокислотного и липидного обменов; ферменты цикла Кребса в этот период не изменяют своих показателей. После 3-недельного лечения нестероидными противовоспалительными препаратами изменения метаболизма нивелируются, но сохраняются признаки активации обмена липидов и повышенное использование аминокислот в цикле Кребса и в липидном обмене клеток. Результаты исследования обосновывают возможность применения метаболической иммунокоррекции для восстановления функции лимфоцитов при ревматоидном артрите.
Реализация иммунного ответа зависит от функциональных возможностей лимфоцитов, которые в значительной степени определяются интенсивностью и направленностью внутриклеточных метаболических реакций [11,14].
Исследования, проведенные к настоящему времени, позволили раскрыть некоторые из механизмов, связывающие внутриклеточные метаболические процессы в лимфоцитах с их функциональной активностью. Известно об активации ферментов пентозофосфатного цикла и гликолиза при реакции бласттрансформации лимфоцитов [11,13], о повышении активности ферментов гликолиза и цикла Кребса при митогенной стимуляции Т-лимфоцитов [7,13]; показана зависимость экспрессии на лимфоцитах отдельных антигенов от содержания в клетках аденозина и аденозин-дифосфорной кислоты [8]; отмечено значительное увеличение активности аденозиндезаминазы, 5-нуклеотидазы, АМФ-аминогидролазы и адени-латциклазы, а также ускорение катаболизма АТФ при стимуляции КОН А тимоцитов [4,5].
Результаты изучения активности ферментов в лимфоцитах, проведенных при инфекционно-вос-палительных заболеваниях, подтвердили наличие реакции внутриклеточного метаболизма на антигенное раздражение при: герпес-вирусной инфекции [6], заболеваниях гепатитом, туберкулезом [9], урогенитальной и хирургической инфекции, бронхиальной астме [1]. Исследования, которые раскрывали бы механизмы регуляции функциональной активности лимфоцитов через их внутриклеточный метаболизм у больных аутоиммунными заболеваниями, в доступной литературе освещены недостаточно.
Материалы и методы
Проведено обследование 20 женщин 35-50 лет, больных ревматоидным артритом (РА) - суставная форма, активность 2-3 степени. Кроме того,
обследованы 20 практически здоровых женщин того же возраста, не являющиеся штатными донорами и, обращавшихся для разовых заборов на станцию переливания крови. Больные обследовались при поступлении их в специализированное отделение стационара, а также через 3 недели после лечения, включавшего в себя нестероидные противовоспалительные препараты. Кортикостероиды при лечении этих больных не использовались.
Лимфоциты периферической крови, выделенные на градиенте плотности фиколл-верографина [12], разделяли на Т- и В-клетки на нейлоновой вате [3]. Использование этого метода разделения популяций лимфоцитов позволяло получить чистоту взвеси Д^клеток до 94% (88,72+4,22%), а В-лимфоцитов - до 72% (66,36+3,81%). Затем отдельно в Т- иЛЗ^лимфоцитах биолюминесцентным методом с бакЭ^/йальной люциферазой [10] определялась активность ряда внутриклеточных ферментов.
Спектр изучаемых энзиматических показателей был обусловлен тем, что они отражают интенсивность реакций основных метаболических путей лимфоцитов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ), обеспечивающая подачу субстратов на пентозофосфатный путь (ПФП); глицерол-3-фос-фатдегидрогеназа (ГЗФДГ), осуществляющая взаимосвязь между липидным обменом и гликолизом; лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализирующая метаболизм лактата в клетках; две малатде-гидрогеназы, участвующие в реакциях преобразования малата, вырабатываемого в цикле трикар-боновых кислот (ЦТК), - НАДМДГ и НАДФМДГ, причем первая из них регулирует поток субстратов в цикле, а с помощью второй осуществляется работа шунтирующей реакции превращения малата в пируват; изоцитратдегидрогеназа (НАД-ФИЦДГ), контролирующая метаболизм изоцитра-
та в ЦТК при превращении его в 2-кетоглутарат; глутаматдегидрогеназа (НАДФГДГ), регулирующая поток субстратов с аминокислотного обмена на ЦТК; глютатионредуктаза (ГР), обеспечивающая регенерацию окисленного глутатиона в восстановленный, который функционирует в системе антиоксидантной защиты клеток и участвует в транспортировке в них аминокислот.
Результаты и обсуждение
Установлено, что при обострении РА в Т-лим-фоцитах отмечается интенсификация метаболических процессов и это выражается в повышении активности большинства ферментов. В клетках определяются достоверно более высокими, чем у здоровых женщин, показатели Г6ФДГ, ГЗФДГ, ЛДГ, НАДФМДГ, НАДФГДГ и ГР. Подобные изменения ферментов были зарегистрированы и в В-лимфоцитах (табл.1). Обращает на себя внимание, что повышение активности внутриклеточного метаболизма проявляется преимущественно в интенсификации реакций, связанных с процессами макромолекулярного синтеза, обменом липидов и аминокислот. В то же время практически на прежнем уровне остается интенсивность энергопродуцирующих реакций ЦТК, протекающих под контролем НАДФИЦДГ и НАДМДГ, а для последней даже отмечена тенденция к ингибированию в В-лимфоцитах (Р<0,1).
После лечения активность ферментов Г6ФДГ, ГЗФДГ, ЛДГ в Т-лимфоцитах больных приближается к уровню здоровых доноров; в В-лимфоцитах уровень Г6ФДГ сохраняется более высоким (Р<0,01), а активность двух других указанных ферментов, как и в Т-клетках, достоверно не отличается от показателей здоровых. В то же время
отмечено сохранение достоверно более высокого, по сравнению со здоровыми, уровня активности НАДФМДГ, НАДФГДГ и ГР как в Т-, так и в В-лимфоцитах больных.
Анализ изменений обменных процессов в двух основных популяциях лимфоцитов больных РА позволил представить следующую картину внутриклеточного метаболизма при повышении активности заболевания. Усиленный отток поступающих в клетки субстратов на пентозофосфат-ный путь вызывает необходимость увеличения их объема в гликолизе, пополнение субстратного пула которого происходит с липидного обмена через реакцию, контролируемою ГЗФДГ, и за счет лактата (ЛДГ). Однако в дальнейшем на ЦТК субстратов поступает недостаточно (вероятно, в связи с интенсивным переводом пирувата на липидный обмен через АцКоА), что подтверждается низким показателем активности одной из начальных реакций цикла - НАДФИЦДГ. Это ограничение субстратами ЦТК, синтезирующего для клеток АТФ, которая особенно активно используется при состояниях функционального напряжения (и патологических процессах в том числе), '‘подключает” дополнительные потоки субстратов на цикл. В данной ситуации происходит более активное поступление на ЦТК интермедиатов аминокислотного обмена через глутамат-кетоглутарат, о чем свидетельствует повышенный, по сравнению с уровнем здоровых доноров, показатель НАДФГДГ. Усиленное использование для энергетических потребностей аминокислот, по-видимому, обусловливает и повышение показателя ГР, участвующей в механизмах транспорта последних в клетки [2]. Однако на заключительном
Таблица.
Активность ферментов в Т- и В-лимфоцитах (мкЕ/10 ООО клеток) здоровых доноров и больных ревматоидным артритом в динамике заболевания (М±т).
Ферменты \ 1 1 1 Активность ферментов
Т-лимфоциты В-лимфоциты
Доноры п=20 До лечения п=20 После лечения п= 12 Доноры п-20 До лечения п=20 После лечения п= 12
1 2 3 4 5 6
| Г6ФДГ | 1,94±0,34 21,99±3,37 Р1<0,001 2,64±0,78 2,43±0,46 15,21± 1,27 Р4<0,001 5,07±0,86 Р4<0,01
ГЗФДГ 5,79±1,79 12,57±1,69 Р1<0,001 7,78±1,29 8,74±1,37 12,80±1,47 Р4<0,05 9,71±2,20
ЛДГ 2,85±0,73 6,53±0,56 Р1<0,001 2,57±0,88 4,60±0,71 6,45±0,66 Р4<0,1 4,70±1,35
НАДМДГ 17,76±1,19 20,18±2,72 18,84±1,43 14,91±1,66 10,58±1,48 Р4<0,1 14,85±2,68
НАДФМДГ 1,72±0,30 32,73±5,04 Р1<0,001 9,96±0,36 Р1<0,001 2,34±0,39 37,54±4,64 Р4<0,001 17,92±2,97 Р4<0,001
НАДФИЦДГ 11,41±1,59 11,38±1,52 11,56±1,75 13,33±1,14 12,64± 1,12 14,00±1,97
НАДФГДГ 1,27±0,33 27,86±5,08 Р1<0,001 9,50±0,47 Р1<0,001 3,32±0,65 37,74±6,50 Р4<0.001 13,32±0,91 Р4<0,001
ГР 0,98±0,14 2,79±0,59 Р1<0,01 2,15±0,18 Р1<0.001 1,71±0,23 5,98±0,85 Р4<0,001 3,15±0,59 Р4<0,01
Примечание: Р1 и Р4 - достоверность различий с соответствующей графой таблицы.
этапе ЦТК происходит перераспределение потока субстрата: снижается его объем в цикле и увеличивается отток по цепи малат-пируват и далее на липидный обмен, что подтверждает сочетание невысокого, особенно в В-лимфоцитах, показателя активности НАДМДГ и повышенного в обеих популяциях лимфоцитов НАДФМДГ.
Указанные особенности метаболизма свидетельствуют об интенсификации в клетках липидного обмена, в котором активно используются субстраты с ЦТК. Если учитывать, что субстратное обеспечение последнего в значительной степени определяется количеством кетоглутарата, то в конечном итоге усиление обмена липидов в клетках происходит за счет субстратов аминокислотного обмена. Это повышенное использование интермедиатов белкового обмена на энергетические нужды лимфоцитов и для липидного обмена, возникающее в лимфоцитах на фоне обострении РА. вероятно, нельзя считать рациональным. Удовлетворение повышенных в этот период энергетических потребностей клеток может повысить функциональные способности лимфоцитов для
реализации адаптивных реакций при состоянии напряжения, возникающем из-за обострения заболевания, однако ограничение синтеза белка в клетках в свою очередь ограничивает их функцию за счет неполноценности рецепторного аппарата и уменьшения синтеза цитокинов.
Снижение активности заболевания сопровождается уменьшением выраженности описанных выше перестроек внутриклеточного метаболизма, однако и при этом состоянии сохраняются его изменения, характеризующие интенсивное использование субстратов аминокислотного обмена для выработки АТФ на заключительных этапах ЦТК и дальнейшее направление субстратного потока на липидный обмен.
Полученные данные позволяют уточнить внутриклеточные механизмы, определяющие функциональное состояние лимфоцитов человека при РА, и определить вероятные способы метаболической коррекции функции этих клеток, один из которых может быть направлен на оптимизацию в них аминокислотного и липидного обменов.
INTRACELLULAR METABOLISM T- AND B-LYMPOCYTES OF BLOOD IN PATIENTS
WITH RHEUMATOID ARTHRITIS
G.V. Buligin, M.V. Kishinevskij, T.U. Bolshakova, L.M. Shilj
(Institute for Medical Problems of the North, Siberian Division, Krasnoyarsk;
Krasnoyarsk State Medical Academy)
Intracellular enzymes of T- and B-lymphocytes were examined in patients with the RA in dynamics of their treatment. Increased activation of pathological process is established when activation of the pentose phosphate pathway, the glycolysis, the amino acid and lipid metabolism is registered. Enzymes of the Krebs Cycle in that time did not change their indices. After the three-week treatment with NAID the changes of metabolism smoothed over, but signs of lipid metabolism activation and increased use of amino acids in the Krebs Cycle stayed invariable. Results of the research let us consider the permition of application of the metabolic immune-correlation for recovery of the function of lymphocytes in case of the RA.
Литература
1. Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И., Андрейчиков А.В. Метаболические основы регуляции иммунного ответа. - Новосибирск: СО РАМН, 1999. - 346 с.
2. Бышевский А.III., Терсенев О.А. Биохимия для врача. - Екатеринбург: Ш’Ш "Уральский рабочий”, 1994.- 384 с.
3. Гаррота Д., Нери Т. Иммунология: Методы исследований / Под ред. А. Лефковитс, Б. Пернис. - М.: Мир, 1983. - С.188-213.
4. Дмитриенко Н.П. Изучение метаболизма аденин-нуклеотидов в стимулированных конконавали-ном А тимоцитах крысы // Иммунология. - 1985. -№3. - С.74.
5. Ляшенко В.А., Дроженников В.А., Молотков-ская И.М. Механизмы активации иммунокомпе-тентных клеток. - М.: Медицина, 1988. - 240 с.
6. Петрович Ю.А., Терехина Н.А., Гольдфельд Н.Г. Активность оксидоредуктаз лимфоцитов в периферической крови больных герпетическим кератитом // Вопр. мед. химии. - 1987. - Т.ЗЗ, №4. - С.59-61.
7. Подосинников И.С., Чухловина М.Л. Метаболизм и функция лимфоцитов при первичных иммуноде-фицитных состояниях // Иммунология. - 1986. -№4. - С.30-33.
8. Порядим Г.В., Салмаси Ж.М., Казимирский А.Н. и др. Изучение влияния медиаторов тканевого повреждения на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитами человека in vitro // Бюлл. экспе-рим. биол. и мед. - 1995. - Т.119, №2. - С.196-199.
9. Савченко А.А. Нарушение метаболического статуса лимфоцитов и иммуноэндокринного взаимодействия в патогенезе вторичных иммунодефицитов и гиперактивного состояния иммунной системы: Ав-тореф. дис. ... докт. мед. наук. - Томск, 1996. - 34 с.
10. Савченко А.А., Сунцова Л.П. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолю-минесцентным методом // Лаб. дело. - 1989. -№11. -С.23-25.
11. Робинсон М.В., Топоркова Л.Б., Труфакин В.А. Морфология и метаболизм лимфоцитов. - Новосибирск: Наука, 1986. - 128 с.
12. Boyum A. Separation of blood leucocytes, granulocytes and lymphocytes // Tissue Antigens. -1974. - VoL4. - P.250-260.
13. Keast D., Newsholme E.A. Effect of В-cell and T-cell mitogens on the maximum activities hexokinase, lactate de hydrogenase, citrate synthase and
glutaminase in bone marrow cells and thymocytes of 14. Lacombe P. Glutatione status of rat thymocytes and the rat during 4 hours of culture // Int. J. Biochem. - splenocytes during the early events of their Con A
1991. - Vol.23, №9. - P.823-827. proliferative responses // Biochemie. - 1997. - Vol.69,
№1. — P.37-47.
© САВЧЕНКО А.А., МАРТЫНОВА Г.П., КОТОВА Я.А. -УДК 619.9-002-053.3/7:612.017.1
ОСОБЕННОСТИ СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ и ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ДЕТЕЙ
А.А. Савченко, Г.П. Мартынова, Я.А. Котова.
(Институт медицинских проблем Севера СО РАМН, директор - член-корр. РАМН, д.м.н., проф. В.Т. Манчук, г. Красноярск; Красноярская государственная медицинская академия, ректор - акад. АН ВШ, д.м.н., проф. В.И. Прохоренков)
Резюме. У детей 1-3 лет с острой кишечной инфекцией исследованы параметры клеточногуморального иммунитета и функциональная активность лейкоцитов крови. Обнаружено, что у больных с легкой степенью тяжести заболевания показатели клеточно-гуморального иммунитета находятся в диапазоне норме, но при увеличении функциональной активности лейкоцитов крови. В то же время, у детей со среднетяжелой и тяжелой степенью тяжести острой кишечной инфекции выявляется выраженный Т-клеточный иммунодефицит и снижение функциональной активности лейкоцитов крови, что, по-видимому, и вызывает понижение скорости развития оптимального противоинфекционного иммунитета. Следовательно, именно для детей со 2 и 3 степенью тяжести инфекционного процесса необходима разработка методов иммунореабилитации.
В инфекционной патологии детского возраста острые кишечные инфекции занимают ведущее место [4,7,12]. Особенно часто острыми кишечными инфекциями болеют дети раннего возраста, у которых заболевания нередко протекают тяжело и могут закончиться летально [6]. Динамичное наблюдение за детьми больными острыми кишечными инфекциями в течение 10 последних лет указывает на значительное утяжеление их клинической картины, увеличение удельного веса затяжных форм, негладкого течения болезни. Вероятно, причинами выявленных особенностей являются не только изменение этиологической структуры заболеваний, ухудшение преморбидного фона детей и социального уровня семей, но и изменение иммунологической реактивности организма заболевшего ребенка [2].
Реактивность иммунной системы в значительной степени определяет тяжесть любого инфекционного процесса. При этом, различные звенья иммунной системы тесно взаимосвязаны между собой [1,3]. В связи с чем, недостаточность одного из звеньев иммунитета приведет к срыву всего механизма иммунореактивности. С этой точки зрения, при исследовании механизмов иммунной защиты при острых кишечных инфекциях должны изучаться не только показатели клеточного и гуморального звена иммунитета, но и параметры гранулоцитарно-макрофагальной системы. Так как доказано, что клетки гранулоцитарно-макро-фагальной системы в случае функциональной активации не только генерируют цитотоксические
продукты, но и синтезируют ряд биологически активных веществ, влияющих других эффекторов системы иммунореактивности [8,9]. Целью данного исследования явилось изучение состояния иммунной системы и функциональной активности лейкоцитов крови при острых кишечных инфекциях у детей в возрасте 1-3 лет.
Материалы и методы
Обследовано 127 детей с острой кишечной инфекцией в возрасте от 1-3 лет. Этиологический диагноз острой кишечной инфекции был установлен у всех больных, в том числе шигеллез Зонне и Флекснера - у 45,1% больных, сальмонеллез - у 16,7%, кишечная инфекция, обусловленная условнопатогенной флорой, - у 28,4%, у 11,1% наблюдаемых детей выявлена сочетанная этиология инфекции. По тяжести заболевания всех больных разделили на 3 группы: с легкой степенью тяжести (1 степени) - 6 детей (16%), со среднетяжелой степенью (2 степени) - 65 детей (45,1%) и с тяжелой степенью (3 степени) - 56 детей (38,9%). Всем детям при поступлении в стационар (1-3 день болезни) и в динамике заболевания проводили комплексное клинико-лабораторное обследование, у части больных проводилось исследование микробиоценоза кишечника. В качестве контроля обследовано 34 здоровых ребенка того же возрастного диапазона.
Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител CD3, CD4, CD8, CD 16 и
