CC BY
14
DOI 10.31588/2413-4201-1883-247-3-237-243
УДК 591.1:612.12.636.2
ВЛИЯНИЕ «ЗАЩИЩЕННЫХ» АМИНОКИСЛОТ НА КОЛИЧЕСТВО ЭНДОГЕННОГО ОКСИДА АЗОТА (II), ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ОРГАНИЗМЕ КОРОВ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ
ПОЛОВОГО ЦИКЛА
Сибгатуллин И.Т. - аспирант, Гильмутдинов Р.Я. - д.б.н., профессор
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: оксид азота, плазма крови, корова, течка, половой цикл Key words: nitric oxide, blood plasma, rats, bone, estrus, sexual cycle
Снижение уровня воспроизводства или яловость, являются следствием множества причин. На репродуктивные функции коров существенно влияют некорректное управление стадом, проблемы с обменом веществ, внешние факторы. Наряду с этим,
воспроизводительные качества коров определяет кормление, в частности, наличие некоторых аминокислот. Наиболее значимы в питании метионин и лизин. Это ключевые регуляторы обменных процессов, выполняющие множество важных функций в организме животных. Соответственно, вместе с аргинином, они наиболее изучены с точки зрения воздействия на воспроизводство. Введение в рационы жвачных защищённых от распада в рубце метионина и лизина способно улучшить показатели
воспроизводства как, повышая
эффективность использования азота корма, так и в качестве биологически активных веществ, стабилизирующих течение беременности и улучшающих качество потомства [1, 5, 8, 9].
Недостаток лизина в зерновых продуктах, при сравнительно высокой потребности организма в нем, ставит проблему его содержания в кормах на одно из первых мест. Он необходим для роста, восстановления тканей, производства антител, гормонов и ферментов. Его дефицит в рационе молодых крыс, прекращает рост последних с одновременным развитием гипопротеин анемии; отмечается нарушение гемопоэза
и, как результат, уменьшается число эритроцитов, количество гемоглобина. Лизин участвует в утилизации жирных кислот, необходимых для производства энергии; помогает устранять проблемы, связанные с бесплодием; катализирует процессы ферментативных превращений; способствует абсорбции кальция, поддержанию баланса азота во взрослом организме, образованию коллагена и восстановлению тканей; снижает повышенный уровень триглицеридов в сыворотке крови; усиливает иммунитет к вирусным инфекциям [4, 7, 10].
Метионин необходим для синтеза белков, поддержания роста и азотистого равновесия организма. Для нормального функционирования его систем, важно употребление в пищу продуктов богатых витаминами В12, В6 и фолиевой кислоты, способствующих превращению
гомоцистеина в метионин и цистеин. При недостатке последних наблюдается переизбыток токсичного для организма гомоцистеина (гомоцистеинемия).
Метионин также необходим для выведения жиров из печени и их окисления; он является предшественником таурина и глутатиона - основных антиоксидантов в организме животного, которые помимо защиты от окислительного повреждения, выполняют ряд других значимых функций. Так, таурин регулирует постоянство внутренней среды клетки, ключевой компонент в передаче нервных импульсов и составляющая желчи, т.е. обязателен для нормального усвоения жиров и
жирорастворимых витаминов. Это соединение оказывает положительный эффект на сердечно-сосудистую, пищеварительную, эндокринную,
иммунную, нервную и репродуктивную системы [1, 5, 6, 13].
Известно использование лизина и метионина в медицине как регуляторов продукции оксида азота (II), способного воздействовать в равной мере на физиологические процессы как
внутриклеточного, так и межклеточного генеза. Их нарушение ведет к различным заболеваниям, таким как артериальная гипертензия (в т.ч. гипертоническая болезнь), ишемическая болезнь сердца, тромбозы, онкология. Оксид азота (II) -потенциально токсическое соединение, которое широко используется организмом в разнообразных патологических процессах. Его действие на клетку может быть токсичным для клеток, включая опухолевые клетки внутриклеточные патогенные микроорганизмы [2, 3].
Обнаружено множество способов регуляции продукции этого соединения клетками, органами и тканями, как физиологически, под контролем собственно организма, так и внешними корректорами, а именно,
медикаментозными и
немедикаментозными, воздействиями. Эффект оксида азота (II) опосредован его концентрацией. Малые (физиологические) концентрации сопровождают
функционирование конститутивных
эндотелиальных и нейронных изоформ, оказывают цито- и нейропротекторное действие; обладают выраженной антиапоптотической активностью,
вероятно, за счет непосредственного нитрозилирования внутриклеточных
цистеиновых протеаз (каспаз -3, -8) и других проапоптотических белков. В больших концентрациях оксид азота (II) индуцирует апоптоз клеток определенного типа - макрофагов, тимоцитов, клеток островков поджелудочной железы, некоторых нейронов и опухолевых клеток [2, 10, 12].
Большое влияние на систему оксида азота оказал новый препарат L-лизина -
«Лизиний». L-лизин блокирует
постсинаптическую мембрану
глутаматергического синапса, уменьшая тем самым продукцию свободных метаболитов оксида азота (II). Производное 1,2,4-триазол-5-тиоацетата в составе препарата способно образовывать нитротиольные комплексы с дериватами оксида азота (II). Гипергомоцистеинемия у крыс сопряжена со снижением концентрации метаболитов N0 в митохондриях клеток сердца, а изменения в этих органеллах после введения метионина имеют некоторое сходство с таковыми после введения Ь-КО-нитроаргинин метилового эфира ^-№АМЕ). Можно утверждать, что дефицит оксида азота играет важную роль в патогенезе дисфункции митохондрий кардиомиоцитов при гипергомоцистеинемии [5, 10].
Цель настоящего исследования состояла в изучении влияния защищенных от распада в рубце лизина и метионина на содержание оксида азота, а также на показатели воспроизводства и
репродуктивного здоровья коров.
Для достижения этой цели решались следующие задачи: определить влияние в основном рационе коров «защищенных» аминокислот на уровень содержания в сыворотке крови оксида азота (II) в различных стадиях полового цикла; определить влияние в основном рационе коров «защищенных» аминокислот на уровень содержания в сыворотке крови половых гормонов в различных стадиях полового цикла; определить влияние в основном рационе коров «защищенных» аминокислот на уровень содержания в сыворотке крови биохимических показателей в различных стадиях полового цикла.
Материал и методы исследований.
Исследования выполнены на 60 коровах черно-пестрой породы, в возрасте 4-8 лет в КФХ «Хадиев Д.М.» Кукморского района Республики Татарстан в 2020 году. Животные содержались в типовых помещениях на привязи, с моционом в загоне.
Животных распределили в две группы по 30 голов в каждой: 1 -
контрольная; 2 - опытная. Продолжительность учетного периода опыта составила 90 суток.
Все животные получали с 11 по 100 сутки лактации одинаковый основной рацион. Кроме того, коровы 2 опытной группы получали к основному рациону 60 г/сутки на голову, «защищенного» лизина (Лизиперл™ компании «Кетт» Россия), содержащего около 50 % лизина в виде L-лизин моногидрохлорид, и 20 г/сутки на голову, «защищенного» метионина (Мепрон Мергоп® Россия) с содержанием 85 % чистого DL-метионина. В 1 кг испытуемой кормовой добавки Лизиперл™ содержится: 99,5 % сухого вещества, 475 г сырого протеина, 46 % расщепляемого протеина, 198 г усвояемого лизина и 28 МДж обменной энергии. В 1 кг испытуемой кормовой добавки Мепрон (Мергоп®) содержится сырого протеина 50,0 %, сырой клетчатки 3 %, сырого жира 1 %, сырой золы 1,5 %, чистой энергии 5,2 МДж/кг (1,25 Мкал/кг). Суточную дозу «защищенных» аминокислот скармливали в два приёма - утром и вечером во время раздачи комбикормов.
В течение опыта была подобрана группа коров в охоте (10 голов). Стадию их полового цикла устанавливали при помощи трансректального ультразвукового
сканирования, позволяющего с высокой степенью достоверности определить половые состояния, особенности эмбрио- и фетогенеза, устанавливать
морфологические характеристики органов половой системы.
Суммарную концентрацию нитрат-и нитрит-анионов в сыворотке крови определяли путем восстановления нитратов в нитриты цинковой пылью ООО «Арсенал», (Украина). Для этого к 1 мл сыворотке добавили 1 мл 6 % раствора цинка сульфата ООО «Спектр-Хим», (Россия) и оставляли на 1 час при температуре ниже 15 °С. Центрифугировали при 6000 об./мин (3000 g). В супернатант добавляли эквивалентное количество гидроксида натрия (300 мкл 1 № раствора), центрифугировали и 1 мл надосадочной жидкости переносили в соответствующую
по нумерации пластиковую пробирку с предварительно добавленными туда 0,11 г цинковой пыли, 0,5 мл аммиачного буфера, 20 мкл аммиачного комплекса сульфата меди. Пробирки укупоривали и встряхивали в течение 30 мин. Цинковую пыль осаждали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 мин. Затем в каждую пробирку вносили по 1 мл раствора ацетата натрия и 1 мл раствора 1 -на ф тиламина солянокислого ООО «Вектон» (Россия). Измеряли оптическую плотность спустя 30 мин на «Фотометре фотоэлектрическом КФК-3-0 -ЗОМЗ ОАО «ЗОМЗ»» (Россия) при длине волны 520 нм.
В сыворотке крови определяли содержание прогестерона, эстрогена и биохимических показателей
спектрометрическим методом на биохимическом анализаторе «Би-Ан» АБхФк-02-«НПП-ТМ» ЗАО НПП «Техномедика" (Россия) с набором реактивов ООО «Ольвекс диагностикум» (Россия).
Концентрацию общего белка в сыворотке крови определяли при помощи биуретовой реакции с набором реактивов «Ольвекс» (Россия), с последующим измерением оптической плотности на биохимическом анализаторе «Би-Ан» (Россия) при длине волны 540 нм.
Концентрацию мочевины в сыворотке крови определяли
ферментативным кинетическим методом с набором реактивов «Ольвекс», (Россия). Мочевина гидролизуется в присутствии уреазы с образованием иона аммония и СО2. Ионы аммония реагируют с а-кетоглутаратом и НАДН в присутствии глутаматдегидрогеназы (ГЛДГ) с образованием глутамата и НАД. Оптическую плотность проб и стандарта измеряли через 30 секунд и через 60 секунд на биохимическом анализаторе «Би-Ан» (Россия) при длине волны 340 нм.
Концентрацию креатинина в сыворотке крови определяли кинетическим методом с набором реактивов «Ольвекс» (Россия). В щелочной среде креатинин взаимодействует с пикриновой кислотой с образованием окрашенного в красный цвет продукта, оптическую плотность которого
измеряли после 30 секунд и 90 секунд на биохимическом анализаторе «Би-Ан» (Россия) при длине волны 510 нм. По разности оптической плотности рассчитывали концентрацию креатинина в пробе и в стандарте.
Концентрацию АСТ
(аспартатаминотрансфераза) в сыворотке крови определяли с набором реактивов «Ольвекс» (Россия). Под действием фермента АСТ в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартата на а-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции оксалоацетат при участии фермента малатдегидрогеназы и кофермента НАДН превращается в малат. Скорость окисления НАДН2 в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и пропорциональна активности АСТ.
Концентрацию АЛТ
(аланинаминотрансфераза) в сыворотке крови определяли с набором реактивов «Ольвекс» (Россия). Под действием фермента АЛТ в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аланина на а-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции пируват при участии фермента ЛДГ и кофермента НАДН2 превращается в лактат. Скорость окисления НАДН2 в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и пропорциональна активности АЛТ.
Концентрацию кальция в сыворотке крови определяли унифицированным колориметрическим методом с набором реактивов «Ольвекс», (Россия). Кальций в
щелочной среде образует окрашенный комплекс с о-крезолфталеин
комплексоном. Интенсивность окраски по оптической плотности при 570 нм на биохимическом анализаторе «Би-Ан» (Россия) пропорциональна концентрации кальция в пробе.
Концентрацию фосфора в сыворотке крови определяли
спектрофотометрическим методом на «Анализаторе биохимическом
фотометрическом кинетическом Би-Ан» (Р о ссия) с набором реактивов «Ольвекс», (Россия). Метод основан на способности фосфат ионов образовывать в кислой среде с молибдатом аммония в присутствии детергента фосфорномолибденовый
комплекс, оптическая плотность которого при длине волны 340 нм пропорциональна концентрации неорганического фосфора в исследуемом образце.
Биометрическую обработку
результатов эксперимента проводили с использованием критерия t-Стьюдента, достоверно значимым считали различия при уровне p<0,05. Для выявления связи между показателями использовали метод корреляционного анализа. Определяли коэффициент корреляции методом квадратов Пирсона, используя программу MS Excel, и выделяли три диапазона уровня связи: сильный - от 0,7 до 1,0; средний - от 0,3 до 0,699 и слабый - от 0 до 0,299.
Результат исследований.
Результаты исследования влияния защищенных аминокислот на содержание гормонов и оксида азота в крови коров в разные стадии полового цикла у контрольной группы представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Содержание гормонов и оксида азота в крови коров в разные стадии полового цикла у контрольной группы_
Стадия полового цикла Прогестерон, нг/мл Эстроген, пг/мл Оксид азота, мкмоль/л
Возбуждение 1,1±0,74 40,6±0,62 76,5±1,96
Торможение 4,2±0,79* 36,5±0,49* 73,2±1,36
Уравновешивание 5,6±0,81 33,9±1,21 71,8±0,38*
* - достоверно по сравнению со стадией уравновешивания р<0,05
В период охоты концентрация 1,1±0,724 нг/мл, а уровень эстрогена и
прогестерона в крови коров составила оксида азота был максимальным 40,6 ±
0,62 пг/мл и 74,5±1,96 мкмоль/л, соответственно. В первые сутки полового цикла у всех животных выявлена овуляция фолликулов.
Продукция прогестерона
значительно возрастает уже в начале стадии торможения, достигая
максимального содержания 4,2±0,79 нг/мл. Резкое увеличение уровня прогестерона в крови обусловлено формированием и началом функционирования желтого тела. Одновременно у всех коров во время подъёма уровня прогестерона наблюдается спад уровня эстрогена до 38,5±0,49 пг/мл и оксида азота (II) до 71,2 ±1,36 мкмоль/л.
В стадия уравновешивания до начала овуляции уровень эстрогена и оксида азота в крови достигает минимальных значений 33,9±1,21 пг/мл и
64,8±0,88 мкмоль/л, соответственно; уровень прогестерона, в свою очередь, достигает максимума и составляет 5,6± 0,81 пг/мл.
Корреляционный анализ показал высокий уровень взаимосвязи между эстрогеном и оксидом азота (II), где величина коэффициента корреляции составляет (г=0,552; р<0,05). Также наблюдается значительная, но
отрицательная, корреляция уровней прогестерона и оксида азота (II) (г = -0,521; р<0,05).
Результаты исследования влияния «защищенных» аминокислот на
содержание гормонов и оксида азота в крови коров в разные стадии полового цикла у опытной группы представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Содержание гормонов и оксида азота в крови коров в разные стадии полового цикла у опытной группы._
Стадия полового цикла Прогестерон, нг/мл Эстроген, пг/мл Оксида азота (II), мкмоль/л
Возбуждение 2,3±0,97 50,6±1,62* 71,2±1,66
Торможение 5,8±2,19* 40,5±2,49* 70,2±2,64
Уравновешивание 6,1±1,91* 36,3± 2,91 68,2±2,28*
* - достоверно по сравнению с контрольной группой р<0,05
Таблице 3 - Концентрация биохимических показателей в сыворотке крови коров
Показатель Контрольная Опытная
Общий белок, г/л 74,15±1,20 62,31±1,35*
Альбумин, г/л 27,82±1,32 30,76±1,41
Глобулин, г/л 55,69±2,29 57,39±1,15
Мочевина, ммоль/л 6,12±0,24 6,91±0,43
Креатинин, мкмоль/л 79,43±0,83 93,24±1,61*
АЛТ, МЕ/л 31,34±1,76 22,80±3,22*
Щелочная фосфатаза, МЕ/л 78,64±7,68 76,28±5,28
АСТ, МЕ/л 77,86±6,72 67,26±4,24*
Кальций, ммоль/л 2,46±0,07 2,43±0,16
Фосфор, ммоль/л 2,23±0,06 1,04±0,15
Магний, ммоль/л 1,16±0,05 1,25±0,09
* - достоверно по сравнению с контрольной группой р<0,05
Согласно данным таблицы 2, следует, что введение в рацион коровам «защищенных» аминокислот
сопровождается активностью уровня эстрогена в разных стадиях полового цикла. Выявлено увеличение концентрации в стадии возбуждения - в 1,3 раза (р<0,05) в
стадии торможения - в 1,2 раза (р<0,05) и в стадии уравновешивания в 1,3 раза (р>0,05) по сравнению со значениями контрольной группы. Количество прогестерона в сыворотке крови у коров имело тенденцию к незначительному снижению в стадии возбуждения - в 1,1 раза (р>0,05), стадии
торможения - в 1,0 раза (р<0,05) и в стадии уравновешивания - в 1,1 раза (р<0,05). Динамика содержания оксида азота (II) характеризовалась значительным
снижением концентрации в стадию возбуждения - в 1,1 раза (р<0,05), стадию торможения в 1,0 раз (р<0,05), стадию уравновешивания - в 1,0 (р<0,05) раз, по сравнению со значениями контрольной группы.
Результаты исследования влияния защищенных аминокислот на
концентрацию биохимических показателей сыворотке крови коров представлены в таблице 3.
Все изученные биохимические показатели крови животных подопытных групп находились в пределах физиологической нормы. Для
характеристики белкового обмена определяли общий белок, альбумины, глобулины и конечные продукты распада белков - мочевину и креатинин. Количество общего белка сыворотки крови у всех опытных групп снижалось на 62,31±1,35 г/л (р<0,05).
Изменение уровня мочевины в крови связано в первую очередь с функциональным состоянием печени. Повышенная концентрация этого соединения при нормальных значениях других биохимических показателей крови свидетельствует о высокой степени усвоения протеина кормов. Показатели мочевины во всех группах менялся незначительно.
Креатинин, являясь одним из компонентов остаточного азота, позволяет оценить выделительную функцию почек и интенсивность метаболизма в мышечной ткани коров. У коров опытной группы уровень креатинина увеличивается до 93,24±1,61 мкмоль/л (р<0,05).
Ферменты АСТ и АЛТ играют важную роль в обмене аминокислот. Они обнаруживаются у коров во всех органах и тканях, но повышение их уровня в крови происходит при поражениях печени, скелетной мускулатуры, миокарда. У опытной группы коров количество АСТ ниже на 14 %, АЛТ - на 10 % по сравнению с контрольной группой.
Известно, что минеральные вещества входят в состав всех органов и тканей организма и играют важную роль в процессах обмена. Они участвуют во многих физиологических процессах в роли катализаторов, в создании оптимальной среды для действия ферментов и гормонов и т. д. В опытной группе наблюдали некоторое снижение фосфора на 1,04± 0,05 мкмоль/л (р<0,05).
Заключение. Установлено, что кормление коров защищенными аминокислотами сопровождается
увеличением содержания эстрогена и прогестерона, незначительным снижением оксида азота (II). Результаты исследований и их анализ показывает положительное влияние защищенных аминокислот на воспроизводительные качества коров.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Билалов, И.Н. Видоспецифичность системы оксида азота / И.Н. Билалов, Р.Г. Каримова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана. - 2015. - № 222 (2). - С. 3335.
2. Бурбелло, А.Т. Современные лекарственные средства: Клинико-фармакологический справочник практического врача / А.Т. Бурбелло, А.В. Шабров. - М.: Изд. «ОЛМА Медиа групп», 2007, - 800 с.
3. Головин, А.В. Многокомпонентные ферментные препараты в комбикормах для высокопродуктивных молочных коров / А.В. Головин // «Актуальные проблемы технологии приготовления кормов и кормления с-х животных» ВИЖ. -Дубровицы. - 2006. - С. 122-126.
4. Егоров, А.А. Состояние системы оксида азота животных с экспериментальной церебральной ишемией при назначении соединений L-лизина / А.А. Егоров, М.А. Егорова. - Киров: Изд. «КГМА», 2011. - 80 с
5. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский - М.: Изд. «Новая волна», 2006. - 1206 с.
6. Рядчиков, В.Г. Аминокислотный обмен у коров в переходный период при балансировании рационов по обменному белку и усвояемым аминокислотам / В.Г. Рядчиков, О.Г. Шляхова // Научный журнал КубГАУ. - 2014. - № 96 (02). - 32 с.
7. Северин, Е.С. Биологическая химия / Е.С. Северин, Т.Л. Алейникова, Е.В. Осипов - М.: Изд. ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. - 384 с.
8. Фаустов, А.С. Лизин - одна из важнейших незаменимых аминокислот в обеспечении полноценного питания / А.С. Фаустова, М.И. Чубирко, О.В. Бобрешова - Воронеж: Изд. Воронежский государственный университет, 2003. - 88 с.
9. Харитонов, Е.Л. Организация научно обоснованного кормления высокопродуктивного молочного скота. Практические рекомендации / Е.Л. Харитонов, В.И. Агафонов, Л.В. Харитонов - Боровск: ВНИИФБиП, 2008. - 105 с.
10. Харитонов, Е.Л. Физиология и биохимия питания молочного скота / Е.Л. Харитонов - Боровск: Мзд. Оптима Пр е сс, 2011. - 372 с.
11. Chwalisz, K. Role of nitric oxide in implantation and menstruation / K. Chwalisz, R.E. Garfield // Hum Reprod, 2000. - P. 96111.
12. Coleman, D.A. Factors Affecting Reproductive Performance of Dairy Cows / D.A. Coleman, W.V. Thayne, R.A. Dailey // Journal of Dairy Science. - 1985. - Р. 17931803.
13. Stevenson, J.S. Reproductive Disorders in the Periparturient Dairy Cows. / J.S. Stevenson, E.P. Call // Journal of Dairy Science. - 1988. - V. 71 (9). - P. 2572-2583.
14. St-Pierre, NR. Effects of 2-hydroxy-4-(methylthio) butanoic acid (HMB) and its isopropyl ester on milk production and comp o siti on by Holstein cows / N.R. St-Pierre, J . T. Sylvester // Journal of Dairy Science. -2005. - V. 88(7). - P. 2487-2497.
ВЛИЯНИЕ «ЗАЩИЩЁННЫХ» АМИНОКИСЛОТ НА КОЛИЧЕСТВО ОКСИДА АЗОТА (II), ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛЕИ В ОРГАНИЗМЕ КОРОВ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ПОЛОВОГО ЦИКЛА
Сибгатуллин И.Т., Гильмутдинов Р.Я. Резюме
Кормление коров «защищенными» аминокислотами сопровождается увеличением содержания эстрогена и прогестерона, незначительным снижением оксида азота (II) в сыворотке крови. Стоит отметить, что у коров опытной группы улучшился репродуктивный цикл, оплодотворяемость и общее состояние.
THE INFLUENCE OF "PROTECTED" AMINO ACIDS ON THE AMOUNT OF NITRIC OXIDE (II), REPRODUCTIVE HORMONES AND BIOCHEMICAL PARAMETERS IN THE BODY OF COWS AT DIFFERENT STAGES OF THE REPRODUCTIVE CYCLE
Sibgatullin I.T., Gilmutdinov R.Ya. Summary
Feeding of a cow with protected amino acids is accompanied by the increase of the estrogen and progesterone, a slight decrease in nitric oxide (II) in the blood serum. It is worth noting that the reproductive cycle, fertility, and general condition of the cows of the experimental group improved.
