CC BY
21УДК 633.1:632.488
ВЛИЯНИЕ ЗАРАЖЕННОСТИ ГРИБАМИ РОДА FUSARIUM НА КАЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗЕРНА ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
Н.П. Шипилова, О.П. Гаврилова, Т.Ю. Гагкаева
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Проведен анализ фузариоза зерна (ФЗ) 19 образцов озимой пшеницы урожая 2011 года, выращенной в Ставропольском и Краснодарском краях. Оценена зараженность зерна грибами рода Fusarium, видовой состав, посевные показатели семян.
Зараженность зерна варьировала от 2 до 26%. В Ставропольском крае доля F. graminearum составила 84%, доли F. langsethiae и F. sporotrichioides - 19 и 20%, F. tricinctum - 11%. В Краснодарском крае доминировали эти же виды, но встречались в равной пропорции - 14%. ДОН в пределах 20-1698 мкг/кг был выявлен в 58% образцах. По предшественнику «кукуруза на зерно» увеличивались общая зараженность зерна в среднем в 4.1 раза, зараженность F. graminearum в 9.6 раз и содержание ДОН в 11 раз по сравнению с другими предшественниками. Установлена высокая положительная корреляция между показателями ФЗ, зараженностью F. graminearum и содержанием ДОН. Количество больных проростков и развитие заболевания связаны со значениями ФЗ, с процентом зерен, зараженных F. graminearum и содержанием ДОН. Количество зерен, визуально оцененных как пораженные фузариозом, не было связано ни с процентом больных зерен, ни с зараженностью каким либо видом гриба, ни с гнилью проростков. Необходимо обязательное проведение микологической и токсикологической экспертизы для принятия решений по целевому использованию партий зерна.
Ключевые слова: зерно, пшеница, грибы, Fusarium, вредоносность, фузариоз.
Фузариоз зерна (ФЗ) - широко распространенное заболевание зерновых культур, вызываемое грибами рода Fusarium, оказывающего негативное влияние на качество посевного материала в результате снижения энергии прорастания зерновок и развития болезней проростков (Шипилова, 1994; Иващенко и др., 2004; Гагкаева и др., 2011). Многие виды фу-зариевых грибов образуют вторичные метаболиты - микотоксины, наличие которых зачастую приводит к невозможности использования зерна на пищевые и кормовые цели. Значительные количества опасных микотоксинов могут продуцировать как патогенные виды грибов, так и сапро-трофные (Гагкаева и др., 2011).
В Российской Федерации согласно стандартам контроля безопасности пищевых и кормовых продуктов регулируют содержание
Методика
Из средней пробы исследуемого образца (50 г) анализировали 100 зерен. Их поверхностно стерилизовали 0.1% раствором AgNO3 в течение минуты. После этого зерна тщательно отмывали сначала проточной водопроводной, затем стерильной водой и раскладывали по 10 шт. на поверхность агаризованной картофельно-сахарозной среды (КСА), разлитой в чашки Петри. Перед разливом питательной среды в нее добавляли сульфат стрептомицина (100 мг/л) для подавления роста бактерий и раствор Triton X-100 (2х10"4 мл/л) для снижения линейного роста мице-лиальных грибов.
Через 7-10 суток инкубации при 24°С учитывали ко-
фузариотоксинов в зерне, в т.ч. дезоксинива-ленола (ДОН) и Т-2 токсина, на которые установлены предельно допустимые нормы содержания (ПДК) в зерне для использования на пищевые цели - соответственно 700 и 100 мкг/кг.
Среди широко распространенных видов грибов образование ДОН в значительных количествах характерно для F. graminearum Schwabe и F. culmorum (W.G.Smith) Sacc., а образование Т-2 токсина - для F. sporotrichioides Sherb. и F. langsethiae Torp et Nirenberg. Высокая зараженность зерна этими видами приводит к значительной вероятности его загрязнения микотоксинами.
Целями нашего исследования были анализ зараженности образцов зерна озимой пшеницы грибами Fusarium и выявление вредоносности доминирующих видов.
исследований
личество зерен, на поверхности которых образовались колонии фузариевых грибов. Идентификацию грибов рода Fusarium проводили с использованием определителя В.Герлаха и Х.Ниренберг (Gerlach, Nirenberg, 1982). Общую зараженность образца зерна грибами Fusarium (ФЗ, %), как и зараженность конкретным видом, определяли в % к общему числу проанализированных зерен. Долю конкретного вида в комплексе патогенов Fusarium (%) в каждом образце как % к числу зерен, зараженных грибами Fusarium (Гагкаева и др., 2011).
Влияние фузариевых грибов на развитие проростков изучали, используя метод проращивания семян в рулонах
фильтровальной бумаги (ГОСТ 12044-93). Из каждого образца анализировали 50 поверхностно стерилизованных семян в 4-кратной повторности. Рулоны фильтровальной бумаги с семенами на треть высоты помещали в сосуды с водой и выдерживали на светоустановке с режимом освещения 12 ч света / 12 ч темноты. Через 30 суток оценивали количество проростков, их массу, длину и поражение грибами. Симптомы поражения - по 5-балльной шкале (Семенов, Потлайчук, 1982):
0 - проростки здоровые, налета мицелия нет;
1 - проростки нормальные, на семенах и проростках налет мицелия;
2 - слабое потемнение тканей проростков в виде штрихов или мелких пятен;
3 - искривление проростков, пятна сплошные, ткань загнивает;
4 - при прорастании семена загнивают и погибают.
Развитие болезни проростков (Р%) вычисляли по формуле (Наумова, 1970):
Р%=£(А-В)х100/МК%, где £(А-В) - сумма баллов поражения (А- количество рас-
тений с соответствующим баллом поражения В); N общее количество растений в пробе; K - высший балл шкалы поражения.
Определение количества микотоксинов в зерне проводили иммуноферментным методом (ИФА). Для проведения ИФА применяли тест-системы "ИФА - Т-2 токсин" и "ИФА - дезоксиниваленол" ("Фарматех" РФ) с нижними пределами определения 4 мкг/кг и 20 мкг/кг соответственно. ИФА выполняли на 96-ячеечных наборных полистироловых планшетах "Медполимер" (РФ) с последующим измерением оптической плотности растворов при длине волны 492 нм на спектрофотометре Multiskan EX Microplate Photometer фирмы "Thermo Fisher Scientific" (USA). Для калибровки использовали растворы микотоксинов в ацетонитриле с концентрацией 1.0 мкг/мл, из которых путем последовательных разведений смесью аце-тонитрил:вода (6:1) готовили калибровочные растворы (всего пять разведений).
Для статистической обработки данных использовали программы STATISTICA и Microsoft Excel. Рассчитывали индексы видового разнообразия по Шеннону и выравненности сообщества по Бергеру-Паркеру (Лебедева и др., 2002).
Результаты исследования
Проанализирован ФЗ 19 образцов озимой пшеницы урожая 2011 г., выращенной в Ставропольском и Краснодарском краях. Образцы зерна представлены 12 сортами: Таня (6 обр.), Эвклид (2 обр.), Москвич (2 обр.), а также Афелия, Вита, Деметра, Дока, Есаул, Лига, Понега, Росинка, Сила (по одному образцу).
Большая часть образцов выращены по предшественнику озимая пшеница (10 обр.), пять образцов - по кукурузе, остальные по овсу и сахарной свекле.
Зараженность зерна фузариевыми грибами, выявленная на КСА, варьировала от 2 до 26% (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика образцов озимой пшеницы по зараженности зерна
Общая зараженность Зараженность видами Fusarium, % ДОН, мкг/кг
Сорт Предшественник грибами Fusarium, % F. gra- F. sporo- F. lang- Fusari-
КСА РФБ minearum trichioides sethiae um spp.
Деметра 3 4 0 0 3 0 0
я Вита озимая пшеница 8 3 0 0 2 6 251
яа кя Афелия 3 5 0 2 0 1 20
си ьц по Эвклид 24 5 9 2 2 11 205
Таня кукуруза на зерно 26 10 26 0 0 0 1308
ор рп Таня 20 17 19 0 0 1 1113
Понега Таня кукуруза на силос 6 6 2 2 1 6 1 0 1 0 3 0 0 0
Эвклид не указано* 18 16 10 3 0 5 700
Москвич 2 0 0 1 1 0 0
Росинка 5 1 0 2 3 0 0
яа Таня 3 2 0 1 1 1 66
S 8 си Лига озимая пшеница 7 15 6 0 0 1 72
Таня 6 5 2 1 0 3 0
оо нр Дока 3 2 0 0 2 1 72
сп ае Москвич 8 1 0 1 1 6 0
¡2' Таня овес 4 4 2 2 0 0 90
Сила кукуруза 4 2 3 1 0 0 0
Есаул сахарная свекла 4 2 0 1 3 0 0
Примечание: *скорее всего предшественник ■ агар; РФБ - рулоны фильтровальной бумаги.
кукуруза; ДОН - дезоксиниваленол; КСА - картофельно-сахарозный
Диапазон этого показателя, полученный на 17%. В целом, средняя зараженность зерна, рулонах фильтровальной бумаги, - от 0 до определенная с использованием питательной
Вестник защиты растений, 4, 2014 среды, была в 1.6 раз выше средней зараженности, выявленной с помощью метода рулонов.
Видовой состав грибов на зерне из Ставропольского и Краснодарского краев был сходен - 10 и 8 видов соответственно. В Ставропольском крае доля F. graminearum составила 84%, доли видов F. langsethiae и F. sporotrichioides -19 и 21%. В Краснодарском крае доминировали эти же виды при встречаемости в равной пропорции - 14%. Кроме указанных видов идентифицированы F. cerealis Burgess, Nelson, Toussoun, F. equiseti (Corda) Sacc., F. incar-natum (Desm.) Sacc., F. poae (Peck.) Wollenw., F. proliferatum (Matsush.) Nirenberg, F. tricinc-tum Corda Sacc., F. verticillioides (Sacc.) Niren-berg.
Индекс видового разнообразия грибов р. Fusarium в зерне пшеницы был относительно низким и составил 1.7 для образцов из Краснодарского края, для образцов из Ставропольского края - 1.4. Индекс выравненности сообщества грибов был значительно выше в Краснодарском крае (3.85), чем в Ставропольском (1.95). Таким образом, в Краснодарском крае сообщество фузариевых грибов в зерне характеризуется большим разнообразием без доминирования отдельных видов, в отличие от такового в Ставропольском крае, где основным представителем является F. graminearum.
Низкая зараженность грибами F. sporotrichioides и F. langsethiae (1-3%), продуцирующими Т-2 токсин, не привела к загрязнению зерна этим микотоксином.
Загрязненность зерна ДОН была выявлена в 58% анализированных образцов в широких пределах (20-1698 мкг/кг). Не содержали ДОН в зерне 33% образцов из Ставропольского края и 60% из Краснодарского края. Количество этого микотоксина, превышающее ПДК, установлено в трех образцах из Ставропольского края. Установлена высокая положительная корреляция между показателями ФЗ, зараженностью F. graminearum и содержанием ДОН (табл. 2).
В зависимости от глубины проникновения гриба превышение ПДК микотоксинов может наблюдаться при различных показателях зараженности зерна. В сложившихся конкретных условиях 2011 г. инфицирование растений происходило в поздние сроки созревания
зерна и привело к субэпидермальной локализации гриба F. graminearum. Превышение ПДК ДОН согласно регрессионному анализу наблюдалось лишь при зараженности зерна F. graminearum на уровне 10-12% (рис.).
Рис. Зависимость содержания микотоксина ДОН от зараженности зерна F. graminearum
При возделывании пшеницы (сорта Таня и Эвклид) по предшественнику «кукуруза на зерно» увеличивались общая зараженность зерна в среднем в 4.1 раза, зараженность грибом F. graminearum в 9.6 раз и содержание ДОН в 11 раз по сравнению с другими предшественниками. Эти результаты согласуются с ранее полученными зависимостями, выявленными в зоне Северного Кавказа (Зазимко и др., 1991; Иващенко и др., 2004).
Таблица 2. Степень корреляции (г) показателей, получен_ных при анализе семян озимой пшеницы_
Анализируемые показатели Общая зараженность грибами Fusarium, % Зараженность F. graminearum, % ДОН, мкг/кг
КСА РФБ
ФЗ на КСА, % - - - -
ФЗ в рулонах, % 0.62*** - - -
Зараженность F. graminearum, % 0.88*** 0.69*** - -
Зараженность F. langsethiae, % - -0.45* - -
Зараженность Fusarium spp., % 0.48* - - -
ДОН, мкг/кг 0.83*** 0 71*** 0 93*** -
Больных проростков, % 0.46* 0 71*** 0.45* 0.45*
Развитие фузарио-за проростков, % 0.50* 0 78*** 0.54*** 0.50*
Вес проростков, г -0.56*** -0.63*** -0 55*** -
Примечание: приведены только статистически существенные значения (г) при уровене значимости *95%, **98%, ***99%; ДОН - дезоксиниваленол; КСА - картофель-но-сахарозный агар; РФБ - рулоны фильтровальной бумаги.
Установлена положительная корреляция между ФЗ, выявленной двумя методами (на КСА и в рулонах), а также этими показателями и зараженностью грибом F. graminearum (табл. 2). Вредоносность фузариевых грибов про-
Таблица 3. Характеристика образцов озимой пшеницы по качественным показателям зерна и проростков
Вестник защиты растений, 4, 2014 явилась также в увеличении болезни проростков (табл. 3). Количество больных проростков и развитие заболевания достоверно связаны со значениями ФЗ и с количеством зерен, зараженных F. graminearum.
Масса Доля зерен Доля Развитие Длина/масса
Сорт Предшественник 1000 с видимым больных фузариоза проростков,
семян, г фузариозом, % проростков, % проростков, % см, г
Деметра 29.7 9.8 13.0 13.2 12.9/3.5
я Вита озимая пшеница 36.6 12.5 29.0 26.7 14.1/4.0
яакс я и ц цку о Афелия 34.7 4.5 14.8 14.9 14.5/4.2
сь л Эвклид 31.2 14.4 19.5 22.1 12.7/3.2
о п Таня кукуруза на зерно 31.8 6.0 19.0 22.6 13.9/3.5
ор в р п е р Таня 32.4 7.6 24.8 30.1 13.7/3.4
а атС Понега Таня кукуруза на силос 34.8 29.6 6.5 19.0 5.5 24.8 5.5 28.9 13.7/4.4 13.8/3.6
Эвклид не указано 34.7 6.2 36.0 36.9 12.4/3.6
Москвич 36.8 3.7 17.0 13.3 19.8/4.6
Росинка 35.6 6.6 13.0 16.4 14.2/4.1
яа ак с Таня 30.9 13.1 9.8 11.1 13.9/3.7
я и Лига озимая пшеница 33.0 9.1 31.0 37.4 13.1/3.0
р а д цку Таня 36.7 3.4 17.0 18.2 13.9/4.0
о н о р Дока 38.0 4.2 11.0 13.8 10.0/4.6
с а р п е р Москвич 33.6 2.0 5.0 5.75 17.4/4.2
Таня овес 39.6 2.4 12.0 12.6 14.8/4.2
Сила кукуруза 31.3 7.2 11.0 12.0 13.6/3.8
Есаул сахарная свекла 33.2 1.2 5.0 6.9 14.0/4.7
В то же время количество больных проростков и степень их поражения не зависели от зараженности F. sporotrichioides и F. langsethiae. Выявлена отрицательная корреляция между ФЗ, определенной двумя методами, зараженностью F. graminearum и массой проростков (г= -0.55 ... -0.63 при р <0.01). На вес проростков значительное отрицательное влияние оказывали и другие показатели (при р <0.01): количество больных проростков (г= -0.57), развитие заболевания (г= -0.63) и количество явно фузариозных зерен (г= -0.66). Между длиной проростков и зараженностью семян взаимосвязи не установлено. По всей видимости, этот показатель в значительной степени обусловлен сортовыми особенностями. Масса 1000 семян анализируемых образцов варьировала от 20.6 до 39.6 граммов и была положительно связана только с массой проростков пшеницы (г= 0.62 при р <0.01).
Высококачественный семенной материал обусловливает получение высоких урожаев сельскохозяйственных культур. Проверку посевных качеств осуществляют государствен-
ные семенные инспекции, в которых показатели зараженности семян, как правило, оценивают визуально (ГОСТ 12044-93).
На основании многолетнего опыта изучения проблемы фузариоза мы предлагаем использовать визуальную оценку поражения зерна как предварительную. Так и в данном исследовании, количество зерен, имеющих видимые признаки фузариозного поражения, не было связано ни с общей зараженностью, ни с зараженностью определенным видом, ни с заболеванием проростков. Для достоверной оценки посевных качеств семян необходимо обязательное проведение фитоэкспертизы с использованием биологических методов, основанных на стимуляции роста и развития микроорганизмов в зараженных семенах. При визуальной оценке можно выявить симптомы заболевания, вызываемые только определенными видами, как, например, F. graminearum. Условия способствуют активному развитию этого патогена лишь на ограниченных территориях нашей страны - Северный Кавказ, некоторые районы Центрально-Черноземной зо-
Вестник защиты растений, 4, 2014 ны, Дальний Восток (Иващенко, Шипилова, 2004; Иващенко и др., 2004; Гагкаева и др., 2014). Проявление симптомов фузариоза также зависит от локализации грибов в зерне, па-тогенности конкретного штамма, устойчиво-
сти сорта, срока инфицирования растения и других факторов. Таким образом, при анализе зараженности зерна фузариевыми грибами необходимо обязательное проведение микологической и токсикологической экспертизы.
Литература
Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Левитин М.М. Биоразнообразие и ареалы основных токсинопродуцирующих грибов рода Fusarium // Биосфера, 2014, 6, 1, c. 36-45.
Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Левитин М.М., Новожилов К.В. Фузариоз зерновых культур. Приложение к журналу "Защита растений и карантин", 2011, 5, 52 с.
Зазимко М.И., Гоник А.Г., Лопатина Л.М. Методика системного анализа роли агротехнических приемов в ограничении вредоносности фузариоза колоса. В кн. Проблемы защиты зерновых культур от фузариоза и от других болезней. Минск, 1991, с. 60-64.
Иващенко В.Г., Шипилова Н.П. Грибы рода Fusarium на семенах хлебных злаков в основных зерновых регионах России (ареалы, частота встречаемости, соотношение). СПб-Пушкин, РАСХН, ВИЗР, 2004, 20 с.
Иващенко В.Г., Шипилова Н.П., Назаровская Л.А.
Фузариоз колоса хлебных злаков. СПб-Пушкин, РАСХН, ВИЗР, 2004, 230 с.
Лебедева Н.В., Криволуцкий Д.А., Пузаченко Ю.Г., Дьяконов К.Н., Алещенко Г.М. и др. География и мониторинг биоразнообразия. М., Из-во Научного и учебно-методического центра, 2002, 432 с.
Наумова Н.А. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию. Л., Колос, 1970, 208 с.
Семенов А.Я., Потлайчук В.И. Болезни семян полевых культур. Л., Колос, 1982, 128 с.
Шипилова Н.П. Видовой состав и биоэкологические особенности возбудителей фузариоза семян зерновых культур. Автореф. канд. дисс., Л., 1994, 21 с.
Gerlach W., Nirenberg H. I. The genus Fusarium - a pictorial atlas // Mitt. Biol. Bundesanst Land-Forstw. Berlin -Dahlem, 1982, 209, 406 p.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 14-26-00067
QUALITY OF WINTER WHEAT GRAIN INFECTED BY FUSARIUM FUNGI N.P.Shipilova, O.P.Gavrilova, T.Yu.Gagkaeva Fusarium damaged grains (FDG) is a serious disease of small grain crops. Apart from causing severe yield losses, these fungi can also produce mycotoxins, preventing contaminated crops to be further used as food or feed. Analyses of infected seeds, seed and seedling quality have been detected in samples of winter wheat harvested in 2011 in Stavropol and Krasnodar Territories. Fusarium fungi were identified in all studied wheat samples and infection was detected in 2 to 26% of the seeds. In the Stavropol Territory, F. graminearum was predominant species with 84% frequency, the following detected species were F. langsethiae and F. sporotrichioides (19-20%). In the Krasnodar Territory, the same Fusarium species dominated, with the nearly equal occurrence frequency (14%). The deox-ynivalenol (DON) content was detected in 58% of analyzed samples in the limits 20-1698 ppb. If maize was a pre-crop for cereals, then mean values for FDG, F. graminearum identified grains, DON content increased in 4.1, 9.6, and 11 times correspondingly, compared with other pre-crops. High positive correlation between FDG, F. graminearum identified in this study and DON content was revealed for all samples. Number of diseased seedlings and disease intensity significantly correlated with FDG and F. graminearum infection. Number of visual Fusarium damaged grains was unrelated with the percentages of FDG, grains contaminated any Fusarium fungi, and seedling rot. Keywords: grain, wheat, fungus, Fusarium, harmfulness.
Н.П.Шипилова, к.б.н., aleksei-shipilov.shipilov@yandex.ru О.П.Гаврилова, к.б.н., olgavrilova1@yandex.ru Т.Ю.Гагкаева, к.б.н., t.gagkaeva@yahoo.com
