CC BY
52
УДК [616.441:612.018:577.152.34]:612.017.2
ВЛИЯНИЕ ИОДСОДЕРЖАЩИХ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ НА СИСТЕМУ ПРОТЕОЛИЗА ПРИ СТРЕССЕ
© Городецкая И.В., Гусакова Е.А.
Витебский государственный медицинский университет, Республика Беларусь, 210015, Витебск, пр-т Фрунзе 27
Резюме: Экспериментальный гипотиреоз (25 мг/кг мерказолила 20 дней) определяет более выраженную, чем у эутиреоидных крыс, стимуляцию трисиноподобной активности (ТпА) в печени и, особенно, в крови в стадию тревоги стресс-реакции, обусловленную падением активности а^антитрипсина (а^АТ) и а2-макроглобулина (а2-МГ); в стадию резистентности -препятствует нормализации их активности; в стадию истощения - способствует наиболее значительной активации протеолиза вследствие глубокого угнетения активности агАТ и а2-МГ. Введение Ь-тироксина (1,5-3,0 мкг/кг 28 дней) ограничивает увеличение ТпА в стадии тревоги и истощения, в стадию устойчивости - предупреждает его, устраняя депрессию антипротеиназной активности.
Ключевые слова: йодсодержащие тиреоидные гормоны, стресс, трипсиноподобная активность, а1-антитрипсин, а2-макроглобулин
EFFECT OF IODINE-CONTAINING THYROID HORMONES ON THE SYSTEM OF PROTEOLYSIS IN STRESS
Gorodetskaya I.V., Gusakova E.A.
Vitebsk State Medical University, Belarus, 210015, Vitebsk, Frunze Avenue, 27
Summary: Experimental hypothyroidism (25 mg/kg merkazolil 20 days) becomes more pronounced, than in euthyroid rats, stimulation of the trypsin-like activity (TLA) in the liver, and particularly in the blood at the alarm stage of stress reaction, due to decrease of the activity of arantitrypsin (arAT) and a2-macroglobulin (a2-MG); at the stage of resistance it prevents the normalization of their activity; at the stage of exhaustion it promotes the most significant activation of proteolysis due to profound inhibition of the ai-AT and a2-MG activity. Administration of L-thyroxine (1.5-3.0 ^g/kg 28 days) limits the increase of TLA at the alarm- and exhaustion stages, in the stage of resistance prevents it, eliminating the depression of antiproteinase activity.
Key words: iodine-containing thyroid hormones, stress, trypsin-like activity, a1-antitrypsin, a2-macroglobulin
Введение
Установлено, что активация протеолитических процессов при стрессе имеет негативные последствия для судьбы клетки [2]. Вместе с тем, доказана важная роль йодсодержащих тиреоидных гормонов (ИТГ) в антистресс-системе организма, реализующаяся в результате их взаимодействия с клеточным геномом, что приводит к стимуляции локальных стресс-лимитирующих систем - белков теплового шока и антиоксидантных ферментов [8]. Однако воздействие ИТГ на систему протеиназы/ингибиторы при стрессе, дисбаланс в функционировании которой имеет важное значение в генезе стрессорных повреждений [23], до сих пор не исследовалось.
Цель исследования - установить значение ИТГ в изменениях активности протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов, вызванных стрессом.
Методика
Опыты поставлены на 221 половозрелых белых беспородных белых крысах-самцах массой 220250 г в осенне-зимний период. Животные были разделены на 13 групп: 1 - интактные; 2 -контроль (введение 1% крахмального клейстера); 3, 4, 5 - крысы, получавшие 1% крахмальный клейстер, подвергнутые стрессу «свободного плавания в клетке» [1] в течение 1 часа и взятые в эксперимент через 1, 48 часов после стресса и после стресса по 1 часу в течение 10 дней; 6 -животные, получавшие мерказолил (ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина) (25 мг/кг внутрижелудочно в 1% крахмальном клейстере в течение 20 дней); 7, 8, 9 - получавшие
мерказолил крысы, подвергнутые стрессу и взятые в эксперимент в такие же сроки; 10 -животные, получавшие «малые» дозы L-тироксина (Berlin-Chemie AG, «Менарини Групп», Германия) (1,5-3,0 мкг/кг внутрижелудочно в 1% крахмальном клейстере в течение 28 дней); 11, 12, 13 - получавшие L-тироксин крысы, подвергнутые стрессу и взятые в эксперимент в указанные сроки. Животных забивали декапитацией под уретановым наркозом (1 г/кг массы тела). Концентрацию ИТГ в крови - общих трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4), их свободных фракций (Т3св и Т4 св) - определяли радиоиммунологически с помощью наборов реактивов РИА-Т3-СТ, РИА-Т4-СТ (Институт биоорганической химии НАН Беларуси), RIA FT3, RIA FT4 (IMMUNOTECH, A Beckman Coulter Company, Чехия). Для характеристики интенсивности стресс-реакции исследовали: 1) относительную массу органов-маркеров стресса (надпочечников (ОМН), селезенки (ОМС), тимуса (ОМТ)), рассчитываемую как отношение абсолютной массы органов к массе тела; 2) состояние слизистой оболочки желудка (СОЖ), изучаемое визуально в отраженном свете под малым увеличением по тяжести поражения (ТП) (1 балл - эрозии, 2 балла - единичные язвы, 3 балла - множественные язвы, 4 балла - пенетрирующие или прободные язвы), частоте поражения (ЧП) (отношение числа животных, имевших дефекты слизистой, к общему количеству крыс в группе, выраженное в процентах), множественности поражения (МП) (числу повреждений у каждой крысы), индексу поражения (ИП) (сумме тяжести, частоты и множественности поражения) [3]. Состояние системы протеолиза оценивали по трипсиноподобной активности (ТпА) [15] и активности основных ингибиторов протеиназ - а1-антитрипсина (а1-АТ) и а2-макроглобулина (а2-МГ) [12]. Содержание белка в печени определяли по Лоури [21]. Индекс протеолиза (ИПр), отражающий напряженность или «управляемость» протеолитических процессов, рассчитывали по отношению ТпА к суммарной ингибиторной емкости (сумме активности а1-АТ и а2-МГ). Статистическую обработку результатов проводили с помощью лицензионной программы «Статистика 6.0». Количественные результаты представляли в виде Ме (LQ; UQ) (Me - медиана, (LQ; UQ) - интерквартильный интервал: верхняя граница нижнего квартиля (LQ) и нижняя граница верхнего квартиля (UQ)). Данные по ТП СОЖ, являющиеся качественными порядковыми признаками, представляли в виде относительных частот (процента крыс, имевших данную тяжесть изменений); по МП СОЖ - в виде количества язв и процента животных, имевших указанное количество язв. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты исследования
У интактных животных концентрация Т3 в крови составила 1,651 (1,574; 1,689) нмоль/л, Т4 -67,097 (62,367; 73,592) нмоль/л, Тзсв - 3,717 (3,582; 4,145) пмоль/л, Т4 св - 13,869 (13,099; 14,815) пмоль/л. ОМН была равна 0,18 (0,15; 0,23) мг/г, ОМС - 4,12 (3,91; 4,42) мг/г, ОМТ - 2,12 (1,94; 2,17) мг/г. ТпА в печени составила 51,163 (48,894-55,106) нмоль/ч-мг белка, в крови - 33,693 (21,526-35,565) нмоль/с-л; активность а1-АТ и а2-МГ в печени - 5,125 (5,047-5,570) мкмоль/с-мг белка и 33,108 (32,061-35,020) пмоль/с-мг белка. ТпА в крови была равна 5,432 (5,138-5,621) мкмоль/с-л и 0,407 (0,312-0,622) мкмоль/с-л. ИПр в печени - 9,89 (9,44-10,37) усл. ед, в крови он был значительно меньшим - 5,63 (3,95-6,52) усл. ед.
Через 1 час после СПК были обнаружены соматические и вегетативные изменения, соответствующие стадии тревоги стресс-реакции - возрастание ОМН на 47% (р<0,05), снижение ОМС на 23% (р<0,01), ОМТ - на 22% (р<0,01) (рис. 1); повреждение СОЖ у 70% животных с ТП 1 балл у 40% крыс, 2 балла - у 20%, 3 балла - у 10% (р<0,01); МП - 1 поражение у 40% животных, 2 - у 30% (р<0,01); ИП - 2,8 (рис. 2).
В этот период сывороточная концентрация ЙТГ увеличивалась (Т3 - на 26% (р<0,01), Т4 - на 28% (р<0,01), Т3 св - на 64% (р<0,01), Т4 св - на 54% (р<0,01) (рис. 3) и происходило повышение ТпА в печени на 23% (табл. 1) и, в несколько большей степени, в крови на 33% (табл. 2). В ответ на активацию протеолиза в печени возрастала активность а1-АТ на 24%. Однако активность а2-МГ в ней, напротив, снижалась на 13%. Сывороточная же активность а2-МГ увеличивалась на 28%. Активность а1-АТ в крови не отличалась от контроля. В результате ИПр в печени был таким же, как в контроле, а в крови возрастал в 1,33 раза.
Через 48 часов после СПК изученные нами вегетативные и соматические параметры (кроме повреждения СОЖ), а также уровни ЙТГ в крови возвращались к исходным значениям, что позволило нам отнести этот период к стадии резистентности стресс-реакции. ТпА в печени также начинала возвращаться к исходной величине, но все же незначительно превышала ее на 8%.
Рис. 1. Влияние изменения тиреоидного статуса на относительную массу надпочечников, селезенки и тимуса при стрессе.
Примечания: 1. Здесь и на рис. 2 и 3: 1) р<0,05 по отношению: * - к контролю; * - к соответствующей стадии стресса без препаратов; + - к контролю и соответствующей стадии стресса без препаратов; o - к группе животных, получавших мерказолил; Л - к группе животных, получавших тироксин; 2) обозначения групп животных: К - контроль; СТ - стадия тревоги; СУ - стадия устойчивости; СИ -стадия истощения; М - мерказолил; МСТ - мерказолил и стадия тревоги; МСУ - мерказолил и стадия устойчивости; МСИ -мерказолил и стадия истощения; Т - тироксин; ТСТ - тироксин и стадия тревоги; ТСУ - тироксин и стадия устойчивости; ТСИ -тироксин и стадия истощения.
2. Здесь и на рис. 3: данные представлены в виде графиков «Box and whisker», где □ - медиана; П - (LQ; UQ) - верхняя граница нижнего квартиля и нижняя граница верхнего квартиля; -у , - минимальное и максимальное значения
В крови же ТпА полностью возвращалась к ее величине в контроле. Изменение активности изученных протеиназных ингибиторов в печени сохраняло свое направление, однако становилось менее выраженным. Активность а1-АТ превышала ее значение в контроле на 12%, а2-МГ - была меньше его на 8%. Активность а2-МГ в крови начинала возвращаться к исходной величине, однако по-прежнему была выше ее на 16%. Активность а1-АТ в крови, как и в стадию тревоги, не отличалась от ее значения в контрольной группе животных. Вследствие указанных изменений значение ИПр и в крови, и в печени было таким же, как в контроле.
СПК по 1 часу в течение 10 дней вызывало наибольшие изменения изученных показателей внутренних органов: рост ОМН на 82% (р<0,01), снижение ОМС на 28% (р<0,01), ОМТ - на 30% (р<0,01); поражение СОЖ у 100% животных с ТП 1 балл у 20% крыс, 2 - у 50%, 3 - у 30% (р<0,001); МП - 1 поражение у 50% крыс, 2 - у 20% и от 3 до 5 - у 30% (р<0,001); ИП - 5,2, а также гибель 20% крыс, что было оценено нами как стадия истощения стресс-реакции. Сывороточные уровни ИТГ снижались: Т3 - на 20% (р<0,01), Т4 - на 24% (р<0,01), Т3 св - на 27% (р<0,01), Т4 св - на 35% (р<0,01). Активность протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов изменялась наиболее существенно. ТпА в печени повышалась на 38%, в крови в еще большей степени - на 52%. Однако, несмотря на это, активность а1-АТ и а2-МГ падала: в печени -на 39 и 23%, в крови - на 29 и 35%. ИПр в печени в отличие от стадии тревоги повышался - в 2,25 раза, а в крови, как и в указанную стадию увеличивался, но более значительно - в 2,19 раза.
Тяжесть
МСУ 04
Множественность, число поражений на крысу
МСУ о+
Частота
поражения. К
% ТСИ
Рис. 2. Влияние изменения тиреоидного статуса на поражение слизистой оболочки желудка, вызванное стрессом
2Д
- аЬ Я-
а " - -гтО Я П п
К СТ СУ СИ М МСТ МСУ мси Т ТСТ ТСУ ТСИ груп па ЖИЕОТН ЫЭС
X,
ГШ
СГ СУ
ИЛСТ МСУ М€И
ХОТ ТС/ "Г СИ
р п п п
СТ СУ
МСГ УСУ мое группа живот нь х
ТСТ ТСУ ТСИ
ж
ж
СУ СИ
МЕГГ И/СУ кси группа зежогн ыэе
ТСТ ТСУ ТСИ
Рис. 3. Уровень йодсодержащих тиреоидных гормонов в крови при стрессе без и после введения мерказолила или малых доз Ь-тироксина
У животных, получавших мерказолил, на фоне падения концентрации ИТГ в крови: Т3 - на 22% (р<0,01), Т4 - на 18% (р<0,01), Тэ св - на 31% (р<0,01), Т4 св - на 27% (р<0,01) ОМН уменьшалась на 18% (р<0,05), ОМС - на 12% (р<0,01), ОМТ - на 10% (р<0,05). У 60% крыс развивалось повреждение СОЖ с ТП 1 балл (р<0,05); МП - 2 поражения у 30% животных, 3 - у 20%, 4 - у 10% (р<0,05); ИП - 2,8. Активность всех исследованных показателей системы протеиназы-ингибиторы снижалась: ТпА в печени на 12%, в крови на 24%; а1-АТ и а2-МГ в печени на 13 и 11%, в крови на 12 и 17%. Однако ИПр как в крови, так и в печени был таким же, как у контрольных животных.
Таблица 1. Влияние изменения тиреоидного статуса на трипсиноподобную активность, активность ингибиторов протеиназ в печени при стрессе
Трипсиноподобная Активность Активность Индекс
Группа животных активность, нмоль/ч^мг белка агантитрипсина, мкмоль/с^мг белка а2-макроглобулина, пмоль/с^мг белка протеолиза, усл. ед
1. Контроль (п=7) 50,071 (48,048; 52,645) 5,216 (5,094; 5,425) 32,730 (32,163; 33,518) 9,63 (9,04; 10,23)
2. Стадия тревоги(п=7) 61,577 (56,127; 64,046) 6,463 (5,971; 6,587) 28,552 (27,861; 29,310) 9,42 (9,08; 10,69)
1-2 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р>0,05
3. Стадия устойчивости (п=7) 54,061 (52,064; 57,364) 5,843 (5,635; 5,943) 30,140 (29,532; 30,526) 9,59 (8,80; 9,76)
1-3 р<0,05 р<0,01 р<0,01 р>0,05
2-3 р<0,05 р<0,05 р<0,05 р>0,05
4. Стадия истощения (п=7) 68,966 (65,076; 74,066) 3,160 (2,963; 3,852) 25,302 (23,667; 26,426) 21,64 (17,90; 23,44)
1-4 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
2-4 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
3-4 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
5. Мерказолил (п=7) 44,309 (39,032; 48,200) 4,546 (4,412; 4,915) 29,174 (28,616; 30,443) 9,82 (8,38; 10,14)
1-5 р<0,05 р<0,01 р<0,01 р>0,05
6. Мерказолил + стадия тревоги (п=7) 64,337 (62,95; 69,183) 3,166 (3,049; 3,762) 23,716 (22,361; 27,110) 19,88 (17,87; 21,14)
5-6 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
1-6 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
2-6 р<0,05 р<0,01 р<0,01 р<0,01
7. Мерказолил + стадия устойчивости (п=7) 60,186 (58,387; 63,023) 3,435 (3,264; 3,908) 24,399 (21,938; 26,692) 17,70 (15,66; 18,32)
5-7 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
1-7 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
3-7 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
8. Мерказолил + стадия истощения (п=7) 78,321 (73,910; 79,128) 1,919 (1,832; 2,037) 19,118 (17,401; 21,418) 40,81 (38,89; 42,11)
5-8 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
1-8 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
4-8 р<0,05 р<0,01 р<0,01 р<0,01
9. Тироксин (п=7) 51,442 (49,073; 55,018) 5,432 (5,314; 5,521) 33,117 (32,645; 34,017) 9,32 (8,95; 10,35)
1-9 р>0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05
10. Тироксин + стадия тревоги (п=7) 55,293 (52,174; 57,069) 5,834 (5,732; 6,112) 34,919 (34,634; 35,137) 9,52 (9,08; 9,64)
9-10 р<0,05 р<0,01 р<0,05 р>0,05
1-10 р<0,05 р<0,01 р<0,01 р>0,05
2-10 р<0,05 р<0,05 р<0,01 р>0,05
11. Тироксин + стадия устойчивости (п=7) 50,306 (49,130; 52,938) 5,584 (5,217; 5,669) 33,617 (32,654; 34,014) 9,42 (8,61; 9,86)
9-11 р>0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05
1-11 р>0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05
3-11 р<0,05 р<0,05 р<0,01 р>0,05
12. Тироксин + стадия истощения(п=7) 60,825 (56,982; 63,688) 4,121 (4,054; 4,354) 28,527 (27,930; 29,435) 14,75 (13,52; 15,30)
9-12 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
1-12 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
4-12 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
Примечание. Здесь и в табл. 2: 1) результаты представлены в виде Ме (LQ; UQ) (Ме - медиана, (LQ; UQ) - интерквартильный интервал: верхняя граница нижнего квартиля (LQ) и нижняя граница верхнего квартиля (UQ)); 2) р - обозначение достоверности различий
Таблица 2. Влияние изменения тиреоидного статуса на изменения трипсиноподобной активности, активности ингибиторов протеиназ в крови, вызванные стрессом
Группа животных Трипсиноподобная активность, нмоль/с^л Активность а1-антитрипсина, мкмоль/с^л Активность а2-макроглобулина, мкмоль/с^л Индекс протеолиза, усл. ед
1. Контроль (п=7) 31,353 (23,398; 35,565) 5,507 (5,294; 5,573) 0,486 (0,424; 0,528) 5,17 (4,02; 6,19)
2. Стадия тревоги (п=7) 41,648 (38,373; 43,988) 5,381 (5,135; 5,588) 0,624 (0,618; 0,701) 6,88 (6,51; 7,33)
1-2 р<0,01 р>0,05 р<0,01 р<0,01
3. Стадия устойчивости (п=7) 30,885 (27,610; 32,289) 5,360 (5,192; 5,540) 0,564 (0,549; 0,614) 5,01 (4,52; 5,38)
1-3 р>0,05 р>0,05 р<0,01 р>0,05
2-3 р<0,01 р>0,05 р<0,01 р<0,01
4. Стадия истощения (п=7) 47,732 (44,924; 54,751) 3,894 (3,699; 4,071) 0,318 (0,261; 0,324) 11,32 (10,69; 13,85)
1-4 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
2-4 р<0,05 р<0,01 р<0,01 р<0,01
3-4 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
5. Мерказолил (п=7) 23,866 (19,186; 26,206) 4,851 (4,347; 4,982) 0,401 (0,335; 0,454) 4,59 (3,63; 5,47)
1-5 р<0,05 р<0,01 р<0,05 р>0,05
6. Мерказолил + стадия тревоги (п=7) 44,456 (43,052; 51,008) 3,870 (3,639; 3,996) 0,313 (0,192; 0,332) 11,21 (10,52; 11,84)
5-6 р<0,01 р<0,01 р<0,05 р<0,01
1-6 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
2-6 р<0,05 р<0,01 р<0,01 р<0,01
7. Мерказолил + стадия устойчивости(п=7) 41,180 (39,309-43,988) 3,651 (3,450-3,978) 0,298 (0,239-0,334) 10,06 (9,50-11,69)
5-7 р<0,01 р<0,01 р<0,05 р<0,01
1-7 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
3-7 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
8. Мерказолил + стадия истощения (п=7) 58,027 (54,283; 61,303) 2,233 (1,706; 2,650) 0,158 (0,126; 0,206) 24,36 (22,66; 30,23)
5-8 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
1-8 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
4-8 р<0,05 р<0,01 р<0,01 р<0,01
9. Тироксин (п=7) 27,142 (24,802; 33,225) 5,420 (5,369; 5,522) 0,464 (0,395; 0,465) 4,75 (4,25; 5,50)
1-9 р>0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05
10. Тироксин + стадия тревоги (п=7) 36,501 (35,565; 36,969) 6,095 (5,966; 6,281) 0,552 (0,504; 0,586) 5,47 (5,28; 5,64)
9-10 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р>0,05
1-10 р<0,05 р<0,01 р<0,05 р>0,05
2-10 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
11. Тироксин + стадия устойчивости (п=7) 29,949 (25,738; 31,821) 5,783 (5,750; 5,849) 0,529 (0,520; 0,532) 4,70 (4,10; 5,03)
9-11 р>0,05 р<0,01 р<0,01 р>0,05
1-11 р>0,05 р<0,01 р<0,05 р>0,05
3-11 р>0,05 р<0,01 р<0,05 р>0,05
12. Тироксин + стадия истощения (п=7) 40,245 (37,437; 42,584) 4,395 (3,957; 4,548) 0,381 (0,365; 0,404) 8,25 (8,09; 9,03)
9-12 р<0,01 р<0,01 р<0,05 р<0,01
1-12 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
4-12 р<0,01 р<0,05 р<0,01 р<0,01
Через 1 час после СПК в отличие от стресса у эутиреоидных крыс сывороточное содержание ИТГ не увеличивалось, а падало, вследствие чего становилось меньшим по сравнению с таковым после стресса на фоне эутиреоза: Т3 - на 60% (р<0,01), Т4 - на 57% (р<0,01), Т3 св - на 109% (р<0,01), Т4 св - на 102% (р<0,01). ОМН не повышалась, как это имело место при стрессе у эутиреоидных животных, а ОМС и ОМТ уменьшались. В результате они были ниже, чем в соответствующую стадию стресса у эутиреоидных крыс: ОМН на 59% (р<0,01), ОМС - на 9% (р<0,01), ОМТ - на
13% (р<0,05). ТП (1 балл - у 20% животных, 2 - у 50%, 3 - у 30%, р<0,01) и МП (1 поражение у 40% крыс, 3 - у 20%, 4 - у 20%, 5 - у 20%, р<0,01) СОЖ, напротив, были более выраженными (р<0,05), как и ЧП - на 30%, и ИП - в 2,1 раза. В эту стадию происходило более значительное, чем после стресса у эутиреоидных животных, повышение ТпА в печени и, особенно, в крови: по отношению к группе «Мерказолил» данные показатели возрастали на 40 на 66%. Активность а^ АТ в печени в отличие от стресса у крыс, не получавших мерказолил, в такой же период исследования не увеличивалась, а падала - на 26%. Активность а2-МГ в печенихотя и снижалась, как у животных, перенесших СПК без мерказолила, но несколько более выраженно - на 17%. Кроме того, в отличие от аналогичной стадии стресса у эутиреоидных крыс наблюдалось уменьшение активности обоих протеиназных ингибиторов в крови: а1-АТ - на 18%, а2-МГ - на 19%. Вследствие этого ИПр в печени увеличивался, чего не наблюдалось в этот период стресс-реакции у животных, не получавших мерказолил, в 2,02 раза, а в крови также возрастал, но более существенно по сравнению с ними в 2,44 раза. По отношению к ее значению в контроле ТпА в печени была выше на 28%, в крови на 42%. Активность а1-АТ и а2-МГ, напротив, была ниже и в печени на 39 и 28%, и в крови на 30 и 36%. ИПр превышал контроль в 2,06 раза в печени и в 2,16 раза в крови.По сравнению с ее величиной в стадию тревоги у эутиреоидных крыс ТпА была несколько выше: в печени на 5%, в крови на 9%. Активность а1-АТ и а2-МГ, напротив, была существенно меньше: в печени на 63 и 15%, в крови на 28 и 64%. ИПр был больше: в печени в 2,11 раза, в крови в 1,63 раза.
Через 48 часов после СПК уровни ИТГ в крови не возвращались к исходным значениям, поэтому данная стадия стресса развивалась на фоне более низкой по сравнению с крысами, не получавшими мерказолил, концентрации ИТГ: Т3 - на 34% (р<0,01), Т4 - на 33% (р<0,01), Т3 св -на 35% (р<0,01), Т4 св - на 43% (р<0,01). ОМН оставалась такой же, как в группе «Мерказолил» (р>0,05), ОМС и ОМТ уменьшались. Поэтому по сравнению с их величинами в стадию резистентности у эутиреоидных животных они были меньшими: ОМН - на 53% (р<0,05), ОМС -на 8% (р<0,01), ОМТ - на 35% (р<0,01). Повреждение СОЖ было более существенным: ТП - 1 или 2 балла у 30% крыс, 3 - у 40% (р<0,05); МП - по 1 или 4 повреждению у 30%, по 5 или 6 - у 20% животных (р<0,01); ЧП была выше в 1,4 раза; ИП - в 2,7 раза. ТпА в печени оставалась значительно увеличенной - на 32% (по отношению к группе «Мерказолил»). ТпА в крови в отличие от животных, подвергнутых стрессу без мерказолила, не возвращалась к исходному значению, а сохранялась повышенной - на 55%. Активность а1-АТ в печени в отличие от стадии устойчивости у эутиреоидных крыс, перенесших СПК, не повышалась, а снижалась на 21%, а активность а2-МГ уменьшалась более существенно на 14%. Активность а1-АТ в крови в отличие от эутиреоидных животных в данную стадию стресс-реакции снижалась на 22%, а а2-МГ не возрастала, как у них, а также падала на 22%. В результате ИПр увеличивался в 1,80 раза в печени и в 2,19 раза в крови, чего не наблюдалось после стресса у эутиреоидных крыс. По сравнению с контролем ТпА была больше: на 20% в печени и на 31% в крови. Активность ингибиторов а1-АТ и а2-МГ, наоборот, была меньше: в печени на 34 и 25%, в крови на 34 и 39%. ИПр превышал контроль как в печени в 1,84 раза, так и в крови в 1,95 раза. По отношению к ее величине в стадию устойчивости у эутиреоидных животных ТпА была больше на 12% в печени и на 32% в крови. Активность ингибиторов была, напротив, ниже - и в печени, и в крови: а1-АТ на 46 и 31%, а2-МГ на 17 и 55%. ИПр в печени был выше в 1,85 раза, в крови в 2,01 раза.
Стадия истощения стресс-реакции у животных, получавших тиреостатик, сопровождалась наиболее глубоким угнетением тиреоидной функции: по сравнению со стрессом у эутиреоидных крыс сывороточная концентрация Т3 была ниже на 20% (р<0,01), Т4 - на 27% (р<0,01), Т3 св - на 23% (р<0,01), Т4 св - на 43% (р<0,01). По отношению к их значениям в указанной группе животных относительная масса стресс-сенситивных органов также была меньшей: ОМН - на 123% (р<0,01), ОМС - на 16% (р<0,01), ОМТ - на 17% (р<0,01), а ТП (2 балла у 20% и 3 - у 80% крыс, р<0,001)) и МП (1, 4 или 6 поражений у 20% животных, 5 - у 30%, 7 - у 10%, р<0,05) СОЖ были большими (р<0,05), как и ИП в 1,6 раза. Гибель животных была в 2 раза выше (р<0,05). Вместе с тем, в указанный период развивалось наиболее существенное изменение всех изученных показателей системы протеолиза. По отношению к группе «Мерказолил» ТпА в печени возрастала на 68%, в крови - на 109%; активность а1-АТ и а2-МГ в печени падала на 50 и 30%, в крови на 47 и 50%. ИПр возрастал в печени в 4,16 раза и, особенно значительно, в крови - в 5,31 раза. По сравнению с ее значением в контроле ТпА как в печени, так и в крови, была выше - на 56 и на 85%, тогда как активность а1-АТ и а2-МГ ниже на 63 и 41% в печени и на 59 и 67% в крови. ИПр в печени был больше, чем в контроле, в 4,24 раза, в крови в 4,71 раза. По отношению к эутиреоидным животным, перенесшим СПК и находящимся в такой же стадии стресс-реакции, все изменения в системе протеолиза были значительно более выраженными.
Введение малых, близких к физиологическим, доз Ь-тироксина не влияло на уровни ИТГ в крови, относительную массу стресс-сенситивных органов и состояние СОЖ и не изменяло ТпА, активность а^АТ и а2-МГ ни в печени, ни в крови, вследствие чего ИПр не отличался от контроля.
Через 1 час после СПК у крыс, получавших Ь-тироксин, сывороточное содержание ИТГ возрастало в меньшей степени, чем в стадию тревоги у не получавших его: Т3 - на 9% ( р<0,01), Т4 - на 12% (р<0,01), Т3 св - на 29% (р<0,01), Т4 - на 25% (р<0,01) меньше. Возрастания ОМН и снижения ОМС не наблюдалось (р>0,05 по отношению к группе «Тироксин»), а ОМТ незначительно падала. Поэтому по сравнению с их величиной у животных, не получавших Ь-тироксин, в аналогичную стадию стресс-реакции ОМН была ниже - на 23% (р<0,05), а ОМС и ОМТ выше - на 5% (р<0,05) и 13% (р<0,05). ТП СОЖ была меньшей (1 балл у 20% крыс, р<0,05), как и ЧП - в 3,5 раза, и ИП - в 3,1 раза. Увеличение ТпА в печени и крови было значительно менее выражено, чем после стресса у крыс без Ь-тироксина: по сравнению с группой «Тироксин» ТпА в печени повышалась только на 7%, а в крови несколько больше на 29%. В ответ на стимуляцию протеолиза происходило увеличение активности обоих ингибиторов протеиназ и в крови, и в печени.Повышение активности а^АТ в печени и а2-МГ в крови имело место и у животных, перенесших стресс без Ь-тироксина, однако у получавших его оно было выражено в несколько меньшей степени - на 8% и 19%. Активность а2-МГ в печени не снижалась, как после стресса у крыс, без Ь-тироксина, а, напротив, повышалась на 6%. Сывороточная активность а^АТ в отличие от таковой при стрессе у крыс, не получавших Ь-тироксин, у которых она не изменялась, увеличивалась на 13%. В результате ИПр как в печени, так и в крови не отличался от его значения в группе «Тироксин». По отношению к ее величине в контроле ТпА была незначительно выше: в печени на 10%, в крови на 16%. Активность ингибиторов а^АТ и а2-МГ также превышала ее величину в контроле: в печени на 12 и 7%, в крови на 11 и 14%. ИПр и в печени, и в крови не отличался от контроля.По сравнению с ТпА у крыс, которые не получали Ь-тироксин, в аналогичную стадию стресс-реакции ее значение в печени и крови было меньше на 13 и 17%. Активность а^АТ в печени и а2-МГ в крови также была ниже на 12 и 14%, а а2-МГ в печени и аг АТ крови, напротив, выше - на 20 и 13%. ИПр в печени был таким же, а в крови меньшим в 1,23 раза.
Через 48 часов после СПК уровни ИТГ в крови не отличались от их значений в группах «Тироксин», «Контроль», «Стресс» (р>0,05). По сравнению со стадией резистентности у крыс, не получавших Ь-тироксин, ОМН была ниже - на 30% (р<0,05), а ОМС и ОМТ выше - на 5% (р<0,05) и 10% (р<0,05). Повреждение СОЖ характеризовалось меньшими ТП (1 балл у 20% животных, р<0,05), ЧП - в 3,5 раза и ИП - в 3,1 раза. В стадию устойчивости у крыс, получавших Ь-тироксин, не наблюдалось повышения ТпА в печени (по отношению к группе «Тироксин»), имевшего место у животных, подвергнутых стрессу без Ь-тироксина, а ТпА в крови, как и у них, не изменялась. В отличие от крыс, не получавших Ь-тироксин, активность а1-АТ и а2-МГ в печени также не изменялась. Сывороточная активность агАТ в отличие от таковой при стрессе без препарата незначительно увеличивалась на 7%. Активность а2-МГ в крови повышалась, как и в указанной группе животных, но в несколько меньшей степени - на 14%. ИПр как в крови, так и в печени не отличался от его значения в группе «Тироксин». По сравнению с контролем ТпА и активность исследованных ингибиторов протеиназ в печени, а также ТпА в крови были такими же, а активность а1-АТ и а2-МГ в крови незначительно большей на 5 и 9%. ИПр не отличался от контроля ни в крови, ни в печени. По отношению к ее величине у крыс без Ь-тироксина в аналогичный период исследования ТпА в печени была ниже на 8%, в крови - такой же. Активность а1-АТ в печени и а2-МГ в крови была меньше на 5 и 7%, а2-МГ в печени и а1-АТ в крови, напротив, незначительно выше на 11 и 6%. В результате ИПр как в крови, так и в печени был таким же.
Стадия истощения у животных, получавших Ь-тироксин, сопровождалась менее существенным, чем после стресса у крыс, не получавших его, снижением сывороточного содержания ИТГ: Т3 - на 8% (р<0,01), Т4 - на 5% (р<0,01), Т3 св - на 12% (р<0,01), Т4 св - на 9% (р<0,01) меньше. По отношению к группе «Тироксин» ОМН не изменялась (р>0,05), а ОМС и ОМТ незначительно снижались. По сравнению с их величиной у животных, не получавших Ь-тироксин, в такую же стадию эксперимента ОМН была меньше на 47% (р<0,05), ОМС - выше на 12% (р<0,01), как и ОМТ, на 15% (р<0,01). Повреждение СОЖ имело меньшие ТП (1 балл у 80% крыс и 2 балла у 20%, р<0,05) и ИП в 1,2 раза. Вместе с тем, стадия истощения сопровождалась и менее выраженными изменениями всех изученных показателей системы протеолиза по сравнению с животными, не получавшими Ь-тироксин. ТпА в печени и крови (по отношению к группе «Тироксин») увеличивалась только на 18 и 41%, активность а^АТ и а2-МГ снижалась на 25 и 14% в печени и на 18 и 17% в крови. ИПр в печени возрастал лишь в 1,58 раза, в крови в 1,74 раза. По сравнению с ее величиной в контроле ТпА и в печени, и в крови была незначительно больше на 21 и 28%. Активность а1-АТ и а2-МГ, напротив, несколько ниже на 21 и 13% в печени и на 20 и 22% в
крови. ИПр в печени превышал контроль в 1,53 раза, в крови в 1,60 раза. По отношению к их значениям после стресса у крыс, не получавших Ь-тироксин, ТпА в печени и крови была меньше на 17 и 24%, а активность а1-АТ и а2-МГ больше: в печени на 18 и 10%, в крови на 11 и 13%. В результате ИПр был ниже и в печени, и в крови в 1,47 и 1,37 раза.
Обсуждение результатов
В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что изменение уровня ИТГ в организме влияет на функционирование системы протеиназы/ингибиторы при стрессе: экспериментальный гипотиреоз препятствует установлению динамического равновесия между активностью протеиназ и их эндогенных ингибиторов, тогда как малые дозы Ь-тироксина обеспечивают нормализацию регуляторных взаимоотношений в указанной системе. Возможными механизмами обнаруженной зависимости являются: во-первых, влияние ИТГ на процессы перекисного окисления липидов [17], продукты которого вызывают повреждение целостности мембран [5], в том числе лизосомальных, и высвобождение протеиназ, нарушение структуры белков [22] и увеличение поступления Са2+ внутрь клетки [11], что активирует протеолитические ферменты; во-вторых, влияние ИТГ на структуру и функцию печени, поскольку установлено, что при тиреопатиях нарушаются ее гистоструктура (появляются дистрофические и некротические повреждения, торможение пролиферации и дифференцировки гепатоцитов, изменение кровенаполнения синусоидных капиляров, воспалительная инфильтрация паренхимы, разрушение митохондрий и лизосом, а также увеличение количества активированных клеток Купфера [6, 7]) и функциональное состояние (в частности, страдают детоксикационная [4], белок- [10] и липидсинтезирующая [13] функции); в третьих, влияние ИТГ на активность холино- [16] и адренореактивных структур [20], участвующих в вегетативной нервной регуляции активности протеолитических ферментов, в том числе при стрессе^ [9, 19]. Реализация указанных механизмов может быть связана с фундаментальным действием ИТГ на геном, приводящим к стимуляции синтеза высокоспецифических клеточных белков [8]. Необходимо учитывать и неспецифическое действие ИТГ, их влияние на проницаемость клеточных мембран [14] и активность энергетических процессов в митохондриях [18], от которых также зависят уровень и активность протеолитических ферментов [23].
Выводы
1. Стадия тревоги стресс-реакции характеризуется сложной реакцией организма на уровне регуляции системы протеиназы-ингибиторы - стимуляцией протеолиза в печени и, особенно, в крови, в ответ на которую в последней повышается активность а2-МГ, а в печени изменяется активность обоих протеиназных ингибиторов, однако разнонаправленно. Увеличение активности а1-АТ и уменьшение таковой а2-МГ в печени в указанный период времени может свидетельствовать о том, что выброс а2-МГ из печени в кровь является более быстрым (в течение 1 часа) процессом, тогда как выброс а1-АТ - более отложенным во времени. Это объясняет обнаруженное нами повышение активности только а2-МГ в крови в указанный период. Следующая стадия стресс-реакции - стадия резистентности приводит к нормализации протеолитической активности в крови и к ограничению ее возрастания в печени, как и изменения активности а2-МГ в крови и обоих ингибиторов протеиназ в печени. В стадию истощения стресс-реакции, как и в стадию тревоги, ТпА увеличивается и в печени, и в крови, однако намного более значительно. При этом не только не происходит компенсаторно-обусловленного роста активности протеиназных ингибиторов, а, напротив, наблюдается ее снижение: в печени уменьшается преимущественно активность а1-АТ, а в крови - активность а2-МГ. Возможно это отражает различный вклад указанных ингибиторов в регуляцию системы протеолиза в этих условиях.
2. Экспериментальный гипотиреоз per se вызывает уменьшение протео- и антипротеиназной активности. В стадию тревоги он определяет более выраженную стимуляцию протеолиза в печени и крови, обусловленную падением активности ингибиторов протеиназ. Это смещает динамическое равновесие в системе протеолиза в сторону протеолитических ферментов, что приводит к существенному увеличению ИПр. Через 48 часов после СПК экспериментальный гипотиреоз препятствует ограничению изменений активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, имевшему место в стадию резистентности у эутиреоидных животных, вследствие чего ТпА в печени и крови остается повышенной, а активность ингибиторов протеиназ снижается. В стадию истощения стресс-реакции гипотиреоз способствует появлению
наиболее существенных изменений регуляторных взаимоотношений в системе протеолитические ферменты/их ингибиторы, что проявляется в избыточной активации протеолиза вследствие глубокого угнетения активности ингибиторных систем.
3. Введение Ь-тироксина в малых дозах само по себе не вызывает изменений изученных нами показателей системы протеолиза. В стадию тревоги стресс-реакции Ь-тироксин лимитирует увеличение ТпА в печени и крови в результате стимуляции активности ингибиторов протеолитических ферментов. Меньшее возрастание активности а1-АТ в печени и а2-МГ в крови по сравнению с животными, не получавшими Ь-тироксин, возможно связано с меньшей активацией протеолиза в этих условиях. В стадию устойчивости стресс-реакции Ь-тироксин предупреждает стимуляцию ТпА и падение активности а2-МГ в печени и наряду с этим обеспечивает возрастание активности а1-АТ в крови. В стадию истощения Ь-тироксин минимизирует активацию протеолиза в печени и крови, за счет устранения депрессии антипротеиназной активности.
Литература
1. Бондаренко С.Н., Бондаренко Н.А., Манухина Е.Б. Влияние различных методик стрессирования и адаптации на поведенческие и соматические показатели у крыс // Бюл. эксперим. биол. медицины. -1999. - Т.128, №8. - С. 157-160.
2. Веремеенко K.H., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. К.: Здоров'я, 1988. - 199 с.
3. Виноградов В.А., Полонский В.М. Влияние нейропептидов на экспериментальную дуоденальную язву у крыс // Патол. физиол. эксперим. терапия. - 1983. - №1. - С. 3-7.
4. Висмонт А.Ф., Лобанок Л.М. Об участии аргиназы печени в процессах детоксикации и терморегуляции при эндотоксиновой лихорадке // Воен. медицина. - 2011. - №1. - С. 105-109.
5. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. - 252 с.
6. Ибрагимов В.Р., Козлов В.Н., Касьянова Ю.В. и др. Влияние тиреостатических препаратов на гистоструктуру печени у крыс в эксперименте // Пращ ТДАТУ. - 2010. - Т.2, №12. - С. 141-146.
7. Макарова Н.Г., Васильева Л.С., Гармаева Д.В. Структура печени при экспериментальном гипотиреозе // Сибирский мед. журнал. - 2010. - Т.93, №2. - С. 42-44.
8. Малышев И.Ю., Голубева Л.Ю., Божко А.П., Городецкая И.В. Роль локальных стресс-лимитирующих систем миокарда в протекторном кардиальном эффекте малых доз тиреоидных гормонов при иммобилизационном стрессе у крыс // Рос. физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 2000. - №1. - С. 62-67.
9. Мардас Д.К., Никандров В.Н. Роль М-холинорецепторов в регуляции баланса системы протеолиза при тепловом стрессе // Функциональные системы организма в норме и при патологии / Под ред. В.С. Улащика. - Минск: РИВШ, 2000. - С. 147.
10. Рендаков Н.Л. Изменение активности протеолитических ферментов лизосом при действии мерказолила и тироксина у песцов // Вестн. молод. ученых. Серия: науки о жизни. - 2004. - №1. - С. 61-67.
11. Сазонтова Т.Г., Мацкевич А.А. Тканеспецифичность протекторного действия цитоплазматических факторов на мембранно-связанную систему транспорта Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме сердца и скелетных мышц // Пат. физиол. эксперим. терапия. - 2000. - №2. - С. 3-6.
12. Хватов В.Б., Белова Т.А. Ускоренный метод определения основных ингибиторов протеиназ в плазме крови человека: метод.рекомендации. - М., 1981. - 345 с.
13. Ajayi A.F., Akhigbe R.E. Implication of altered thyroid state on liver function // Thyroid Res. Pract. - 2012. -N9. - С. 84-87.
14. Capasso G., De Tommaso G., Pica A. et al. Effects of thyroid hormones on heart and kidney functions // Miner Electrolyte Metab. - 1999. - V.25, N1-2. - P. 56-64.
15. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen M. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. - 1961. - V.95, N2. - Р. 271-278.
16. Fuhrmann G., Kempf E., Ebel A. Effects of hormone therapy on the central cholinergic neurotransmission of the Snell dwarf mouse // J. Neurosci. Res. - 1986. - V.16, N3. - Р. 527-539.
17. Gredilla R., Lopez Torres M., Portero-Otin M. et al. Influence of hyper- and hypothyroidism on lipid peroxidation, unsaturation of phospholipids, glutathione system and oxidative damage to nuclear and mitochondrial DNA in mice skeletal muscle // Mol. Cell. Biochem. - 2001. - V.221, N1-2. - Р. 41-48.
18. Harper M.E., Seifert E.L. Thyroid hormone effects on mitochondrial energetics // Thyroid. - 2008. - V.18, N2. - Р. 145-56.
19. Jaffré F., Friedman A., Hu Z. et al. Beta-adrenergic receptor stimulation transactivates protease-activated receptor 1 via MMP-13 in cardiac cells // Circulation. - 2012. -V.125, N24. - P. 2993-3003.
20. Kim B., Carvalho-Bianco S.D., Larsen P.R. Thyroid hormone and adrenergic signaling in the heart // Arq. Bras. Endocrinol. Metabol. - 2004. - V.48, N1. - P. 171-175.
21. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V.193, N1. - P. 265-275.
22. Negre-Salvayre A., Coatrieux C., Ingueneau C. et al. Advanced lipid peroxidation end products in oxidative damage to proteins. Potential role in diseases and therapeutic prospects for the inhibitors // Br. J. Pharmacol. -2008. - V.153, N1. - P. 6-20.
23. Neil D., Rawlings N.D., Salvesen G. Handbook of proteolytic enzymes. - Academic Press: Oxford, 2013. -1666 p.
Информация об авторах
Городецкая Ирина Владимировна - доктор медицинских наук, профессор, заместитель декана лечебного факультета Витебского государственного ордена Дружбы народов медицинского университета. E-mail: [email protected].
Гусакова Елена Анатольевна - ассистент кафедры общей и физколлоидной химии Витебского государственного ордена Дружбы народов медицинского университета. E-mail: [email protected].
