CC BY
63
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS
© Коллектив авторов, 1996 УДК 616-018-006. 04-085. 849-092. 4
Г. А. Бажутова, Г. С. Калепдо, А. С. Ягу бое
ВЛИЯНИЕ у-ОБЛУЧЕНИЯ В ДОЗЕ 5 Гр НА ОДИНОЧНЫЕ И КОНТАКТИРУЮЩИЕ ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ НеЪа
Отдел молекулярно-биологических и радиоизотоп!шх методов исследования
Существуют противоречивые данные о роли межклеточных контактов в радиочувствительности клеток. По данным ряда авторов [7, 8], межклеточные контакты не влияют на радиочувствительность. С другой стороны, показано, что клетки, находящиеся в различной степени контакта друг с другом, по-разному реагируют на ионизирующие излучения [6]. Установлено увеличение эффективности процессов репарации у контактирующих клеток [4]. Предполагается, что причиной этого явления служит возникновение метаболической кооперации между этими клетками [2, 5]. Неодинаков и ответ одной и той же популяции клеток, находящейся в различном исходном состоянии, на модифицированное облучение [1].
В радиобиологии выживаемость клоногенных клеток, как правило, определяется при облучении различными дозами суспензии одиночных клеток [9]. В этих условиях сама процедура приготовления суспензии одиночных клеток до облучения приводит к выравниванию условий кислородного режима и радиочувствительности. Однако, как в свое время показали Даусон и соавт., результаты, полученные классическим методом Пака, исключающие межклеточные взаимодействия, мало пригодны для выяснения закономерностей, характерных для опухолей. Кроме того, этот метод дает сведения о жизнеспособности лишь клоногенных клеток. Более полную информацию о состоянии всей популяции в целом можно получить при построении кривых роста культуры клеток после облучения в соответствующих дозах.
В данной работе проведено сравнительное исследование реакции одиночных и контактирующих клеток на облучение в дозе 5 Гр.
Материалы и методы. Исследование проводили на культуре клеток НеЬа, которую выращивали в среде 199 с 10% сывороткой крупного рогатого скота с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин по 100 ЕД/мл), согласно стандартной методике работы с культурами клеток [3]. Клетки в концентрации 5,0 • 104/мл помешали
G. A. Bazhutova, G. S. Kalendo, A. S. Yagubov
EFFECT OF GAMMA-RADIATION AT 5 Gy ON SOLITARY AND CONTACTING TUMOR CELLS HeLa
Department for Molecular Biological and Radioisotopic Investigations
Data on the role of intercellular contacts in cell radiosensitivity are equivocal. Some authors [7, 8] believe that intercellular contacts have no influence on the radiosensitivity. On the other hand it is showed that cells staying in different degree of contact with each other react to ionizing radiation differently [6]. Repair processes proceed better in contacting cells [4]. It is presumed that metabolic cooperation of contacting cells may account for this effect [2,5]. Response of the same population to modified radiation may also vary depending upon population baseline state [1].
In radiobiology clonogenic cell survival is as a rule determined by irradiation of solitary cell suspension at various doses [9]. Therefore the very procedure of suspension preparation provides equal conditions of oxygen supply and radiosensitivity. However, Dawson el al. showed that results obtained according to the classical Puck technique excluding intercellular interaction are hardly helpful in study of regulations characteristic for tumors. Besides, this technique provides information on vitality of clonogenic cells only. More complete information on condition of the entire population may be obtained by plotting cell culture growth curves after irradiation at certain dosage.
This paper compares reaction of solitary and contacting cells to radiation at 5 Gy.
Materials and Methods. The study was performed on culture of HeLa cells in medium 199 with 10% cattle serum and antibiotics (penicillin, streptomycin at 100 U/ml) according to standard methods of operating cell cultures [3]. Cells at a concentration 5.0xl04 per ml were transferred into culture vials 3.1 cm2 in area. Cell suspension in 2 ml medium was placed in each vial.
A monolayer culture of HeLa cells in log-phase (day 3-4 following inoculation) was used as a model of contacting cells. Cells maintaining contact during irradiation (stored at this moment in stove at 37°C) were transferred into vials at 15-20 min following treatment.
Cell suspension or lag-phase cells at 2 h following inoculation were used as a solitary cell model.
Рис. 1. Кривые роста клеток HeLa после облучения в дозе 5 Гр.
1 — контроль; 2 — контактирующие клетки; 3 — одиночные клетки. Здесь и на рис. 2 по оси ординат — среднее количество клеток, выживших после облучения, отн. ед.; по оси абсцисс — время после посева и облучения, сут. Представлены данные трех параллельных опытов.
Fig. 1. HeLa growth curves after irradiation at 5 Gy.
1, control; 2, contacting cells; 3, solitary cells.
Here and in fig. 2 numerals on the у axis show relative units of average number of irradiation survivor cells; numerals on the у axis show days following inoculation and irradiation. Findings of three parallel experiments are summarized.
в культуральные флаконы площадью 3,1 см2. В каждый флакон вносили взвесь клеток в объеме 2 мл среды.
Моделью контактирующих клеток была монослойная культура клеток HeLa в логарифмической стадии роста (3—4-е сутки после посева). Клетки, находящиеся в момент облучения в контактирующем состоянии, через 15—20 мин после воздействия ионизирующего излучения (в это время они находились в термостате с температурой 37°С) рассеивали во флаконы.
Моделью одиночных клеток служили клетки, находящиеся либо в суспензии, либо в лаг-фазе роста спустя 2 ч после посева.
Одиночные и контактирующие клетки облучали в двух различных режимах: однократно в дозе 5 Гр и в той же дозе, но в режиме 0,1 Гр + 3 мин + 4,9 Гр. В качестве источника облучения использовали установку «Агат-Р» (Россия) с g-источником 60Со мощностью 0,8 Гр/мин.
Реакцию клеток оценивали по выживаемости клеток: построение кривых роста после облучения; определение плотности клеток в фиксированном поле зрения под микроскопом (окуляр 10, объектив 20); по цитоморфологическим параметрам: на окрашенных гематокси-лин-эозином препаратах изучали состояние монослоя по образованию клеточных комплексов.
Кривые роста строили по количеству выживших клеток на определенный срок наблюдения. Со дна флаконов клетки снимали с помощью 0,02% раствора Версена и далее подсчитывали в камере Горяева. Выживаемость клеток, облученных в состоянии суспензии, определяли так же, как и клеток, облученных в монослое, т. е. подсчитывали их количество во флаконах. Условия культивирования в том и другом случае были одинаковы. Контролем для обеих культур служили те же клетки, но не подвергавшиеся облучению. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с уровнем достоверности 0,95.
Таблица1 ТаЫе1
Количество выживших клеток HeLa в фиксированном поле зрения (в процентах к контролю) после облучения в дозе 5 Гр
Number of HeLa survivor cells in a fixed visual field (per cent of control) after irradiation at 5 Gy
Время после облучения, сутки Количество клеток
контроль, отн. ед. монослой, % суспензия, %
4-е 107 ±5,6 96,0 ±4,7 56,6 ±3,2
6-е 146 ±5,2 88,2 ±6,6 32,6 ±2,3
8-е 165±6,3 77,5 + 6,4 53,3 + 3,1
11-е 130 ±4,1 63,8 ±2,2 63,0±3,1
Days following ir- control, rel. u. monolayer, % suspension, %
radiation No. of cells
The solitary and contacting cells were irradiated by two different regimens: once at 5 Gy and at the same dosage by the schedule 0.1 Gy + 3 min + 4.9 Gy. Irradiation was performed using an Agat-2 (Russia) unit with a 60Co gamma-radiation source of a capacity
0.8 Gy/min.
Cell response was evaluated by cell survival: plotting of growth curves after irradiation; determination of cell density in a fixed visual field with a microscope (ocular 10, objective 20); by cytomorphology: monolayer condition was studied by cell complex generation on specimens with hematoxylin-eosin staining.
Growth curves were plotted by the number of survivor cells at a certain time of observation. The cells were harvested from the vial bottom using 0.02% Versen solution to be counted in a Goryaev chamber. Survival of cells in suspension and in monolayer was determined in a similar way, i. e. by the number of cells in vials. Culture conditions were also similar. The same cells without irradiation were used as control. Statistical analysis of differences was performed by statistics of variations at a confidence interval 0.95.
Results and Discussion. Fig.l shows HeLa culture growth curves after irradiation at 5 Gy. As seen, during days 6 to 10 the number of survivor cells having undergone irradiation in the solitary state was 1.5-2-fold lower than survival of cells irradiated in the state of contact. The reduction in population cell count in all test groups was due to specific features of culture inoculation (cell growth curve parameters were picked up for 14 days without replacement of the medium). By the end of the time of observation (deep stationary growth phase) the experimental conditions were unfavorable both for the control and the test cells. This is clearly seen in all figures. So, the comparison was effected during days 6 to 11 only.
Similar data were obtained as a result of measuring cell density. These results are summarized in the table. Survival rate in the monolayer culture on day 6 was 88.2% (in relation to the control). The survival remained similar on day 8. While in cells undergoing irradiation in the solitary state the survival dropped to 25.7 and 51% respectively.
Thus, resistance of cells staying in contact during irradiation was higher than that of cells irradiated in the solitary state.
а
ь
Рис. 2. Количество выживших контактирующих (а) и одиночных (Ь) клеток HeLa в поле зрения после облучения в дозе 5 Гр.
1: контроль; 2: 5 Гр; 3: 0,1 Гр + 3 мин+ 4,9 Гр.
Fig. 2. Number of contacting (a) and solitary (b) HeLa survivors in the visual field after irradiation at 5 Gy.
1, control; 2, 5 Gy; 3, 0.1 Gy + 3 min + 4.9 Gy.
Результаты и обсуждение. На рис. 1 представлены кривые роста клеток культуры НеЬа после облучения в дозе 5 Гр. Как видно, с 6-го по 10-й день наблюдения количество выживших клеток, облученных в одиночном состоянии, в 1,5—2 раза меньше, чем тех же клеток, но облученных в состоянии контакта. Снижение количества клеток популяции к 12-му дню во всех обследуемых группах связано с особенностями ведения культуры (кривые роста клеток снимались в течение 14 сут без смены среды). К концу срока наблюдения (глубокая стационарная фаза) создавались неблагоприятные условия роста клеток как для контроля, так и для опыта. Это хорошо видно на всех приведенных рисунках. В связи с этим сравнение проводилось только с 6-х по 11-е сутки.
Аналогичные данные получены и при подсчете плотности клеток. Результаты представлены в табл. 1. К 6-му дню в монослойной культуре выживших клеток оказалось 88,2% (по отношению к контролю). Приблизительно такое же количество выживших клеток сохранилось и к 8-му дню. В то же время у клеток, облученных в одиночном состоянии, выживаемость снизилась до 25,7 и 51% соответственно.
Таким образом, из этой серии экспериментов четко видно, что клетки, находящиеся в контакте в момент облучения, резистентнее, чем те же клетки, но облученные в одиночном состоянии.
Представляется интересным проанализировать ответ контактирующих и одиночных клеток на модифицированное малыми дозами облучение.
It is interesting to compare response of solitary and contacting cells to modified small-dose radiation.
Fig. 2 demonstrates counts of contacting survivor cells in the fixed visual field after one irradiation at 5 Gy and at the same dose, but in regimen 0.1 Gy + + 3 min + 4.9 Gy. As seen all points of curve 3 are below points of curve 2, i.e. modified irradiation reduces considerably survival of contacting cells. At the same time irradiation at 0.1 Gy failed to induce radiosensibility in cell suspension (or lag-phase cells) (fig.2). There was no increase in cell deaths under these conditions. Cell death rates after 5 Gy and after 0.1 Gy + 3 min + + 4.9 Gy were about similar.
Pay attention to difference in curves showed in figs.
2, a and 2, b. The first curve (see fig. 2, a) demonstrates a slow decrease in cell growth during days 4 to 8. While the count of cells irradiated in the solitary state drops dramatically during the first days following reinoculation and irradiation (see fig. 2, b) The cell number starts to grow (repopulation) after day 6 only and fails to reach the monolayer culture level. This proves higher sensitivity of cells undergoing irradiation in the solitary state.
Thus, our findings suggest that modified (sensibility-inducing) effect of small-dose radiation is observed only in cells maintaining intercellular contacts.
The next experimental series was carried out to analyze some morphological characteristics. After irradiation by the regimens described above HeLa cell population
Рис. 3. Процентное содержание клеточных комплексов с определенным числом клеток в них.
По оси ординат — количество клеточных комплексов, %, по оси абсцисс — время наблюдения, сут.
а — контроль; Ь — облучение в дозе 5 Гр монослойной культуры; с — облучение в режиме 0,1 Гр + 3 мин+ 4,9 Гр монослойной культуры; d—облучение в дозе 5 Гр суспензионной культуры; е — облучение в режиме 0,1 Гр + 3 мин+ 4,9 Гр.
1 — комплексы с числом клеток 3—4; 2 — комплексы с числом клеток 5—8; 3 — комплексы с числом клеток 9 и более.
Fig. 3. Percentage of cell complexes with a certain number of cells per complex.
Numerals on the у axis show percentage of cell complexes; numerals on the x axis show days of observation
a, control; b, 5 Gy, monolayer; c, 0.1 Gy + 3 min + 4.9 Gy, monolayer; d, 5 Gy, suspension; e, 0.1 Gy + 3 min + 4.9 Gy, suspension; 1, complexes of 3-4 cells; 2, complexes of 5-8 cells; 3, complexes of 9 and more cells.
На рис. 2, а приведены результаты подсчета количества выживших контактирующих клеток в фиксированном поле зрения, облученных в дозе 5 Гр и в той же дозе, но в режиме 0,1 Гр + 3 мин + 4,9 Гр. Видно, что все точки кривой 3 лежат ниже точек кривой 2, т. е. модифицированное облучение существенно снижает выживаемость контактирующих клеток. В то же время радиосенсибилизирующий эффект воздействия в дозе 0,1 Гр не проявляется при облучении суспензии клеток (или клеток в лаг-фазе роста) — рис. 2, Ь. Увеличения гибели клеток в этих условиях мы не наблюдали. Гибель клеток и при облучении в дозе 5 Гр, и в режиме 0,1 Гр + 3 мин + 4,9 Гр приблизительно одинакова.
Следует отметить различия в ходе кривых на рис. 2, а и 2, Ь. При сравнении видно, что в первом случае (см. рис. 2, а) с 4-х по 8-е сутки происходит медленное снижение роста клеток. В то же время у клеток, облученных в одиночном состоянии, в первые дни после пересева и облучения (см. рис. 2, Ь) количество клеток в фиксированном поле зрения резко падает.
Только после 6-х суток наблюдается рост числа клеток (процесс репопуляции), который все же не достигает уровня монослойной культуры. Это еще раз свидетельствует о большей чувствительности клеток, облученных в одиночном состоянии.
Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что модифицированное (сенсибилизирующее) действие малых доз радиации наблюдается только при наличии контактов между клетками.
В следующей серии экспериментов проанализированы некоторые морфологические показатели. После облучения культуры клеток НеЬа в вышеуказанных режимах отмечалась комплексная реакция популяции клеток, приводящая к ее реорганизации. Происходят изменения в формировании клеточных комплексов, которые наблюдаются и в контроле (у необлученной культуры).
Под клеточными комплексами мы подразумеваем условно организованный комплекс, в котором вокруг центральной клетки группируется от 3 и более периферических клеток.
В контроле на протяжении всего времени наблюдения значительно преобладали клеточные комплексы со средним количеством клеток (от 5 до 8) — рис. 3, а. Наибольшее число клеток в клеточных комплексах (рис. 4, а, Ь), а также средние клеточные комплексы отмечались на 11-е сутки.
Под действием облучения в дозе 5 Гр в монослойной культуре клеток НеЬа к 8-му дню наблюдения увеличивается количество клеток, вовлеченных в процесс образования клеточных комплексов. На этот же срок приходится и максимальное количество средних клеточных комплексов (рис. 3, Ь, 4). Такая же динамика образования средних клеточных комплексов и у суспензионной культуры (рис. 3, с{). Количество же клеток, организующих клеточные комплексы, у одиночных клеток приблизительно одинаково на протяжении всего эксперимента.
а
Ь
Рис. 4. Общее количество выживших контактирующих (а) и одиночных (Ь) клеток HeLa, организованных в клеточные комплексы после облучения в дозе 5 Гр.
По оси ординат — количество выживших клеток, организованных в клеточные комплексы, %; по оси абсцисс—время после посева и облучения, сут.
1: контроль; 2: 5 Гр; 3: 0,1 Гр + 3 мин + 4,9 Гр.
Fig. 4. Total number of contacting (a) and solitary (b) HeLa survivors arranged in cell complexes after irradiation at 5 Gy.
Numbers on the у axis show percentage of survivor cells arranged in cell complexes; numbers on the x axis show days following inoculation and irradiation.
1, control; 2, 5 Gy; 3, 0.1 Gy + 3 min + 4.9 Gy.
При сравнении гистограмм на рис. 3, b, d, е можно отметить, что особых различий в тенденции образования данных клеточных структур не наблюдается. Размеры клеточных комплексов по числу клеток в них во всех трех случаях приблизительно одинаковы. В то же время в монослое количество клеток, вовлеченных в процесс образования клеточных комплексов, облученных в режиме 0,1 Гр + 3 мин + 4,9 Гр, было в 2—3 раза меньше, чем в группах, облученных однократно в той же дозе. Отлична от вышеуказанных и гистограмма на рис. 3, с. Основное различие наблюдается на 6-е сутки: преобладают комплексы с наименьшим количеством клеток (от 3 до 4).
Совокупность этих данных свидетельствует о том, что действие предварительного облучения в дозе 0,1 Гр существенно снижает количество клеток, вовлеченных в процесс образования клеточных комплексов (см. рис. 4) и уменьшает их размеры (см. рис. 3 с).
Выводы
1. Клетки, находящиеся в момент облучения в одиночном состоянии, более чувствительны, чем контактирующие клетки.
2. Модифицирующее действие малых доз ионизирующего излучения проявляется только при облучении контактирующих клеток.
3. Предварительное облучение в дозе 0,1 Гр моно-слойной культуры значительно снижает количество клеток, вовлеченных в процесс образования клеточных комплексов. Уменьшается как общее количество клеток в клеточных комплексах, так и их число в самих комплексах.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Календо Г. С., Журбицкая В. А., Винская Н. П., Восканян Г. P. II Радиобиология. — 1975.—Т. 15, № 3. — С. 348.
2. Конев С. В., Ма.жуль В. М. Межклеточные контакты. — Минск, 1977, —С. 312.
3. Новохотский А. С. II Итоги науки и техники. Вирусология. Т. 8. — М., 1979. — С. 3.
4. Dawson К. В., Madoc-Jones Н., Mauro F., Peacock J. N. II Europ. J. Cancer. — 1973. — Vol. 9. — P. 59.
5. Derlinger 11., Lucke-Huhle C„ Schlag H., Weibezahn K. F. II Int.
J. Radiat. Biol. — 1976. — Vol. 29, N 3. — P. 271.
6. Durand R. F. Sutherland R. M. // Radiat. Res. — 1973. — Vol. 56. —
P. 513.
7. Lockhart R. Z., Elkind М. М., Moses W. В. II J. nat. Cancer Inst. — 1961, —Vol. 27.— P. 1393.
8. Phillips R. A., Tolmach L. J. II Int. J. Radiat. Biol.— 1964.— Vol. 8. —P. 569.
9. Puck Т. Т., Marcus P. J., Ciecura S. I. II J. exp. Med.— 1956. — Vol. 3, N 2 — P. 273.
Поступила 11.05.95 // Submitted 11.05.95
demonstrated a complex reaction resulting in population rearrangement. There are changes in cell complex generation observed in the control (culture without irradiation) too.
A cell complex is a conventional cell arrangement with 3 and more peripheral cells grouping around a central cell.
In the control there was a preponderance of cell complexes with average cell number 5-8 (fig. 3, a). The greatest number of cells in cell complexes (figs. 4, a, b) and medium-size cell complexes were observed on day 11.
Irradiation of HeLa monolayer culture at 5 Gy led to elevation in the number of cells involved in the cell complex generation on day 8. The number of medium-size complexes reached maximum at the same time (figs. 3, b, 4). Generation of medium-size cell complexes in cell suspension proceeded in a similar way (Fig. 3, d). The number of cells organized in cell complexes and solitary cells was about the same during the entire experiment.
Comparison of histograms in figs. 3, b, d, e shows no difference in tendency of generation of these cell structures. The cell complexes were of the same size in all three cases. While as concerns the monolayer culture the number of cells irradiated by the 0.1 Gy + + 3 min + 4.9 Gy regimen and involved in generation of cell complexes was 2-3-fold lower than in groups receiving one dose of 5 Gy. Histogram in fig.3,c is also different. The main difference as predominance of complexes with minimal cell number (3-4) was observed on day 6.
These data give evidence in support of the fact that preliminary irradiation at 0.1 Gy reduces dramatically the number of cells involved in the cell complex generation (fig. 4) as well as their size (fig. 3, c).
Conclusions.
1. Cells undergoing irradiation in the solitary state are more sensitive to radiation than contacting cells.
2. Small-dose ionizing radiation produces modifying effect on contacting cells only.
3. Preliminary irradiation of monolayer culture at 0.1 Gy reduces significantly the number of cells involved in the cell complex generation as well as the number of cells per complex.
