CC BY
223
ВЛИЯНИЕ ВЫБОРА ЧИСЛА ПОКРЫТИЙ ПРИ СЕКВЕНИРОВАНИИ НА ТОЧНОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ВАРИАНТОВ
Д. И. Борисевич, А. Ю. Красненко, И. Ф. Стеценко, Д. А. Плахина, В. В. Ильинский н
ООО «Генотек», Москва
В настоящее время технология секвенирования нового поколения (NGS) широко применяется в клинической практике. Однако до сих пор стоимость одного исследования с использованием технологии NGS остается достаточно высокой, что ограничивает широкое применение данного метода. Одним из факторов, влияющих на стоимость, является выбор числа покрытий при секвенировании, то есть количество раз, которое был отсеквенирован каждый нуклеотид. С одной стороны, уменьшение числа покрытий значительно снижает стоимость и время, затрачиваемое на исследования, с другой стороны, при уменьшении данного показателя снижается качество получаемых результатов. До сих пор не существует однозначного мнения, какое минимальное число покрытий достаточно для получения достоверного результата. Целью данного исследования было определить минимальное число покрытий, достаточное для корректного определения гетерозигот и единичных нуклеотидных вариантов (SNV). В представленной работе, используя различные биоинформатические методы, было показано, что минимальное число покрытий соответствует 12Х.
Ключевые слова: секвенирование нового поколения (NGS), число покрытий, мутация, рид, SNP, SNV
Благодарности: авторы благодарят Анну Давыдову из «Генотек» за помощь в написании статьи.
[><3 Для корреспонденции: Ильинский Валерий Владимирович
Наставнический пер., д. 17, стр. 1, г. Москва, 105120; valery@genotek.ru
Статья получена: 22.06.2017 Статья принята к печати: 27.06.2017
THE IMPACT OF SEQUENCING DEPTH ON ACCURACY OF SINGLE NUCLEOTIDE VARIANT CALLS
Borisevich DI, Krasnenko AYu, Stetsenko IF, Plakhina DA, Ilinsky VV H
Genotek, Moscow, Russia
Today, next generation sequencing (NGS) is extensively used in the research setting. However, high costs of NGS testing still prevent its routine use in clinical practice. One of the factors affecting the cost of sequencing is the number of reads per site, i.e. the number of times each nucleotide gets sequenced. On the one hand, lower coverage makes the whole process much faster and less time-consuming. On the other hand, it results in poor data quality. No unanimous opinion has been reached yet as to what minimum depth of coverage can produce reliable results. The aim of this study was to determine the minimum number of reads sufficient for accurate base calling of heterozygous and single nucleotide variants (SNV). Using bioinformatics methods, we demonstrate that accuracy can be achieved at a minimum depth of 12X.
Keywords: Next-generation sequencing (NGS), sequencing depth, mutation, read, SNP, SNV
Acknowledgements: authors thank Anna Davydova of Genotek for her helpful comments.
[X] Correspondence should be addressed: Valery Ilinsky
per. Nastavnichesky, d. 17, str. 1, Moscow, Russia, 105120; valery@genotek.ru
Recieved: 22.06.2017 Accepted: 27.06.2017
Участки генома, кодирующие белки, составляют лишь 1 % всего человеческого генома, но именно в них сосредоточены 85 % мутаций, определяющих возникновнеие и развитие различных заболеваний [1]. В связи с этим экзомное секвенирование,а также секвенирование с использованием специально разработанных панелей для обогащения, фокусирующихся на тех участках экзонов, в которых могут быть обнаружены значимые мутации, нашли наибольшее применение в клинической практике [2].
Один из важнейших вопросов клинического использования экзомного секвенирования — выбор адекватного числа покрытий (количество раз, которое был отсеквени-рован каждый нуклеотид; обычно обозначается как 10x, 20x, 50x и т. д.) [3]. Именно оно позволяет выявить возмож-
ные ошибки считывания нуклеотидов на машине и определить истинные позиции в геноме. При этом мы сталкиваемся с двумя разнонаправленными факторами, влияющими на определение количества покрытий. Первый фактор — это время и стоимость секвенирования, которые увеличиваются с ростом числа покрытий. Второй фактор — статистический: какое минимальное количество покрытий позволяет свести до уровня допустимой погрешности ошибку при выявлении мутаций, причем по этому фактору не существует единого мнения. С чем это связано?
Используя технологию коротких прочтений Illumina, Bentley и соавт. в 2008 г. определили, что почти все единичные нуклеотидные варианты (SNV) в гомозиготе обнаруживаются при покрытии 15x, тогда как для обнаружения
SNV в гетерозиготе необходимо покрытие 33x [4]. Основываясь на полученных данных, в большинстве последующих работ, связанных с обнаружением SNV, авторы использовали значение покрытия 33x в качестве стандартного [5, 6]. В 2011 г. Ajay и соавт. опубликовали статью, в которой показали, что для определения 95 % SNV, а также коротких инсерций и делеций необходимо устанавливать покрытие 50x. Однако последующие эксперименты с использованием усовершенствованных реагентов и программного обеспечения для обработки данных позволили авторам получить такой же результат, снизив значение покрытия до 35x [7]. В 2014 г. вышла статья Fang и соавт., в которой было найдено, что для обнаружения 95 % вставок и делеций необходимо устанавливать покрытие 60x [8].
Разброс в числе покрытий, представленный выше, показывает, что говорить об универсальности этого значения в настоящее время становится все сложнее, поскольку количество прочтений одного и ого же участка для обнаружения вариантов напрямую зависит от качества прочтения этого участка. На качество прочтения влияет не только технология секвенирования, используемые реагенты, но также и подготовка образца. Например, трудности амплификации GC-богатых участков при проведении по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) приводят к ухудшению качества прочтения и, как следствие, к необходимости увеличения числа покрытий. В настоящее время существует химия для ПЦР, позволяющая улучшить качество реакции и тем самым дальнейшее качество прочтения при секвенировании. В 2013 г. Meynert и соавт. определили, что для обнаружения 95 % SNP требуется покрытие от 20x до 46x в зависимости от используемой химии [9]. Этими же авторами в 2014 г. было обнаружено, что для детекции 95 % SNP достаточной глубиной покрытия является 14 ридов [10]. Кроме того, Li и соавт. показали, что глубина покрытия также зависит и от количества индивидуальных образцов, используемых при секвенировании [11]. Так, при обнаружении мутации, встречающейся с частотой менее 0,2 %, секвенирование 3 000 индивидуальных образцов с покрытием 4x дает аналогичный результат, что и секвенирование менее 2 000 индивидуальных образцов при покрытии 30x. Таким образом, мы видим, что факторов больше, чем кажется на первый взгляд, и количество покрытий может быть эффективно уменьшено за счет ряда деталей при проведении исследования и исходя из его конкретных целей.
В представленной работе показано, что при использовании панели для обогащения Genotek01 минимальное покрытие, достаточное для корректного определения ге-терозигот и SNV, соответствует 12x, при этом расхождение результатов секвенирования и результатов валидирования по методу Сэнгера составляет 0,5 %.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение ДНК, приготовление и секвенирование ДНК-библиотек
ДНК выделялась из цельной венозной крови, полученной от пациентов, страдающих наследственными заболеваниями, с помощью набора QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия). Контроль качества геномной ДНК проводили с помощью агарозного гель-электрофореза. Важным показателем было отсутствие деградации ДНК и загрязнения РНК. Измерение концентрации выделенной ДНК проводили на приборе Qubit 3.0 Fluorometer (Life Technologies,
США). ДНК-библиотеки готовили с помощью набора NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, США) с использованием адаптеров для секвени-рования на платформе Illumina, согласно протоколу производителя. Двойное баркодирование выполнялось с помощью ПЦР с набором NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 1) той же фирмы. Контроль качества полученных библиотек фрагментов ДНК был проведен с помощью Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США). Для таргетного обогащения кодирующих регионов генома использовался набор MYbaits (MYcroarray, США). Секвенирование проводилось на геномном анализаторе HiSeq 2500 System (Illumina, США) методом парных прочтений длиной 100 нуклеотидов с использованием наборов HiSeq Rapid PE Cluster Kit v2 и HiSeq Rapid SBS Kit v2 (Illumina) по протоколу производителя.
Секвенирование по Сэнгеру
Для проведения процедуры мечения ампликонов флуорес-центыми метками использовали наборы BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, США) по протоколу производителя. Секвенирование по Сэнгеру проводилось на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) по протоколу производителя.
Биоинформатический анализ
Полученные чтения выравнивали на референсный геном hg19 с помощью программы BWA. Дедупликацию ридов выполняли командой rmdup в SAMtools, коллинг (variant calling) осуществляли с помощью пакета GATK (Genome Analysis ToolKit). Было обнаружено 89 мутаций: 10 гомо- и гемизигот, 79 гетерозигот; 80 точечных мутаций (SNP) и 9 коротких инсерций и делеций (инделов). Были также определены генотипы в регионах в 200 нуклеотидов влево и вправо от мутации. Все позиции из регионов, проанализированных в ходе анализа секвенирования, были валидиро-ваны с использованием секвенирования по Сэнгеру, которое считается золотым стандартом для детекции коротких мутаций. Хроматограммы были обработаны единообразно. Коллинг мутаций из хроматограмм был осуществлен с помощью собственного ПО, разработанного «Генотек» на основе BioPython и пакетов R: sangerseqR, seqinr, Biostrings и Rsubread. Нами было проведено сравнение генотипов, полученных методом высокопроизводительного секвени-рования (NGS), с результатами секвенирования по Сэнгеру и рассчитаны чувствительность и специфичность.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Валидация мутаций секвенированием по Сэнгеру
Секвенированием по Сэнгеру не были подтверждены 15 из 89 обнаруженных с помощью коллинга мутаций, т. е. они или имели другой генотип, чем был определен секвенированием, или отсутствовали. При этом 8 из 15 неподтвержденных мутаций имели гетерозиготный генотип, в то время как валидация по Сэнгеру определила наличие гомозиготной мутации. Стоит отметить, что в данном случае гете-розигота по данным NGS была поддержана только одним ридом с референсным аллелем (на рис. 1 кластер мутаций в правом нижнем углу графика).
♦ ♦
♦
*<\
♦ ■ ♦ ■
0,2 0,4 0,6 0,8 1
Доля ридов, поддерживающих референсный аллель
♦ Валидированные мутации
■ Невалидированные мутации
Рис. 1. Распределение валидированных и невалидированных Сэнгером мутаций по покрытию и доле ридов, поддерживающей альтернативный аллель. Одной точке может соответствовать более одной мутации
Симулирование различного покрытия
Для определения минимального порога секвенирова-ния многокоратно симулировали понижение покрытия (bootstrap) для каждой из доступных мутаций и окружающего их региона, а также был проведен коллинг мутаций в таких данных. Частоту ошибок коллинга оценивали, используя позиции, которые в изучаемых образцах были подтверждены секвенированием по Сэнгеру как имеющие генотип референсных гомозигот.
Оценка качества секвенирования возможна с помощью метрики Phred quality score (Q score), выдаваемой секвена-тором для каждого нуклеотида [12]. Однако данное качество является лишь оценкой точности секвенирования и
. CO OJCO CO^TCOOJCO-СО СО ГЧ Q СЮ СЮ CD СО
Доля ридов, поддерживающих альтернативный аллель
Рис. 2. Кумулятивное распределение доли образцов, имеющих долю ридов, поддерживающих альтернативный аллель X или менее
не дает надежных значений для имеющихся данных. Мы проверяли, совпадает ли каждый имеющийся рид, перекрывающий такую позицию, по генотипу с референсным, и если находили отличие, то считали это ошибкой коллинга.
Были проанализированы 372 443 нуклеотида. Из них 276 были нуклеотидами, отличающимися от референсно-го, а остальные совпадали с ним. Таким образом, частота ошибок составила 0,0741 %, что эквивалентно примерно Q31 по Phred quality score.
Для 69 позиций, в которых имелись подтвержденные гетерозиготные мутации, мы оценили распределение доли ридов, поддерживающих альтернативный аллель (рис. 2).
Используя полученное распределение ридов из гетеро-зиготы и частоту ошибок коллинга, была рассчитана частота возникновения комбинаций для различных покрытий от 2x до 50x для различного числа ридов от 0 до максимально возможного, поддерживающих альтернативный аллель. Полученные частоты применили для расчета частоты двух типов ошибок: определение гетерозиготной позиции как
Варьирование числа и доли ридов для отсечки референсных и альтернативных гомозигот
5
0
Число ошибочных коллов на 12Мб библиотеке
мин.поддержка покрытие --> 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
> 2 6 19 39 65 98 137 183 236 294 360 432 510 595 687 784 889 999 1116 1240 1370
> 3 0 0 0 0 0 0 1 1 1 2 2 3 3 4 5 6
> 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
> 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
> 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
> 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
> 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
> 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
> 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Число обнаруженных коллов 0/1 из 1000
Порог гетерозигот 0,9 > 2 0 375 625 782 978 994 998 1000 1000 1000 1000 1000 1000
> 3 0 250 469 640 765 851 908 934 962 978 987 993 996 998 999 999 1000 1000 1000
> 4 -1 157 328 492 633 744 817 882 924 952 970 982 989 994 996 998 999 999
> 5 0 93 219 359 498 612 721 803 865 909 941 962 975 985 990 994 996
> 6 0 55 141 252 366 495 610 707 787 849 895 928 952 968 979 987
> 7 0 31 88 161 269 384 498 604 696 773 834 881 916 942 961
> 8 0 18 44 108 191 289 394 500 598 685 760 820 868 905
> 9 0 0 28 70 131 211 304 402 500 593 676 748 808
> 10 0 1 16 44 89 151 227 315 407 500 588 668
Порог гетерозигот 0,8 > 2 375 625 626 781 875 934 962 978 986 992 983 989 994 996 994 996
> 3 0 250 313 546 710 820 890 890 935 962 977 987 979 987 993 995 998 994 996
> 4 0 1 234 437 602 726 773 855 908 942 964 965 978 988 992 996 993 995
> 5 0 -1 164 328 480 568 694 787 855 903 924 951 969 981 988 988 992
> 6 0 0 110 234 322 468 594 697 781 832 884 922 948 966 973 983
> 7 0 0 70 117 242 368 488 598 679 762 828 877 914 936 957
> 8 0 0 0 81 175 279 388 483 587 679 756 818 862 901
> 9 0 0 1 54 121 205 287 391 494 589 674 742 804
> 10 0 0 0 34 83 134 216 309 403 498 582 664
Порог гетерозигот 0,7 > 2 375 375 626 781 711 821 890 817 881 924 951 909 941 961 929 951 969 942 960
> 3 0 313 546 546 711 820 773 854 908 942 904 937 959 928 950 969 942 960
> 4 0 1 234 273 493 656 656 774 854 907 881 923 950 923 947 967 941 959
> 5 0 0 0 219 410 451 613 733 820 820 882 923 904 936 959 936 956
> 6 0 0 1 164 205 387 540 662 698 790 856 857 903 937 921 947
> 7 0 0 0 0 161 314 453 515 637 734 763 832 885 884 921
> 8 0 0 0 0 121 244 305 441 559 614 711 789 810 865
> 9 0 0 0 0 86 122 245 363 429 544 645 690 768
> 10 0 0 0 0 0 92 188 244 358 469 530 628
Число обнаруженных коллов 1/1 при настоящем генотипе 0/1 на 1000
> 0,9 13 5 4 9 8
> 0,8 9 6 5 90 51 32 Т7 23 17 56 42 33 26 21 47 38 32 27 24 42 37
> 0,7 9 6 189 90 51 114 78 170 125 94 73 130 104 84 134 111 93 136 116
референсной гомозиготы; и определение гетерозиготной позиции как альтернативной гомозиготы при различных порогах отсечки референсных и альтернативных гомозигот.
Для отсечки референсных гомозигот варьировали фиксированное число ридов (от 2 до 10). Для отсечки альтернативных гомозигот варьировали долю ридов, поддерживающих альтернативный аллель, между 70, 80 и 90 % (таблица).
Установлено, что для коротких мутаций (БЫР и инделов) точность метода достигает 99,7 %, чувствительность — 98 % при покрытии в точке 12х. Меньшее покрытие приводит к значительному снижению чувствительности в сигмо-идном характере и поэтому не может быть рекомендовано.
Для планирования эксперимента в лаборатории важно знать, с каким средним покрытием нужно секвенировать образец, чтобы таргетные регионы были покрыты на 12х. Для расчета этой величины мы построили корреляцию между средним покрытием образца и долей таргетного региона, покрытого 12 ридами (рис. 3).
Было обнаружено, что для покрытия таргетных регионов не менее чем на 12х на 90 % и более необходимо минимум 40х среднее покрытие дедуплицированными ридами.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Секвенированием по Сэнгеру не удалось подтвердить 15 из 89 мутаций, при этом 8 из 15 неподтвержденных мутаций имели гомозиготный, а не гетерозиготный генотип. Наличие данных мутаций определяется моделью ошибок GATK, программой, позволяющей получить набор вариантов в исследуемом геноме, которая во время коллинга по-разному трактует одиночные риды с нереференсным и референсным аллелями. Дело в том, что в программе GATK используется модель «уверенности в референсе» (reference confidence model) в сочетании с когортным анализом [13, 14]. Поэтому в случае получения одиночного рида, совпадающего с нереференсным аллелем, GATK считает варианты нуклеотидов в данном риде ошибкой
секвенирования и не учитывает их при расчете генотипа. А в случае вариантов, найденных в одиночном риде, совпадающем с референсным аллелем, она считает ошибку маловероятной и выдает гетерозиготный (а не гомозиготный) генотип. Кроме того, большинство мутаций, которые не были подтверждены секвенированием по Сэнгеру, имели низкое покрытие (< 10x). Полученные результаты подтверждают, что для корректного коллинга мутаций необходимо секвенирование с достаточно большим покрытием, чтобы одиночные ошибки секвенирования не искажали результаты [15].
Необходимое покрытие в точке является вероятностной величиной и может быть рассчитано с достоверной точностью. Нами было показано, что частота ошибок в результатах, получаемых с использованием HiSeq 2500 System, соответствует погрешности прибора, и рассчитано минимально необходимое покрытие в точке для практического применения — 12x. Эта величина меньше в сравнении с результатами Bentley и соавт. [4]. Данное улучшение может быть вызвано меньшим числом ошибок за счет использования усовершенствованного прибора
100.
fo о
2 о
90 80 70 60 50 40 30 20 10
♦ ♦
10
100
Среднее покрытие таргетных регионов
Рис. 3. Доля таргетных регионов, покрытых 12х, в зависимости от среднего покрытия таргетных регионов. Каждая точка соответствует одному образцу
0
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
1506 1649 1798 1954 2115 2284 2458 2639 2826 3020 3219 3426 3638 3857 4082 4313 4550 4794
7 8 9 11 12 14 15 17 19 21 23 26 28 31 34 37 40 43 46 50 54 58 62 67 71 76 81 86 92
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
998 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
992 995 997 998 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
974 983 989 993 995 997 998 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
933 953 968 978 986 990 994 996 997 998 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
857 895 924 946 962 974 982 988 992 995 996 998 999 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
738 798 846 885 916 939 956 969 979 985 990 993 995 997 998 999 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
998 999 999 998 999 999 1000 1000 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
998 999 999 998 999 999 1000 1000 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
998 999 999 998 999 999 1000 1000 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
996 998 998 998 999 999 1000 1000 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
990 994 996 996 998 998 1000 1000 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
972 982 988 991 994 996 998 999 998 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
931 952 967 976 985 989 994 996 996 998 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
855 894 923 944 961 973 982 988 991 995 996 998 999 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
736 797 845 883 915 938 956 969 978 985 990 993 995 997 998 999 999 999 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
974 983 967 979 986 973 983 988 979 986 990 994 988 992 995 990 993 996 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
974 983 967 979 986 973 983 988 979 986 990 994 988 992 995 990 993 996 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
974 983 967 979 986 973 983 988 979 986 990 994 988 992 995 990 993 996 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
972 982 966 979 986 973 983 988 979 986 990 994 988 992 995 990 993 996 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
966 978 964 977 985 972 983 988 979 986 990 994 988 992 995 990 993 996 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
948 966 956 972 981 970 981 987 978 986 990 994 988 992 995 990 993 996 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
907 936 935 957 972 963 977 984 976 984 989 993 988 992 995 990 993 996 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
831 878 891 925 948 947 965 976 971 981 986 992 987 991 994 990 993 996 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
712 781 813 864 902 912 939 957 958 971 980 987 983 989 993 989 992 995 992 994 996 997 996 997 998 997 997 999 997
8 8 8 8
32 28 25 40 35 32 29 26 38 35 32 29 27 37 34 31 29 27 36 34 31 29 27 35 33 31 29 27 34
100 86 120 105 93 123 109 98 126 113 102 92 116 105 96 118 108 100 120 111 103 95 113 105 98 115 108 100 117
и новых реагентов для секвенирования. Более точные современные методы биоинформатики также позволяют увереннее фильтровать ошибки секвенирования без потери чувствительности.
ВЫВОДЫ
Нами было показано, что для достижения не менее чем 90 % покрытия таргетных регионов на 12x или более, не-
Литература
1. Rabbani B, Tekin M, Mahdieh N. The promise of whole-exome sequencing in medical genetics. J Hum Genet. 2014; 59 (1): 5-15.
2. de Bruin C, Dauber A. Insights from exome sequencing for endocrine disorders. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11 (8): 455-64.
3. Sims D, Sudbery I, Ilott NE, Heger A, Ponting CP. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 2014; 15 (2): 121-32.
4. Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, Smith GP, Milton J, Brown CJ et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 2008; 56 (7218): 53-9.
5. Ahn SM, Kim TH, Lee S, Kim D, Ghang H, Kim DS et al. The first Korean genome sequence and analysis: full genome sequencing for a socio-ethnic group. Genome Res. 2009; 19 (9): 1622-9.
6. Wang J, Wang W, Li R, Li Y, Tian G, Goodman L et al. The diploid genome sequence of an Asian individual. Nature. 2008; 456 (7218): 60-5.
7. Ajay SS, Parker SC J, Abaan HO, Fuentes Fajardo KV, Margulies EH. Accurate and comprehensive sequencing of personal genomes. Genome Res. 2011; 21 (9): 1498-1505.
8. Fang H, Wu Y, Narzisi G, O'Rawe JA, Barron LT, Rosenbaum J et al. Reducing INDEL calling errors in whole genome and exome sequencing data. Genome Med. 2014; 6 (10): 89.
References
1. Rabbani B, Tekin M, Mahdieh N. The promise of whole-exome sequencing in medical genetics. J Hum Genet. 2014; 59 (1): 5-15.
2. de Bruin C, Dauber A. Insights from exome sequencing for endocrine disorders. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11 (8): 455-64.
3. Sims D, Sudbery I, Ilott NE, Heger A, Ponting CP. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 2014; 15 (2): 121-32.
4. Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, Smith GP, Milton J, Brown CJ et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 2008; 56 (7218): 53-9.
5. Ahn SM, Kim TH, Lee S, Kim D, Ghang H, Kim DS et al. The first Korean genome sequence and analysis: full genome sequencing for a socio-ethnic group. Genome Res. 2009; 19 (9): 1622-9.
6. Wang J, Wang W, Li R, Li Y, Tian G, Goodman L et al. The diploid genome sequence of an Asian individual. Nature. 2008; 456 (7218): 60-5.
7. Ajay SS, Parker SC J, Abaan HO, Fuentes Fajardo KV, Margulies EH. Accurate and comprehensive sequencing of personal genomes. Genome Res. 2011; 21 (9): 1498-1505.
8. Fang H, Wu Y, Narzisi G, O'Rawe JA, Barrön LT, Rosenbaum J et al. Reducing INDEL calling errors in whole genome and exome sequencing data. Genome Med. 2014; 6 (10): 89.
обходимо получить количество данных, эквивалентное среднему покрытию таргета 40х после дедупликации. Данная величина может зависеть от используемого набора и протокола для обогащения, типа и длины ридов. К тому же в зависимости от протокола создания библиотек и получения исходного биоматериала обнаруживается разная степень дупликации при одинаковом объеме данных, что также должно быть учтено при расчете необходимого числа нуклеотидов на образец.
9. Meynert AM, Bicknell LS, Hurles ME, Jackson AP, Taylor MS. Quantifying single nucleotide variant detection sensitivity in exome sequencing. BMC Bioinformatics. 2013; 14: 195.
10. Meynert AM, Ansari M, Fitzpatrick DR, Taylor MS. Variant detection sensitivity and biases in whole genome and exome sequencing. BMC Bioinformatics. 2014; 19 (15): 247.
11. Li Y, Sidore C, Kang HM, Boehnke M, Abecasis GR. Low-coverage sequencing: implications for design of complex trait association studies. Genome Res. 2011; 21 (6): 940-51.
12. Illumina. Technical Note: Sequencing. Quality Scores for Next-Generation Sequencing [Internet]. [cited 2017 Jun] Available from: https://www.illumina.com/documents/products/technotes/ technote_Q-Scores.pdf
13. Clevenger J, Chavarro C, Pearl SA, Ozias-Akins P, Jackson SA. Single Nucleotide Polymorphism Identification in Polyploids: A Review, Example, and Recommendations. Mol Plant. 2015; 8 (6): 831-46.
14. McKenna A, Hanna M, Banks E, Sivachenko A, Cibulskis K, Kernytsky A et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 2010; 20 (9): 1297-303.
15. Kim K, Seong MW, Chung WH, Park SS, Leem S, Park W et al. Effect of Next-Generation Exome Sequencing Depth for Discovery of Diagnostic Variants. Genomics Inform. 2015; 13 (2): 31-9.
9. Meynert AM, Bicknell LS, Hurles ME, Jackson AP, Taylor MS. Quantifying single nucleotide variant detection sensitivity in exome sequencing. BMC Bioinformatics. 2013; 14: 195.
10. Meynert AM, Ansari M, Fitzpatrick DR, Taylor MS. Variant detection sensitivity and biases in whole genome and exome sequencing. BMC Bioinformatics. 2014; 19 (15): 247.
11. Li Y, Sidore C, Kang HM, Boehnke M, Abecasis GR. Low-coverage sequencing: implications for design of complex trait association studies. Genome Res. 2011; 21 (6): 940-51.
12. Illumina. Technical Note: Sequencing. Quality Scores for Next-Generation Sequencing [Internet]. [cited 2017 Jun] Available from: https://www.illumina.com/documents/products/technotes/ technote_Q-Scores.pdf
13. Clevenger J, Chavarro C, Pearl SA, Ozias-Akins P, Jackson SA. Single Nucleotide Polymorphism Identification in Polyploids: A Review, Example, and Recommendations. Mol Plant. 2015; 8 (6): 831-46.
14. McKenna A, Hanna M, Banks E, Sivachenko A, Cibulskis K, Kernytsky A et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 2010; 20 (9): 1297-303.
15. Kim K, Seong MW, Chung WH, Park SS, Leem S, Park W et al. Effect of Next-Generation Exome Sequencing Depth for Discovery of Diagnostic Variants. Genomics Inform. 2015; 13 (2): 31-9.
