Влияние вторично активного транспорта на содержание цитокининов в побегах и корнях растений пшеницы в норме и после действия теплового шока Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ISSN 1998-4812

449

раздел БИОЛОГИЯ

УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ ВТОРИЧНО АКТИВНОГО ТРАНСПОРТА НА СОДЕРЖАНИЕ ЦИТОКИНИНОВ В ПОБЕГАХ И КОРНЯХ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ В НОРМЕ И ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ТЕПЛОВОГО ШОКА

© М. А. Дедова , Л. Б. Высоцкая , Г. Р. Кудоярова , С. Ю. Веселов *

1Институт биологии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 69.

2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Тел.: +7 (347) 273 67 78.

E-mail: respectableman@yandex.ru

При воздействии теплового шока на растения табака зарегистрировано накопление ци-токининов в корнях, преимущественно в форме рибозида цитокинина. Ингибирование активного поглощения гормонов под влиянием добавления в прикорневую среду протонофора снижало уровень накопления цитокининов в корнях и нивелировало различия по этому показателю между непрогретыми и подвергнутыми тепловому стрессу растениями. При этом возрастало содержание цитокининов в побегах растений, что указывает на роль активного поглощения гормонов из апопласта клетками корней в их задержке в корнях и ограничении оттока в побег по ксилемным сосудам. Нивелирование под влиянием протонофора различий по содержанию цитокининов между непрогретыми и подвергнутыми тепловому стрессу растениями, свидетельствует о том, что их накопление в корнях является следствием активации принагреваниипоглощения этих гормонов из апопластаклетками корней, что снижает загрузку цитокининов в ксилему и их доставку в побег.

Ключевые слова: Triticum durum Desf, засоление, цитокинины, карбонил-цианид-м-хлор-фенилгидразон, вторично активный транспорт.

Введение

Поступление цитокининов из корней с ксилемным соком способно повлиять на активность процессов, протекающих в побеге. При ряде стрессовых воздействий (дефицит макроэлементов [1] и воды [2], засоление [3] и тепловой шок [4]) было зарегистрировано снижение концентрации цитоки-нинов в ксилемном соке и их притока из корней, что сопровождалось ингибированием роста листьев [2] и их преждевременным старением [3, 4]. Тот факт, что эти отрицательные последствия стрессовых воздействий удавалось нивелировать, обрабатывая листья экзогенными цитокининами [4], указывало на роль цитокининов в регуляции роста и предотвращении старения листьев растений. В ряде экспериментов была убедительно продемонстрирована решающая роль корневых цитокининов в индукции экспрессии в листьях ряда генов, участвующих в ответе растений на добавление нитратов в питательную среду [5]. На основании этих и других подобных наблюдений сформировалась концепция о сигнальной функции корневых цитокини-нов, что объясняет интерес к изучению механизмов, обеспечивающих регуляцию притока цитоки-нинов из корней. Основное внимание в этом плане уделялось метаболизму цитокининов в корнях (их синтезу [5] и распаду [6]). Вместе с тем, при действии засоления на растения томатов одновременно со снижением концентрации цитокининов в кси-лемном соке и листьях было выявлено их накопление в корнях [3]. Эти результаты указывали на то, что уровень экспорта цитокининов может зависеть не только от их метаболизма, но от неких процес-

сов, способных повлиять непосредственно на транспорт цитокининов из корней в побег. В клеточных мембранах было выявлено присутствие переносчиков, способных обеспечивать активное поглощение цитокинининов против градиента их концентрации как в форме свободных азотистых оснований [7], так и рибозидов [8]. Ранее нами было показано, что ингибирование вторично активного трансмембранного переноса с помощью прото-нофора карбонилцианид-мета-хлорфенилгидразона (КЦХФ) одновременно снижает накопление цитокининов в клетках корней и повышает их отток в побег растений пшеницы [9].

Целью данной работы была проверка предположения о том, что снижение оттока цитокининов из корней при стрессовых воздействиях связано с активацией их поглощения из апопласта клетками корней и, как следствие, - со снижением уровня этих гормонов в апопласте, по которому идет загрузка веществ в ксилемные сосуды. В качестве стрессового фактора был выбран тепловой шок, поскольку ранее нами было показано, что при его многократном воздействии происходит накопление цитокининов в корнях и снижение их содержания в побегах растений табака [10]. Для достижения поставленной цели мы оценили влияние протонофора на уровень цитокининов в побегах и корнях подвергнутых тепловому шоку и непрогретых растений табака.

Материалы и методы

Растения табака выращивали в отдельных сосудах с песчаной почвой, пропитанной 100%-ным раствором Хогланда-Арнона, при 14-часовом све-

* автор, ответственный за переписку

450

БИОЛОГИЯ

товом дне, освещенности 16-18 клк (используя лампы ДРЛФ-400 и ДНАТ-400) и температуре 26/18 (день/ночь)°С. Ежедневно осуществляли полив, поддерживая влажность почвы 60-70% от полной влагоемкости. Через день всем растениям давали корневую подкормку в виде равных объемов 100% раствора Хогланда-Арнона. Тотальную термообработку целого растения продолжительностью 2 ч проводили в термостате при 40 °С один раз в сутки в одно и то же время в течение двух дней с момента появления 4-го листа. В качестве контроля служили растения, которые находились в тех же условиях произрастания, но не подвергались нагреванию (в темном шкафу). Сразу после термообработки в почву вносили раствор КЦХФ до конечной концентрации 10 мкМ, в горшки необработанных протонофором растений вносили равный объем воды. В конце эксперимента через 40 мин после начала воздействия ионофора фиксировали образцы в жидком азоте для оценки содержания в них цитокининов. Определение содержания фито-гормонов после хроматографического разделения проводили с помощью ИФА [9].

Результаты и их обсуждение

Сравнение уровня разных форм цитокининов в побегах и корнях растений табака показало, что наиболее высоким в них был уровень рибозида зеа-тина (рис. 1 и 2). Содержаниенуклеотида зеатина было крайне низким в корнях (по сравнению с остальными производными зеатина) и, хотя его доляв побегах былавыше, чем в корнях, все же оставалось на минимальном уровне по сравнению с остальными цитокининами.

15 12 9 6 3 0

Г

без КЦХФ | КЦХФ+ без нагрева

Л,

без КЦХФ | КЦХФ+ нагрев

Рис. 1. Содержание цитокининов в корнях через 40 мин после двухчасового прогрева растений табака при 40 °С (сразу после термообработки в почву вносили раствор КЦХФ до конечной концентрации почвенного раствора 10 мкМ). З - зеатин, ЗР - зеатин рибозид, ЗР - зеатин нуклеотид.

Наиболее заметное отличие растений, испытавших воздействие тепловых шоков, по сравнению с контролем(непрогретыми растениями), заключалось в более высоком уровне цитокининов в корнях (рис. 1). Различия по сравнению с контролем были

достоверны в случае рибозида зеатина (р<0.05, Т-тест) и определяли более высокий общий уровень цитокининов в корняхпрогретых растений. В наших экспериментах, в отличие от ранее опубликованных нами результатов [10], не были зарегистрированы различия между контрольными и прогретыми растениями по содержанию цитокининов в побегах (рис. 2). Это можно объяснить тем, что воздействия теплового шока повторялись в настоящих опытах всего 2 раза (в отличие от 6-кратных повторений в предыдущих опытах).

4

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

□ ЗН

□ ЗР

□ З

д,

т

Т

Л

х

без КЦХФ | КЦХФ+ без нагрева

без КЦХФ | КЦХФ+ нагрев

Рис. 2. Содержание цитокининов в побегах через 40 мин после двухчасового прогрева растений табака при 40 °С (сразу после термообработки в почву вносили раствор КЦХФ до конечной концентрации почвенного раствора 10 мкМ). З - зеатин, ЗР - зеатин рибозид, ЗР - зеатин нуклеотид.

Ингибирование вторично активного трансмембранного переноса путем введения в прикорневую среду протонофора снижало уровень накопления цитокининов в корнях (рис. 1). Это снижение было сильнее выражено у растений, подвергнутых действию теплового шока, в результате чего,на фоне ингибирования активного поглощения цитоки-нинов клетками не прогревание не влияло на содержание цитокининов в корнях. В побегах обработка растений протонофором приводила к обратному эффекту, т.е. повышению уровня цитокининов. (рис. 2). Таким образом, у растений табака мы зарегистрировали ту же закономерность, которую раньше обнаружили у растений пшеницы [10]: ин-гибирование активного поглощения цитокининов в корнях растений, обработанных протонофором, не только снижает уровень накопления цитокининов в корнях, но и повышает его уровень в побеге. Таким образом, механизм ограничения оттока цитокини-нов в побег через их активныйзахват клетками корней, по всей видимости, работает не только у однодольных, но и двудольных растений.

У растений были обнаружены переносчики как свободных азотистых оснований, так и их рибозидов [7, 8]. У табака в наших опытах наиболее высоким было содержание рибозида зеатина. В корнях более существенными были также колебания этой формы цитокининов как при воздействии теплового шока,

ISSN 1998-4812

Вестник Башкирского университета. 2014. Т. 19. №2

451

так и при обработке растений протонофором. Это позволяет предполагать, что именно эта форма ци-токининов транспортируется, что соответствует данным литературы [8]. Вместе с тем, в побегах под влиянием обработки протонофором в наибольшей степени возрастало содержание зеатина (почти в 2.5 раза по сравнению с необработанными протонофо-ром непрогретыми растениями).

Представляет интерес то, что содержание ци-токининов в корнях снижалось под влиянием про-тоноформа сильнее, чем возрастало содержание этих гормонов в побегах. Так у непогретых растений суммарное содержание цитокининов в корнях снижалось примерно на 4 нг под влиянием КЦХФ, и при этом в побеге оно возрастало лишь на 1.5 нг. У прогретых растений различия между убылью цитокининов в корнях и прибавкой - в побеге под влиянием протонофора былиеще более значительными, (убыль в корнях - 7.5 нг и прибавка в побеге - 1 нг). По-видимому, происходила потеря цитоки-нинов в процессе их транспорта из корней в побег. Известно, что фермент цитокининоксидаза, катализирующий распад цитокининов локализован в апо-пласте [6]. Это позволяет предполагать, что приток цитокининов в побег обработанных протонофором растений снижался за счет инактивации гормонов на пути из корней в побеги по апопласту ксилемы.

Еще один интересный зарегистрированный эффект заключается в том, что потери цитокининов на пути из корней в побег были ниже, а их накопление в побеге - выше у непрогретых расте-ний.Данные литературы о том, что активность ци-токининоксидазы повышается при стрессе [6, 11], позволяет объяснить меньшие потери цитокининов у непрогретых растений более низким уровнем их деструкции в процессе транспорта по апопласту.

И, наконец, наиболее важный результат данной работы заключается в подтверждении нашей гипотезы о том, что накопление цитокининов в корнях растений при стрессе связано с повышенной способностью клеток корней активно поглощать эти гормоны. Свидетельством в пользу данной гипотезы является тот факт, что ингибирование активного трансмембранного переноса с помощью протонофора нивелировало различия между непрогретыми и подвергнутыми тепловому шоку растениями по уровню накопления цитокининов в корнях.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 13-04-00666.

ЛИТЕРАТУРА

1. Черкозьянова А.В., Высоцкая Л.Б., Веселов С.Ю., Кудоя-рова Г.Р. Гормональная регуляция соотношения массы побег/корень не связана с водным обменом при дефиците минерального питания у растений пшеницы // Физиология растений.2005 .№5 .С. 708-714.

2. Kudoyarova G.R., Vysotskaya L.B., Cherkozyanova A., Dodd I.C. Effect of partial rootzone drying on the concentration of zeatin-type cytokinins in tomato (Solanum lycopersicum L.) xy-lem sap and leaves // J. Exp. Bot.2007.V. 58.P. 161-168.

3. Albacete A., Ghanem M.E., Martinez-Andujar C., Acosta M., Sanchez-Bravo J., Martinez V., Lutts S., Dodd I.C., Perez-Alfocea F. Hormonal changes in relation to biomass partitioning and shoot growth impairment in salinised tomato (Solanum lycopersicum L.) plants// Journal of Experimental Bota-ny.2008.V. 59.P. 4119-4131.

4. Itai C., Benzioni A., Munz S. Heat stress: effects of abscisic acid and kinetin on response and recovery of tobacco leaves //Plant and Cell Physiology.1978.V.19. P. 453-459.

5. Takei K., Takahashi T., Sugiyama T., Yamaya T., Sakakibara H. Multiple routes communicating nitrogen availability from roots to shoots: a signal transduction pathway mediated by cytokinin // Journal of Experimental Botany.2002.V.53.P. 971-977.

6. Brugiere N., Jiao S.P., Hantke S., Zinselmeier C., Roessler J.A., Niu X.M., Jones R.J., Habben J.E. Cytokinin oxidase gene expression in maize is localized to the vasculature, and is induced by cytokinins, abscisic acid, and abiotic stress // Plant Physiology.2003. V. 132.P. 1228-1240.

7. Burkle L., Cedzich A., Dopke C., Stransky H., Okumoto S., Gillissen B., Kuhn K., Frommer W.B. Transport of cytokinins mediated by purine transporters of the PUP family expressed in phloem, hydrathodes, and pollen of Arabidopsis // 2003.The Plant Journal.2003.V. 34.P. 13-26.

8. Hirose N., Makita N., Yamaya T., Sakakibara H. Functional characterization and expression analysis of a gene, OsENT2, encoding an equilibrative nucleoside transporter in rice suggest a function in cytokinin transport // Plant Physiolo-gy.2005.V. 138.P. 196-206.

9. Коробова А.В., Гарипова М.И., Кудоярова Г.Р., Медведев С.С., Веселов С.Ю. Зависимость накопления цитокининов в корнях и их транспорта в побег у растений пшеницы от вторично активного транспорта // Вестник Башкирского государственного университета.2013.Т. 18.С. 1053-1056.

10. Дедова М.А., Высоцкая Л.Б., Иванов И.И., Кудоярова Г.Р. Влияние тотального и локального теплового шока на соотношение массы побега и корня у ¿pi-трансгенных растений табака // Известия Самарского научного центра Российской академии наук.2011.Т. 13.С. 136-139.

11. Vysotskaya L.B., Korobova A.V., Veselov S.Y., Dodd I.C., Kudoyarova G.R. ABA mediation of shoot cytokinin oxidase activity: assessing its impacts on cytokinin status and biomass allocation of nutrient deprived durum wheat // Functional Plant Biology.2009.V. 36.P. 66-72.

Поступила в редакцию 08.04.2014 г.

452

БИОЛОГИЯ

EFFECT OF SECODARY ACTIVE TRANSPORT ON CYTOKININ CONTENT IN SHOOTS AND ROOTS OF WHEAT PLANTS AFTER HEAT SHOCK AND UNDER NORMAL CONDITIONS

© M. A. Dedova1, L. B. Vysotskaya1, G. R. Kudoyarova1, S. Yu. Veselov2*

1Institute of Biology Ufa Research Centre of the Russian Academy of Sciences 69 Octyabrya ave., 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.

2Bashkir State University 32 Zaki Validi st., 450076 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.

Phone: +7 (347) 273 67 78.

E-mail: respectableman@yandex.ru

Phytohormones are involved in adaptation of plants to changes in environment. Level of supply of plant hormone cytokinins by roots influences shoot functions and stress-induced decline in cytokinin delivery from roots is a known effect contributing to plant adaptation (inhibition of leaf growth and allocation to root growth enabling increased ability for water uptake and decreased transpiration losses). We addressed possible importance of active cytokinin uptake by root cells in the control of cytokinin transport from roots to shoots. Cytokinin content was immunoassayed in the root extracts of tobacco plants with the help of antibodies raised against zeatin riboside after concentration of cytokinins on C-18 cartridge and their separation by means of thin layer chromatography. Effects of heat shock were investigated. Heat shock was applied by increasing air temperature up to 40 degrees of Celsius for 1 h during three days. Under heat shock there was detected accumulation of cytokinins in roots, mostly in the form of zeatin riboside. Inhibition of active uptake of hormones by addition of protonophore to the root zone decreased the level of root cytokinins and leveled off the difference between control and heat stressed plants. At the same time, cytokinin content in shoots increased indicating the role of active uptake of hormones from apoplast by root cells in limiting their outflow to the shoot through xylem vessels. Protonophore-induced leveling off the difference in root cytokinin content between control and heat-stressed plants suggests that their accumulation in roots results from activation of uptake of these hormones from apoplast by roots cells decreasing cytokinin loading into xylem.

Keywords: Triticum durum Desf, salinization, cytokinins, carbonyl-cyanide-m-chloro-phenylhydrazine, secondary active transport.

Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.

REFERENCES

1. Cherkoz'yanova A. V., Vysotskaya L. B., Veselov S. Yu., Kudoyarova G. R. Fiziologiya rastenii. 2005. No. 5. Pp. 708-714.

2. Kudoyarova G. R., Vysotskaya L. B., Cherkozyanova A., Dodd I. C. J. Exp. Bot. 2007. Vol. 58. Pp. 161-168.

3. Albacete A., Ghanem M. E. Journal of Experimental Botany. 2008. Vol. 59. Pp. 4119-4131.

4. Itai C., Benzioni A., Munz S. Plant and Cell Physiology.1978. Vol. 19. Pp. 453-459.

5. Takei K., Takahashi T., Sugiyama T., Yamaya T., Sakakibara H. Journal of Experimental Botany. 2002. Vol. 53. Pp. 971-977.

6. Brugiere N., Jiao S. P., Hantke S., Zinselmeier C., Roessler J. A., Niu X. M., Jones R. J., Habben J. E. Plant Physiology.2003. Vol. 132. Pp. 1228-1240.

7. Burkle L., Cedzich A., Dopke C., Stransky H., Okumoto S., Gillissen B., Kuhn K., Frommer W. B. 2003.The Plant Journal. 2003. Vol. 34. Pp. 13-26.

8. Hirose N., Makita N., Yamaya T., Sakakibara H. Plant Physiology. 2005. Vol. 138. Pp. 196-206.

9. Korobova A. V., Garipova M. I., Kudoyarova G. R., Medvedev S. S., Veselov S. Yu. Vestnik Bashkirskogo gosudarstvennogo universiteta. 2013. Vol. 18. Pp. 1053-1056.

10. Dedova M. A., Vysotskaya L. B., Ivanov I. I., Kudoyarova G. R. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra Rossiiskoi akademii nauk. 2011. Vol. 13. Pp. 136-139.

11. Vysotskaya L. B., Korobova A. V., Veselov S. Y., Dodd I. C., Kudoyarova G. R. Functional Plant Biology. 2009. Vol. 36. Pp. 66-72.

Received 08.04.2014.