CC BY
97
ВЛИЯНИЕ ВОДНОЙ ДИСПЕРСИИ НАНОУГЛЕРОДА ШУНГИТА НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ НОРОК
Н.Н. Тютюнник1, А.Р. Унжаков 1, Л.Б. Узенбаева 1,А.Г. Кижина 1, В.А. Илюха 1, С.Н. Сергина 1, Т.Н. Ильина 1, И.В. Баишникова 1, Е.Б. Свечкина 1, Н.Н. Рожкова 2
1Институт биологии Карельского НЦ РАН, Петрозаводск, tyutyunnik@krc.karelia.ru; 2Институт геологии Карельского НЦ РАН, Петрозаводск
Изучение влияния частиц нанометровых размеров на биологические объекты является актуальной задачей современности. Для оценки возможных биологических рисков воздействия наноматериалов на различные функциональные системы организма в настоящее время проводятся многочисленные исследования, которые в основном выполняются in vitro. Ранее показано, что шунгито-вые углеродные наночастицы способны значительно модифицировать состояние эритроцитов человека и норки, причем проявление этого действия зависит от концентрации частиц (Горюнов и др., 2009). Для комплексного изучения влияния наночастиц на физиологическое состояние организма млекопитающих in vivo удобной экспериментальной моделью является разводимая в неволе американская норка.
В качестве объектов исследования использовались стандартные темно-коричневые норки (Mustela vison Schr). Для изучения влияния водной нанодисперсии шунгитового углерода на физиологическое состояние животных было сформировано 3 группы зверей по 6 особей в каждой (контрольная и две подопытных). Животные всех групп содержались на хозяйственном рационе. Подопытным норкам однократно проводили внутримышечную инъекцию препарата: группе №1 в количестве 1 мл водной дисперсии шунгита с дозой наночастиц 0.1 мг/животное, а группе №2 с дозой - 1.0 мг/животное. Стабильные водные дисперсии наночастиц шунгитового углерода (ШУ) получали методом сонолиза порошка шунгита в воде с последующей фильтрацией и центрифугированием (Рожкова, 2006, 2011).
Биологический материал
(кровь, органы) был получен в период планового забоя животных. Определение количества эритроцитов и лейкоцитов, состав лейко-формулы, содержания гемоглобина, общего белка, активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в лейкоцитах, активности трипсина, амилазы и липазы, электрофоретиче-
ское разделение белков и изоферментов лактатдегдрогеназы (ЛДГ) проводили согласно описанным ранее методам (Берестов, 1981; Методические подходы..., 1987; Олейник и др., 1999). Для исследования интегрального состояния систем генерации и тушения активных форм кислорода (АФК) проводился хемилюминесцентный (ХМЛ) анализ (Klinger et al., 1996), спектрофотометрически измеряли активность ключевых ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД) (Misra, Fridovich, 1972) и каталазы (Bears, Sizes, 1952). Концентрацию а-токоферола в сыворотке крови и гомогенатах органов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Скурихин, Двинская, 1989).
Исследования свидетельствуют, что в конце эксперимента содержание эритроцитов, уровень гемоглобина и концентрация общего белка у подопытных зверей были в пределах доверительных границ нормы (табл.). Под влиянием дисперсии шунгитовых наночастиц во фракционном составе белка в сыворотке крови у зверей подопытной группы №2 снизился уровень гамма-глобулинов.
Препарат в дозе 0.1 и 1.0 мг/животное не оказало влияния на количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и активность ЩФ лейкоцитов. Изменения некоторых показателей, в частности, снижение общего количества лейкоцитов и повышение относительного содержания базо-филов статистически не значимы и представлены в виде тенденции. Морфологических изменений клеток крови у подопытных животных на светомикроскопическом уровне не обнаружено (табл).
Таблица.
Влияние наночастиц шунгитового углерода на гематологические и биохимические показатели крови норок, M± m
Показатели Г руппы
Контрольная Подопытная №1 Подопытная №2
Эритроциты, 1012 9,0±0,1 9,4±0,3 8,3±0,2
Лейкоциты, 109/л 8,04±1.41 7,70±1.44 5,35±0.82
Гемоглобин, г/л 169,3±2,5 183,1 ±3,2 162,4±5,5
Общий белок, г/л 91,5±0,2 81,2±2,8 83,2±2,6
Альбумины, % 44,6±1,6 42,9±2,0 41,0±6,2
Альфа- глобулины,%: 17,8±1,4 17,4± 1,6 23,8±7,2
Бета- глобулины,%: 16,6± 1,2 19,0±2,6 19,0±0,6
Гамма- глобулины,%: 21,0± 1,8 20,7±1,7 16,2±2,1
Трипсин, Е/час/мл 27,14 ± 2,72 42,14 ± 9,40 35,00 ± 1,33*
Амилаза, мг/час/мл 17,09 ± 1,67 21,76 ± 9,87 13,71 ± 1,52
Липаза, мкмоль/час/мл 7,89 ± 2,35 4,80 ± 1,54 2,31 ± 0,57*
Более чувствительными к влиянию разных концентраций дисперсии шунгита оказались пищеварительные ферменты - трипсин, липаза и амилаза (табл). Активность трипсина в сыворотке крови у норок 1-ой подопытной группы была на 55%, а у животных 2-ой - на 29% выше (р<0,05), чем в контроле (табл.). Амилолитическая активность у животных 1-ой группы увеличилась на 27%, а липолитическая, наоборот, снизилась у норок 1-й группы - в 1,6 раза, 2-й - в 3,4 раза (р<0,05).
Наибольшее влияние препарат (особенно в более высокой концентрации вещества) оказал на показатели антиоксидантной системы (АОС) и системы генерации АФК в почках животных. В этом органе отмечалось
усиление работы ферментов, генерирующих АФК, снижение активностей антиоксидантных ферментов, в частности СОД, что, по всей вероятности, вызвало уменьшение соотношения СОД/каталаза. Такие изменения могут быть результатом как повышенной генерации активных форм кислорода в данном органе, так и «отравления» фермента при усиленном неконтролируемом синтезе перекиси водорода, к которой СОД является очень чувствительной (Зенков и др., 2001). В печени более высокая доза препарата привела к уменьшению удельной активности каталазы, а обе дозы - к ослаблению работы неферментативного звена системы генерации АФК. Таким образом, функционирование систем генерации и тушения АФК в печени и почках под действием препарата можно охарактеризовать как неспецифическую реакцию на введение в организм чужеродного вещества.
Исследование содержания витамина Е (а-токоферол) в печени норок, получавших инъекцию дисперсии шунгита показало, что его концентрация в печени норок 1 и 2 групп было разнонаправленным. Если в группе 1 (доза 0,1 мг) наметилась достаточно выраженная тенденция к снижению, то во 2 группе содержание витамина не изменилось по отношению к контролю. Сопоставление действия двух доз препарата продемонстрировало, что меньшая концентрация приводят к снижению содержания токоферола в печени, изменения отсутствуют при более высокой дозе.
При сравнении изоферментных спектров ЛДГ органов у подопытных и контрольных зверей установлено, что дисперсия наночастиц шунгитового углерода не оказала достоверного влияния на изоферментные спектры ЛДГ печени и почек. Наблюдаемое незначительное повышение относительного содержания ЛДГ-5 в печени у норок из подопытной группы №2 по сравнению с контрольной может свидетельствовать о тенденции стимуляции анаэробных путей обмена.
Таким образом, установлено, что введение стабильных водных дисперсий наночастиц шунгитового
углерода в организм подопытных животных не оказало однозначного влияния на ряд морфологических и биохимических показателей крови и исследованных органов. Выявленные изменения со стороны ферментов АОС свидетельствуют о том, что применявшийся способ введения препарата, возможно, вызывает неспецифическую реакцию, сходную с аллергическими процессами (Зенков и др.,2001). Исследования, направленные на поиск оптимальных доз и способов введения наночастиц шун-гитового углерода планируется продолжить.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минэкономразвития республики Карелия (Гос. контракт № 29-07).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Берестов В. А. Лабораторные методы оценки состояния пушных зверей. Петрозаводск, 1981. 151 с.
Морфология и агрегация эритроцитов в нанодисперсиях углерода / А. С. Г орюнов, А. Г. Борисова [и др.] // Т руды КарНЦ РАН. 2009. № 3. С. 118126.
Зенков Н. К., Ланкин В. З., Меньщикова Е. Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. М. : МАИК
Наука/Интерпериодика. 2001. 343 с.
Калинин Ю. К. Экологический потенциал шунгита // Шунгиты и безопасность жизнедеятельности человека : материалы Всерос. науч.-практ. конф. Петрозаводск, 2007. С. 5-10.
Методические подходы к изучению физиологии пушных зверей. Петрозаводск, 1987. 144 с.
Олейник В.М., Свечкина Е.Б., Тютюнник Н.Н. Методические рекомендации по контролю за состоянием пищеварительной системы у хищных пушных зверей. Петрозаводск, 1999. 15 с.
Модельная система адресной доставки лекарственных веществ на основе наноалмазов / К. В. Пуртов [и др.] // Российские нанотехнологии. 2011. Т. 6, № 3-4. С. 97-102.
Рожкова Н. Н. Стабилизация водных дисперсий нанокластеров шунгито-вого углерода // Фуллерены и фуллереноподобные структуры в конденсированных средах. Минск, 2006. С. 63-68.
Рожкова Н. Н. Наноуглерод шунгитов. Петрозаводск : КарНЦ РАН, 2011. 100 с.
Скурихин В. Н., Двинская Л. М. Определение а-токоферола и ретинола в плазме крови сельскохозяйственных животных методом микроколо-ночной высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сельскохозяйственная биология. 1989. № 4. С. 127-129.
Bears R. F., Sizes I. N. A spectral method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase // J. Biol. Chem. 1952. Vol. 195, № 1. P. 133-140.
Klinger W., Karge E., Kretzschmar M., Rost M., Schulze H. P., Dargel R., Reinemann C., Rein H. Luminol-and lucigenin-amplified chemilumines-cence with rat liver microsomes. Kinetics and influence of ascorbic acid, glutathione, dimethylsulfoxide, N-t-butyl-a-phenyl-nitrone, copper-ions and a copper complex, catalase, superoxide dismutase, hexobarbital and aniline // Exp. Toxicol. Pathol. 1996. Vol. 48, № 5. Р. 447-460.
Misra H.P., Fridovich F. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247, № 10. Р. 3170-3175.
