CC BY
69
УДК 616.006.441-092.9:615.453.87
Д.А. Бодягин1, Е.Б. Исакова1, М.С. Гинс2, В.М. Бухман3, И.М. Луценко3, М.Ю. Каган4, П.Ф. Кононков2, В.К. Гинс2 ВЛИЯНИЕ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ ЛИСТЬЕВ АМАРАНТА 1НА РОСТ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ОПУХОЛИ МЫШЕЙ
1ФГБУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе» РАМН, Москва
2Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИССОК) РАСХН, Московская область 3ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва 4Лечебно-диагностический центр КМ-клиник, Москва
Контактная информация
Бухман Владимир Михайлович, д-р мед. наук, профессор, заведующий лабораторией фармакологии и токсикологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей НИИ ЭДиТО адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел.: +7 (499) 324-22-44 e-mail: bukhman@mail. ru
Статья поступила 11.04.2012, принята к печати 31.08.2012.
Резюме
5-кратное введение через рот водного экстракта, приготовленного из БАД'а «Фиточай Амарантил» (ВЭА) сопровождается торможением роста солидной лимфомы P388 у мышей. ВЭА способен усилить противоопухолевый эффект, наблюдаемый при однократной инъекции мышам низкодозового циклофосфамида.
Ключевые слова: биологически активная добавка «Фиточай Амарантил», торможение роста опухоли, однократный низкодозовый циклофосфамид.
D.A. Bodyagin1, E.B. Isakova1, M.S. Gins2, V.M. Bukhman3,1.M. Luchenko3, M.Yu. Kagan4, P.F. Kononkov2, V.K. Gins2 INFLUENCE OF A WATER EXTRACT FROM AMARANTH LEAVES ON GROWTH OF AN TRANSPLANTED TUMOR OF MICE
1FSBI «G.F. Gause Institute of New Antibiotics» RAMS, Moscow
2The All-Russian Scientific Research Institute of Selection and Seed-Growing of Vegetable Cultures of RAAS, Moscow Region
3FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow;
4The medical-diagnostic centre of Km-clinics, Moscow
Abstract
5-fold administration through the mouth of the water extract prepared from the BAA "Phytotea Amaranthyl" (WEA) is accompanied by inhibition of the growth of a solid P388 lymphoma in mice. WEA is able to enhance the antitumor effect observed after a single injection of mice with low-dose cyclophosphamide.
Key words: biologically active additive «Phytotea Amaranthyl», tumor growth inhibition, water extracts of an amaranth, a single low dose of cyclophosphamide.
Введение
Многие растения содержат большое число ингредиентов, способных проявлять противоопухолевую активность. Недавно в ВНИИССОК впервые созданы сорта амаранта овощного назначения, содержащие в листьях высококачественный растительный белок, витамины, алкалоид амарантин, микроэлементы. Изучение влияния амаранта на опухолевый рост актуально как для более полного понимания полезности питания с использованием этого овоща, так и для определения возможности использования его в качестве источника соединений, которые могут быть полезны для профилактики онкологических заболеваний и лечения онкологических пациентов. Такими средствами могут, в частности стать биологически активные добавки к пище, созданные на основе красноокрашенного амаранта Amaranthus tricolor Linn. (Amaranthus gangeticus L.) семейство Amaranthaceae.
Известно, что, начиная с 4 тысячелетия до нашей эры, овощные виды амаранта широко используются для питания и в качестве лечебного средства в странах Латинской Америки, ЮгоВосточной Азии, Индии, Китае [2]. Amaranthus tricolor Linn является одним из традиционных лекарственных растений, применяемых в народной медицине многих народов: растение широко приме-
няется для лечения меноррагии, диареи, дизентерии, геморрагического колита, кишечных кровоизлияний, кашля и бронхита, а также используется наружно в качестве смягчающих или припарок, для промывания рта, лечения изъязвлений горла и полости рта, язвенной болезни, обладает вяжущим действием [6; 7; 9]. Этанольный экстракт листьев A. Tricolor проявляет выраженную гепатопротектор-ную активность [5].
На основании многочисленных исследований нами показано, что листовая биомасса красноокра-шенных растений амаранта (Amaranthus tricolor L., селекции ВНИИССОК) содержит биологически активные вещества: краснофиолетовый пигмент ама-рантин (бетацианин), незаменимые аминокислоты, аскорбиновую кислоту, фенольные соединения, в том числе простые фенолы и фенолкарбоновые кислоты, оксикоричные кислоты, флавоноиды, конденсированные и полимерные полифенолы, пектин и д.р. [3]. Благодаря этим веществам, водные экстракты амаранта обладают бактерицидным и антимикотическим действием, влияют на устойчивость иммунной системы, стимулируют рост и развитие бифидо- и лактобактерий [4]. Водорастворимый гетерополисахарид изолирован из стеблей A. Tricolor [12]. Из этилацетат-ного экстракта листьев и семян A. tricolor были выделены галоктозилдиацилглицерины, с мощной активностью ингибиторов циклооксигеназ 1 и 2 и роста
опухолевых клеток. Эти соединения проявляют анти-пролиферативную активность в культурах клеток рака желудка (AGS), ЦНС (SF-268), толстой кишки (HCT-116), лёгкого (NCI-H460) и РМЖ (MCF-7) [8]. Добавление к диете 5, 7,5 и особенно 10 %-ного водного экстракта амаранта подавляет in vitro пролиферацию клеток рака печени (HepG2), РМЖ (MCF-7) и рака толстой кишки (CaCO-2), но не нормальных клеток (Chang Liver), а также in vivo химического гепато-канцерогенеза у крыс [11]. В связи с этим особый интерес представляет изучение противоопухолевого действия водного экстракта, полученного из БАД'а «Фиточай Амарантил», как одного, так и в сочетании с однократным введением циклофосфамида в низкой дозе (антисупрессорная обработка [13]).
Материалы и методы
Животные
Самцов мышей линии DBA/2 (D2) и гибридов (C57BL6 х DBA/2)F1 (B6D2F1) получали из питомника РАМН «Крюково». Животных содержали при естественном режиме освещения, со свободным доступом к воде и пище.
Опухоль
Использовали перевиваемый лимфобластный лейкоз P-388. Штамм поддерживали в асцитной форме серийными внутрибрюшинными пассажами на мышах линии D2. В опытах опухоль перевивали гибридам B6D2F1 под кожу правого бока по 1х106 клеток на мышь. День прививки опухоли принимали за 0.
Препараты
Водный экстракт БАД'а «Фиточай Амарантил» (ВЭА) получали путём 30-минутной экстракции в дистиллированной воде, соотношение растительного материала и воды 1 : 7. Затем проводили центрифугирование при 3 тыс. оборотах в мин. в течение 10 мин. Мышам вводили перорально надосадочную жидкость (по 0,5 мл / мышь х 5 суток). Использовали также коммерческий циклофосфамид (ЦФ).
Эксперименты
Противоопухолевую активность проверяли, вводя ВЭА по 0,5 мл через рот 1 раз в сутки, ежедневно на протяжении 5 суток. Кроме влияния самого ВЭА изучали также комбинацию однократного низко-дозового (50 мг/кг в/бр) ЦФ с последующим введением ВЭА, схемы даны в разделе «Результаты и обсуждение». В динамике следили за темпом роста опухоли, измеряя штангенциркулем три наибольших взаимно перпендикулярных диаметра. Параметр ТРО рассчитывали по формуле:
TPO(%) =
(CPMOk - CPMOo) (CPMOk)
X100.
где
СРМОк и СРМОо - средняя расчётная масса опухоли в контроле и опыте, соответственно.
Массу опухоли рассчитывали по формуле:
™ \ (а х Ь х с)
РМО( мг) =----------^-----, где
РМО - расчётная масса опухоли,
а, Ь, с - 3 наибольших взаимно перпедикулярных диаметра опухолевого узла в мм [10].
О токсичности судили по общему состоянию мышей и изменению массы тела за вычетом рассчитанной массы опухоли.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Office Excel 2003 и BioStat 2008 Professional. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стъюдента. Достоверность различий в продолжительности жизни определяли по непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова. За достоверные принимали различия при P < 0,05.
Результаты и обсуждение
Всего было поставлено 3 опыта по изучению противоопухолевой активности: в двух опытах использовали половозрелых мышей 2-3 месячного возраста и в одном эксперименте - более пожилых мышей в 5-месячном возрасте. В наших опытах ВЭА проявил активность на молодых животных и не проявил активности на пожилых животных (результаты не показаны).
Результаты опытов на молодых мышах представлены на рис. 1-2 и в табл. 1; 2 и 3. Несмотря на то, что опухоль у мышей, не получавших лечения, развивалась одинаково в обоих опытах, терапевтические эффекты несколько отличались. В первом эксперименте ВЭА вводили с 3 по 7 сутки, а во втором - с 5 по 9 сутки. Если при более раннем начале лечения наблюдалось сильное торможение темпа развития узла на месте инокуляции опухолевых клеток вплоть до 17 суток (рис. 1, табл. 1), то при более позднем начале терапии сильное торможение роста опухоли быстро ослабло, хотя и оставалось статистически достоверным, к 18 суткам (рис. 2, табл. 1). Если при раннем начале терапии наблюдалось, хотя и слабое, но статистически достоверное увеличение выживаемости, то при более позднем начале терапии ВЭА не повлиял на выживаемость мышей (табл. 3). Таким образом, можно заключить, что ВЭА при пероральном введении способен проявить противоопухолевую активность, проявляющуюся достоверным ингибированием темпа роста опухоли.
Можно предположить, что одни компоненты, содержащиеся в ВЭА, способны непосредственно влиять на выживаемость опухолевых клеток [8; 11], а другие могут влиять на противоопухолевую резистентность организма [4; 12]. Одним из приёмов, позволяющих более эффективно влиять на противоопухолевую резистентность организма, является антисупрессорная обработка, в частности - путём однократного введения низко-дозового ЦФ [13]. Как видно из представленных результатов (рис. 1 и 2, табл. 1 и 3) такая обработка приводила, в наших опытах, к резкому торможения роста опухоли и достоверному увеличению выживаемости. Введение ВЭА на фоне обработки организма ЦФ сопровождалось значительным увеличением эффекта в первом опыте.
Следует отметить, что, по непонятной причине, одинаковая обработка ЦФ значительно сильнее затормозила развитие опухоли во втором опыте, по сравнению с первым. Во втором опыте введение одного ЦФ привело к практически полному предотвращению роста лимфомы на месте инокуляции клеток лимфобластного лейкоза вплоть до 18 суток (начало гибели мышей, не получавших препараты). Кроме того, начало терапии ВЭА во втором опыте было более поздним.
А
ВРЕМЯ сутки
□ КРО □ ВЭА □ ЦФ Е1 ЦФ+ВЭА
Рис. 1. Влияние ВЭА, ЦФ и комбинации «ЦФ + ВЭА» на темп роста подкожной лимфомы, развившейся из трансплантированных клеток лимфобластного лейкоза Р388 (опыт №1):
1А: данные представлены в виде среднего + ст. ош.
КРО - контроль роста опухоли; ВЭА - водный экстракт амаранта; ЦФ - циклофосфамид. ЦФ вводили однократно в дозе 50 мг/кг в/бр в сутки 2. ВЭА вводили ежедневно по 0,5 мл через рот, с 3 по 7 сутки опыта. и, а, с - достоверное отличие по сравнению с группой КРО, ВЭА и ЦФ, соответственно.
ВРЕМЯ сутки
□ КРО □ ВЭА □ Цф 50 Е1 Цф50 + ВЭА
Рис. 2. Влияние ВЭА, ЦФ и комбинации ЦФ+ВЭА на темп роста подкожной лимфомы, развившейся из трансплантированных клеток лимфобластного лейкоза Р388 (опыт №2). ВЭА вводили ежедневно по 0,5 мл через рот, с 5 по 9 сутки опыта. Остальное - как на рис. 1.
Таблица 1
Влияние ВЭА, ЦФ и комбинации ЦФ+ВЭА на динамику роста солидной лимфомы, развившейся на месте подкожной трансплантации мышам клеток лимфобластного' лейкоза Р388________________________
Группа п РМО в мг (ТРО %) на сутки
10 14 16 17 18
Опыт №1
КРО 11 59 + 21 1507 +242 5537 + 1217
ВЭА 7 5 + 2 (92)и 106 + 31 (93)и 828 + 125 (85)и
ЦФ 6 1 + 0,1 (98)и 83 + 24 (94)и 836 + 254 (85)и
ЦФ+ВЭА 7 0,1 + 0,1 (99)и 8 + 3 (99)и,а,с 88 + 30 (97)и,а,с
Опыт №2
КРО 13 91 + 44 875 + 152 1653 + 294 2468 + 243
ВЭА 10 6 + 1 (93)с 201 + 44 (77)и,с 556 + 96 (66)и,с 1745 + 178 (29)и,с
ЦФ 10 1 + 1 (99) 1 + 0,2 (100)и,а 3 + 1 (100)и,а 7 + 2 (100)и,а
ЦФ+ВЭА 10 0 + 0 (100)а 0,4 + 0,2 (100)и,а 2 + 1 (100)и,а 3 + 1 (100)и,а
п - число животных в группе. Остальные сокращения, режим введения и дозы препаратов см. в подписях к рис. 1 и 2.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА... б7
Таблица 2
Влияние ВЭА, ЦФ и комбинации ЦФ+ВЭА на изменение массы тела (без подкожной опухоли) мышей с транс-плантированным лимфобластным лейкозом P388_____________________________________________________
n Изменение массы тела (без подкожной опухоли) в %:
10 14 16 17 18
Опыт №1
КРО 11 105 + 1 108 + 2 100 + 4*
ВЭА 7 102 + 2 108 + 3 113 + 3u
ЦФ 6 103 + 1 105 + 1 108 + 2
ЦФ+ВЭА 7 102 + 3 107 + 1 109 + 1
Опыт №2
КРО 13 116 + 2 116 + 2 121 + 2 118 + 2
ВЭА 10 106 + 1u 109 + 2u 117 + 2c 116 + 2
ЦФ 10 106 + 2u 106 + 2u 111 + 2u 111 + 2u
ЦФ+ВЭА 10 98 + 3u,c,a 98 + 2u,c,a 105 + 2u,c,a 106 + 2u,a
*4 из 11 мышей пали
Таблица 3
Влияние ВЭА, ЦФ и комбинации ЦФ+ВЭА на выживаемость мышей, которым трансплантировали под кожу клетки лимфобластного лейкоза P388 ______________________________________________________________
№ оп Группа n СПЖ Сроки гибели УПЖ
сутки сутки %
1 КРО 11 19,4 16; 17; 17; 17; 18; 20; 20; 20; 20; 22; 26
ВЭА 7 22,3 20; 21; 21; 22; 22; 23; 27* 15
ЦФ 6 22,8 22; 22; 23; 23; 23; 24* 18
ЦФ + ВЭА 7 25,6 22; 23; 26; 27; 27; 27; 27* 32
2 КРО 13 21,9 17; 21; 21; 21; 21; 21; 22; 22; 23; 23; 24; 24; 25
ВЭА 10 21,4 21; 21; 21; 21; 21; 21; 21; 22; 22; 23 -2
ЦФ 10 29,4 27; 27; 29; 29; 29; 29; 30; 30; 30; 34* 34
ЦФ + ВЭА 10 30,1 25; 26; 27; 27; 30; 30; 32; 32; 35; 37* 37
*достоверное отличие от группы КРО. Условия постановки опытов и сокращения см. в подписях к рис. 1 и 2.
Таким образом, ВЭА может быть более активен в случае предварительной антисупрессорной обработки ЦФ. Однако необходимо дальнейшее изучение, как для уточнения оптимальных условий комбинирования, так и для расшифровки механизмов, лежащих в основе усиления противоопухолевого эффекта.
На протяжении всего срока наблюдения не наблюдалось проявлений токсичности использованных препаратов. Введение ВЭА не вызывало похудания мышей (табл. 2). Наблюдающиеся небольшие различия, хотя статистически достоверные, скорее всего, связаны с влиянием на распространение лейкозного процесса.
Таким образом, ВЭА проявил при ежедневном пероральном введении достоверную противоопухолевую активность. Механизм противоопухолевой активности ВЭА требует специального изучения: он может определяться как прямым, так и опосредованным действием входящих в состав ВЭА компонентов.
При этом очень важно отметить, что изученный нами ВЭА (полученный из БАД'а) не стимулирует рост опухоли. ВЭА помимо антиоксиданта амарантина содержит в большом количестве полифенолы, в том числе флаваноиды, кверцетин, де-гидрокверцитин, рутин, которые также обладают противоопухолевым действием [4].
Можно предположить, что использование в диетах онкологических пациентов амаранта и БАД'а «фиточай Амарантил» полезно, а ВЭА является перспективным препаратом для комбинированной химиотерапии опухоли. В связи с вышесказанным представляются перспективными дальнейшие клинико-лабораторные исследования ВЭА с целью рекомендации их для использования в терапии онкологических пациентов. По результатам исследований получен патент РФ [1].
Выводы
1. Водный экстракт, приготовленный из БАД к пище «Фиточай Амарантил», не токсичен и не стимулирует роста опухоли у экспериментальных животных.
2. Водный экстракт, приготовленный из БАД к пище «Фиточай Амарантил», обладает противоопухолевой активностью: торможение роста опухоли выявлено в отношении роста трансплантированного под кожу мышам лимфобластного лейкоза Р-388.
3. Сочетанное применение водного экстракта, приготовленного из БАД к пище «Фиточай Амаран-тил», с однократной инъекцией низкодозового циклофосфамида может сопровождаться увеличением противоопухолевого эффекта.
Литература
1. Гинс М.С., Бодягин Д.А., Кононков П.Ф., Исакова Е.А., Гинс В.К., Бухман В.А. Патент РФ № 2377008 от
27.10.2009.
2. Кононков П.Ф., Гинс В.К., Гинс М.С. Амарант - перспективная культура XXI века. - М.:РУДН, 1999. -298 с.
3. Гинс М. С. Биологически активные вещества амаранта: Амарантин: свойства, механизмы действия и практическое использование. - М.:РУДН, 2002. - 183 с.
4. Кононков П.Ф., Пивоваров В.Ф., Гинс М.С, Гинс В.К. Интродукция и селекция овощных культур для создания нового поколения продуктов функционального действия. - М.:РУДН, 2008. - 170 с.
5. Al-Dosari M.S. The effectiveness of ethanolic extract of Amaranthus tricolor L.: A natural hepatoprotective agent // Am J Chin Med. - 2010. - 38(6). - P. 1051-64.
6. Devaraj V.C, Krishna B.G. Gastric antisecretory and cytoprotective effects of leaf extracts of Amaranthus tricolor Linn. in rats // Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. - 2011. - 9(9). - P. 1031-8.
7. Hussain Z., Amresh G., Singh S., Rao C.V. Antidiarrheal and antiulcer activity of Amaranthus spinosus in experi-
mental animals // Pharm Biol. - 2009. - 47(10). - P. 932-9.
8. Jayaprakasam B., Zhang Y., Nair M.G. Tumor cell proliferation and cyclooxygenase enzyme inhibitory compounds in Amaranthus tricolor // J Agric Food Chem. - 2004. - 52(23) - P. 6939-43.
9. Jayaraj A.P., Tovey F.I., Clark C.G. Possible dietary protective factors in relation to the distribution of duodenal
ulcer in India and Bangladesh // Gut. - 1980. - 21(12). - P. 1068-76.
10. Pacor S., Giacomello E., Bergamo A. et al. Antimetastatic action and lymphocyte activation by the modified ly-sozyme mpeg-lyso in mice with mca mammary carcinoma // Anticancer Res. - 1996. - 16(5A). - P. 2559-64.
11. Sani H.A., Rahmat A., IsmailM. et al. Potential anticancer effect of red spinach (Amaranthus gangeticus) extract // Asia Pac J Clin Nutr. - 2004. - 13(4). - P. 396-400.
12. Sarkar R., Nandan C.K., Mandal S. et al. Structural characterization of a heteropolysaccharide isolated from hot water extract of the stems of Amaranthus tricolor Linn. (Amaranthus gangeticus L.) // Carbohydr Res. - 2009. -344(17). - P. 2412-6.
13. Ben-Efraim S. Immunomodulating anticancer alkylating drugs: Targets and mechanisms of activity // Current Drug Targets. - 2001. - 2(2). - Р. 197-212.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
