CC BY
15© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
Г.В.Демидова, Е.П.Соколова, В.П.Зюзина, ВЛ.Рыкова, И.В.Морозова, О.Н.Подладчикова, В.И.Тынянова
ВЛИЯНИЕ ВНЕХРОМОСОМНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ НА ТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА YERSINIA PESTIS
Ростовский-на Дону противочумный институт
Цель. Выяснение роли внехромосомных элементов наследственности в проявлении токсических свойств Yersinia pestis. Материалы и методы. Работа выполнена на вакцинном штамме Y. pestis EV76 (pMTl, pCDl, pPCPl) и бесплазмидных вариантах вакцинного EV76 (рМТ1\pCDl", pPCPl) и вирулентного 231 (рМТ1\pCDl", pPCPl) штаммов Y. pestis. О присутствии функционально активной формы липополисахари-да (ЛПС) в среде инкубации бактерий судили по токсичности супернатантов клеток Y. pestis для интактных животных (модель инфекционно-токсического шока) и мышей, сенсибилизированных D-GalN. Результаты. Установлено, что 37°С культуры Y. pestis EV76, содержащие полноценный набор плазмид, высвобождают ЛПС во внешнюю среду. Бесплазмидные варианты как вакцинного, так и вирулентного штаммов Y. pestis pMTl", pCDl", pPCPl" такой способностью не обладают. Отделение ЛПС от клеточной стенки выявлено у живых бактерий возбудителя чумы. Предполагается, что этот процесс сопряжен с транслокацией белков, кодируемых плазмидами pMTl, pCDl, pPCPl, из клетки во внешнюю среду. Заключение. Впервые установлена функциональная взаимосвязь между внехромосомными элементами наследственности и токсической активностью ЛПС Y. pestis.
Журн. микробиол. 2017, № 2, С. 28-33
Ключевые слова: Yersinia pestis, плазмиды, липополисахарид, токсичность
G.V.Demidova, E.P.Sokolova, V.P.Zyuzina, V.A.Rykova, I. V.Morvzova, O.N.Podladchikova, V.I. Tynyanova
EFFECT OF EXTRACHROMOSOMAL ELEMENTS OF HEREDITY ON TOXIC PROPERTIES OF YERSINIA PESTIS
Rostov-on-Don Institute for Plague Control, Russia
Aim. Elucidation of the role of extrachromosomal elements of heredity in manifestations of toxic properties of Yersinia pestis. Materials and methods. The study was carried out in vaccine strain Y. pestis EV76 (pMTl, pCDl, pPCPl) and non-plasmid variants of vaccine EV76 (pMTl-, pCDl", pPCPl-) and virulent 231 (pMTl", pCDl , pPCPl ) strains of Y. pestis. Presence of functionally active form of lipopolysaccharide (LPS) in the incubation medium of the bacteria was evaluated via toxicity of supernatant of Y. pestis for intact animals (infection-toxic shock) and mice sensitized by D-GalN. Results. 37°C cultures of Y. pestis EV76 containing a full amount of plasmids were established to release LPS into the environment. Non-plasmid variants ofboth vaccine and virulent strains of Y. pestis pMTl", pCDl", pPCPl" do not have this ability. Separation of LPS from cell wall was detected in live bacteria of plague infectious agent. This process is assumed to be coupled with translocation of proteins coded by pMTl, pCDl, pPCPl plasmids from the cell into the environment. Conclusion. Functional inter-connection between extrachromosomal elements of heredity and toxic activity of Y. pestis LPS is established for the first time.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 2, P. 28—33
Keywords: Yersinia pestis, plasmids, lipopolysaccharide, toxicity 28
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что патогенез чумы в любой ее форме представляет собой стадии развития инфекционно-токсического шока, вызванного действием липополи-сахарида (ЛПС) возбудителя [1, 3]. Биологически активный полимер ЛПС является компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Для проявления токсических свойств ЛПС необходимо его отделение от внешней мембраны бактерий и представление рецепторам иммунокомпетентных клеток макроорганизма в свободной молекулярной форме. В опытах in vitro и in vivo показано, что целые клетки Y. pestis и препараты ЛПС, выделенные из этих культур, обладают различными иммуномодулирующими свойствами [12]. Максимальное воздействие на рецепторный комплекс TLR4/MD2 оказывает свободная форма ЛПС. В то же время, эффект действия ЛПС, связанного с бактериальной клеткой, незначителен. Объясняется это тем, что токсически активная часть ЛПС (липид А) жестко фиксирована физико-химическими связями с белками внешней мембраны бактерий, что исключает участие липи-да А в активации фагоцитарных клеток макроорганизма. Из данных литературы известно, что ЛПС в свободной форме в небольших количествах может высвобождаться в среду при делении клеток, при разрушении бактерий в процессе фагоцитоза, под действием комплекса белков системы комплемента и от антибиотиков, а также обнаруживается в составе бактериальных везикул [9].
Особенность Y. pestis состоит в том, что источником функционально активной формы ЛПС являются не разрушенные, а живые клетки бактерий. По наблюдению врачей-клиницистов действие эндотоксина максимально на терминальной стадии инфекции, когда стремительное размножение бактерий сопровождается гиперпродукцией цитокинов, что приводит к развитию септического шока и гибели организма [3,13].
Вопрос о том, каким образом бактерии Y. pestis отделяют Л ПС от клеточной стенки во внешнюю среду, специально не исследовался. Мы предположили, что освобождению ЛПС способствует система белков, кодируемых резидентными плазмидами Y. pestis. В пользу высказанного предположения свидетельствуют данные о структурно-функциональной организации плазмид рМТ1, pCDl, pPCPl и их роли в проявлении вирулентных свойств Y. pestis [1, 11]. При анализе работ, посвященных этим вопросам, мы обратили внимание на тот факт, что все белки, кодируемые плазмидами, локализованы, как правило, на внешней мембране клеточной стенки бактерий или же секретируются во внешнюю среду, то есть вектор транслокации белков направлен из клетки. Так, плазмида pCDl кодирует белки системы секреции III типа (T3SS) и эфффек-торные белки Yops дистанционного действия. Плазмида пестициногенности pPCPl уникальна для Y. pestis, содержит pía и psn гены. Бактериоцин пестицин секретируется во внешнюю среду, а протеаза Pia локализована на внешней мембране клеток возбудителя чумы. Плазмида рМТ1 — кодирует два важных видоспецифических белка: фракцию I и «мышиный» токсин (МТ). Фракция I формирует на поверхности микроба капсулу, которая не имеет жесткой связи с поверхностными структурами клетки, легко отделяется от них и диффундирует во внешнюю среду. Примечательно, что в состав капсульного вещества входят как МТ, так и ЛПС клеточной стенки бактерий [7]. Изложенное выше позволило предположить, что процесс отделения молекул ЛПС от клеточной мембраны сопряжен с процессом транслокации кодируемых плазмидами Y. pestis белков из клетки во вне.
Цель настоящей работы заключалась в выяснении роли внехромосомных элементов наследственности в проявлении токсических свойств Y. pestis.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для выяснения вопроса о функциональной взаимосвязи между экспрессией генов резидентных плазмид и активностью эндотоксина Y. pestis использованы два методических приема: модель инфекционно-токсического шока, описанная А.Н. Кравцовым и др. [5], и модель сенсибилизации биопробных животных D-галактозамином (D-Gal) [10]. Оба метода позволяют судить о присутствии функционально активной формы ЛПС в среде инкубации бактерий по ее токсичности для биопробных животных. Модель, предложенная Кравцовым А.Н., основана на трансформации ЛПС из биологически инертного в токсически активную форму в условиях in vitro. Процесс валиден терминальной стадии инфекции и осуществляется под влиянием биологически активного вещества, присутствующего в гемолизированных эритроцитах крови и тканях паренхиматозных органов млекопитающих. В условиях макроорганизма токсическое действие Л ПС реализуется через рецепторный комплекс TLR4/MD2 фагоцитарных клеток [6,8]. В случае с D-GalN механизм токсического действия ЛПС на макроорганизм иной — провоспалительный цитокин TNF-a, синтез которого индуцирует ЛПС, активирует специфические рецепторы апоптоза клеток печени (Fas R), что приводит к гибели гепатоцитов и организма в целом. Чувствительность метода инфекционно-токсического шока, определенная для ЛПС вакцинного штамма Y. pestis EV76, составляет приблизительно 40 мкг/мышь [7]. Чувствительность к ЛПС этого же штамма в условиях D-Gal равна 5—10 мкг/мышь [2]. Оба метода высокоэффективны для детекции свободной формы ЛПС Y. pestis в условиях in vivo.
Экспериментальная работа выполнена на вакцинном штамме Y. pestis EV76 (pMTl, pCDl, pPCPl). Из него был получен бесплазмидный вариант (рМТГ, pCDl", pPCPl"). Отсутствие интеграции плазмид с хромосомной ДНК подтверждено методом ПЦР с праймерами, комплементарными плазмидным i генам саП (плазмида pMTl), lcrV (плазмида pCDl) и pía (плазмида pPCPl). Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий под № КМ 1279, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов). Бесплазмидный вариант вирулентного штамма Y. pestis 231 (pMTl", pCDl", pPCPl) предоставлен проф. А.П.Анисимовым (ГНЦ ПМБ, Оболенск).
Выбор вакцинного штамма Y. pestis EV76 для проведения настоящего исследования не случаен. Клетки этого штамма не способны преодолевать неспецифический иммунный барьер макроорганизма и не вызывают гибели животных при внутрибрюшинном введении дозы 1х108 м.к./мышь. В то же время, основной патогенетический фактор — эндотоксин — у этого штамма сохранен и его действие проявляется при внутривенном введении бактерий биопробным животным [14] или же в условиях, соответствующих инфек-ционно-токсическому шоку, описанных нами ранее [5].
При использовании модели инфекционно-токсического шока культуры вакцинного штамма Y. pestis EV76 и бесплазмидные варианты вирулентного и вакцинного штаммов выращивали на плотной питательной среде LB (Difco, США) в течение 18 — 24 часов при 37°С. Для перевода ЛПС в токсически активную форму клетки исследуемых штаммов Y. pestis вносили в гемолизиро-ванные эритроциты крови человека в количестве 1 — 5х1010 м.к./мл и инкубировали 3 часа при 37°С. Затем клетки осаждали центрифугированием (5 мин при 12000 об./мин), а супернатанты вводили мышам внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл. В супернатанте содержалось от 1х104до 5х104м.к./мл. О присутствии ЛПС в супернатантах судили по гибели животных в течение первых двух суток наблюдения. Каждая экспериментальная группа содержала 6—10 мышей.
Обработку мышей D-GalN проводили по методу Galanos С. et al. в нашей модификации [2]. Для этого культуры Y. pestis всех используемых вариантов выращивали на плотной питательной среде LB (Difco, США) в течение 18 — 24 часов при 37°С. Взвесь бактерий концентрацией 1хЮ10 м.к./мл готовили на физиологическом растворе NaCl и инкубировали 3 часа при 37°С. Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 12 ООО об./мин. Полученный супернатант вводили мышам совместно с 20 мкг D-GalN вну-трибрюшинно в объеме 0,1 мл. В супернатанте содержалось от 1х104до 5х104 м. к./мл. О присутствии ЛПС в инокулятах судили по гибели животных в течение первых двух суток. Каждая экспериментальная группа содержала 6—10 мышей.
В экспериментах также использовали культуры Y. pestis EV76 (pMTl, pCDl, pPCPl), убитые кипячением при 100°С в течение 30 мин.
В качестве контроля экспериментальным животным вводили внутрибрю-шинно и внутривенно по 0,1 мл миллиардной взвеси клеток полноценного штамма Y. pestis EY76 и бесплазмидных вариантов вакцинного и вирулентного штаммов, выращенных на плотной питательной среде LB (Difco, США) в течение 18 часов при 37°С.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о принципиальных различиях в токсических свойствах Y. pestis EV76 (pMTl, pCDl, pPCPl) и бесплазмидных вариантов Y. pestis EV76 (pMTl", pCDl", pPCPl") и Y. pestis 231 (pMTl", pCDl", pPCPl") (табл.). Как следует изданных, приведенных в табл., супернатант полноценного штамма Y. pestis EV76, полученный после инкубации клеток в гемолизированных эритроцитах крови человека, токсичен для животных и вызывает гибель мышей в 100% случаев в течение первых двух суток наблюдения. В то же время, супернатанты бесплазмидных вариантов вакцинного Y. pestis EV76 и вирулентного штаммов Y. pestis 231 в этих же условиях постановки эксперимента не токсичны для животных. Аналогичные результаты были получены при использовании модели D-GalN. На фоне D-GalN среда инкубации клеток вакцинного штамма Y. pestis EV76 проявляет выраженный токсический эффект и вызывает гибель 100% животных. Бесплазмидные варианты вакцинного и вирулентного штаммов Y. pestis в
Токсичность У. ревйв ЕУ76 (рМТ1, рСЦ1, рРСР1) и бесплазмидных вариантов У. ревйв ЕУ76 (рШТ, рСОГ, рРСР1") и У. ревйв 231 (рМТГ, рСОГ, рРСРГ) для мышей при разных условиях постановки экспериментов
Условия постановки экспериментов Число павших животных/число взятых в опыт животных
Y. pestis EV76 (pMTl.pCDl, pPCPl) Y. pestis EV76 (pMTl", pCDl", pPCPl) Y. pestis 231 (pMTl, pCDl", pPCPl) Y. pestis EV76 (pMTl.pCDl, pPCPl)
Живые клетки Убитые клетки Живые клетки Живые клетки
1. Супернатанты клеток 70/70 0/30 0/40 0/10
Y. pestis. Модель инфекционно-токсического шока
2. Супернатанты клеток Y. pestis. 36/36 0/30 0/30 0/12
Модель D-GalN
3. Внутривенное введение 10/10 — 0/10 0/10
клеток Y. pestis
4. Внутрибрюшинное введение 0/12 — 0/12 0/12
клеток Y. pestis
равной мере не токсичны для биопробных животных. Обращает на себя внимание тот факт, что различия в токсическом действии полноценных и бес-плазмидных вариантов Y. pestis имеют не количественный, а качественный характер.
Столь же резко отличается токсичность живых и убитых кипячением клеток полноценного вакцинного штамма Y. pestis EV76. В отличие от живых бактерий среда инкубации мертвых клеток не токсична для мышей и не вызывает их гибели.
Качественные различия между полноценными и бесплазмидными вариантами Y. pestis EV76 подтверждают также результаты опытов по внутривенному введению культур биопробным животным. Введение клеток полноценного вакцинного штамма Y. pestis EV76 в хвостовую вену в количестве 1х108 м. кл. вызывает развитие типичного инфекционного процесса. Бесплазмидные варианты Y. pestis в тех же условиях не проявляют токсических свойств, и гибели животных не наблюдается.
ОБСУЖДЕНИЕ
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о функциональной взаимосвязи между резидентными плазмидами и токсической активностью ЛПС Y. pestis. Впервые установлено, что клетки Y. pestis EV76 , содержащие полноценный набор плазмид, способны высвобождать ЛПС во внешнюю среду, и этот процесс не связан с разрушением бактерий, а является функцией живых клеток возбудителя чумы. Варианты Y. pestis, лишенные внехромосом-ных элементов наследственности, такой способностью не обладают. Очевидно, что отделению ЛПС от клеточной стенки бактерий способствуют белки, кодируемые резидентными плазмидами Y. pestis. Видимо, этот процесс сопряжен с транслокацией кодируемых плазмидами pMTl, pCDl, pPCPl белков на наружную поверхность клеток либо во внешнюю среду. Примером может служить недавно установленный факт Л ПС-белкового взаимодействия между высокотемпературной формой ЛПС и белком Pia плазмиды пестициноген-ности pPCPl. Комплекс локализован на внешней мембране клетки, а функциональная активность Pia проявляется только при его сочетании с молекулой ЛПС [3].
В реализации токсического потенциала ЛПС Y. pestis, на наш взгляд, основная роль принадлежит капсульной субстанции возбудителя чумы. Как известно, капсулу на поверхности микроба формирует фракция I (FI) — белок, кодируемый плазмидой pMTl. Продукция капсулы строго зависит от температуры и максимальна при 37°С. Несмотря на то, что FI давно известна, выделена, очищена, установлены гены, ответственные за синтез и сборку, ее роль в инфекционном процессе при чуме до сих пор не совсем понятна [4].
Ранее в экспериментах in vitro и in vivo мы установили, что капсульная субстанция бактерий Y. pestis является носителем функционально активной формы ЛПС [7]. Как было отмечено ранее, биологическое своеобразие кап-сульного вещества Y. pestis заключается в отсутствии жесткой связи с поверхностными структурами клетки, в результате чего капсула легко отделяется от них и диффундирует во внешнюю среду. Предполагаем, что при отделении капсулы от клеток все биомолекулы, находящиеся на поверхности внешней мембраны и не имеющие ковалентной связи с близлежащими полимерами, включая молекулы ЛПС, «стягиваются» вместе с капсулой в среду инкубации бактерий. Процесс осуществляется на терминальной стадии инфекции и является центральным моментом патогенеза чумы. Накопление ЛПС в составе
капсульной субстанции происходит пропорционально росту и размножению бактерий в организме млекопитающих. После отделения капсульного вещества от клеток под влиянием биологически активных веществ паренхиматозных органов — литические ферменты и биологически активный гликолипид — капсула разрушается, а малотоксичный высокотемпературный ЛПС трансформируется в токсически активную форму [8]. Дальнейшее действие эндотоксина У. pestis канонично и осуществляется по схеме, типичной для ЛПС грамнегативных бактерий. Переход Л ПС от связанного состояния к свободной форме — необходимый этап в реализации токсического потенциала ЛПС Y. pestis. Молекулярные механизмы этого процесса и степень участия в нем каждой из плазмид Y. pestis является предметом дальнейших специальных исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. АнисимовА.П. Факторы Yersiniapestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Мол. генетика, микробиол., вирусол. 2002, 3: 3-23.
2. Демидова Г.В., ЗюзинаВ.П., Соколова Е.П. и др. Токсичность липополисахаридов вакцинного штамма Yersinia pestis EV 76 для белых мышей, сенсибилизированных D-галактозамином. Журн. микробиол. 2011, 1: 74-76.
3. Евсеева В.В., Платонов М.Е., Копылов П.Х., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Активатор плазминогена чумного микроба. Инфекция и иммунитет. 2015, 5 (1): 27-36.
4. Кадникова Л.А., Копылов П.Х., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Капсульный антиген чумного микроба. Инфекция и иммунитет. 2015, 5 (3): 201-218.
5. Кравцов А.Н., Тынянова В.И., Зюзина В.П. Повышение вирулентности бактерий Yersinia pestis при инкубации клеток в гемолизированных эритроцитах крови человека. Журн. микробиол. 1993,4: 3-6.
6. Рыжко И.В., Мишанькин М.Б., Тынянова В.И., Цураева Р.И., Молдован И.А. Способ прогнозирования клинической эффективности антибактериальных, вакцинных препаратов, средств пассивной антитоксической иммунотерапии на модели инфекционно-токсической формы чумы у мышей. Патент № 2303821 от 27.07.2007.
7. Соколова Е.П. Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба. Автореф. дис. канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 2002.
8. Тынянова В.И., Зюзина В.П., Демидова Г.В., Соколова Е.П. Специфичность им-муномодулирующего действия эндотоксина чумного микроба. Журн. микробиол. 2016,3: 104-112.
9. Eddy J., Gielda L., Caulfield A. et al. Production of outer membrane vesicles by the plague pathogen Yersiniapestis. PLoS One. 2014,9 (9): el07002.
10. Galanos C., Freudenberg M. A., Reuter W. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1979,76: 5939-5943.
11. Huang H.Z., Nicolich M., binder L. Current trends in plague research: from genomics to virulence. Clin. Med. Res. 2006,4 (3): 1189-1199.
12. Matsuura M., Takahashi H., Watanabe H. et al. Immunomodulatory properties ofYersinia pestis lipopolysaccharides on human macrophages. Clin. Vaccine Immunol. 2010,17 (1): 49-55.
13. Montminy S., Khan N., McGrath S. et al. Virulence factors ofYersinia pestis are overcome by a strong lipopolysaccharide response. J. Nature Immun. 2006,7 (10): 1066-1073.
14. Une T., Brubaker R. Roles of V antigen in promoting virulence and immunity in yersiniae. J. Immunol. 1984,133: 2226-2230.
Поступила 05.10.16
Контактная информация: Демидова Галина Викторовна, к. б. н., 3440002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117, р.т. (863)240-27-03
