CC BY
47
Влияние вируса клещевого энцефалита на ход метаморфоза напитавшихся личинок и нимф клеща Ixodes ricinus
Коротков Ю.С., Буренкова Л.А.
The influensing of the tick-borne encephalitis virus to the process of metamorphosis of engorged larvaes and nimphs of the tick Ixodes ricinus
Korotkov Yu.S., Burenkova L.A.
Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва
© Коротков Ю.С., Буренкова Л.А.
В лабораторном опыте смоделированы условия для развития напитавшихся личинок (n = 2 500) и нимф (n = 800) Ixodes ricinus с диапаузой (6 ч света). В отличие от контрольных (диапауза) клещи, зараженные вирусом клещевого энцефалита (штамм «ЭК-328»), развивались по трем различным сценариям: с диапаузой, с ускорением метаморфоза, без диа-паузы. Различия обусловлены сезоном года и действием вируса. Реализация различных сценариев осуществлялась через стимуляцию или блокировку гормона линьки.
Ключевые слова: диапауза, вирус клещевого энцефалита, Ixodes ricinus.
In laboratory experience the conditions for development engorged larvaes (n = 2 500) and nymphs (n = 800) of Ixodes ricinus with diapause (6 h of light) are simulated. In contrast to control (diapause), the ticks with tick-borne encephalitis virus (strain EK-328), developed under three variants; namely with diapause, with acceleration metamorphosis, and without diapause. The distinctions are caused by a season of the year and influence of the virus. The realization of variants carries out by stimulation or blocking of moult hormone.
Key words: diapause, tick-borne encephalitis virus, Ixodes ricinus.
УДК 616.988.25-002.954.2
Введение
Поисковая активность у I. ricinus выражена значительно слабее. Подвижность транзитных стадий развития этого клеща повышается только при приближении теплокровного животного — прокормителя. Благодаря такому поведению I. ricinus даже после реактивации выживает в лабораторных условиях свыше 2 лет.
Лесной клещ Ixodes ricinus L. является основным переносчиком вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в западной части нозоареала клещевого энцефалита (КЭ). Он служит также удобной лабораторной моделью для исследования паразито-хозяинных отношений между возбудителями и переносчиками инфекций [2]. По своему поведению I. ricinus существенно отличается от другого переносчика ВКЭ — клеща I. persulcatus, для которого характерна высокая поисковая активность, наступающая сразу после холодо-вой реактивации. Эта особенность усиливает агрессивность клещей и повышает вероятность их встречи с хозяином в условиях короткого лета. Вместе с тем повышение активности приводит к быстрому расходованию запасных питательных веществ, раннему истощению и гибели I. persulcatus в течение 1—2 мес.
Переносчики ВКЭ различаются и по многим другим признакам, характеризующим их физиологическое состояние, которые могут существенным образом влиять на результаты вирусологических экспериментов, увеличивая дисперсию оцениваемых параметров. Обычный набор маркируемых признаков экспериментальных клещей весьма ограничен и включает вид, пол, фазу развития, поколение, место сбора клещей, физиологический возраст (редко).
В настоящей работе исследуются причины, определяющие прочность морфогенетической диапаузы напитавшихся личинок и нимф I. ricinus в лабораторных условиях. В качестве одной из причин рассматривается влияние ВКЭ на ход метаморфоза клещей. Возможность такого влияния недавно установлена авторами данной статьи [12], и опыты по его оценке продолжаются по настоящее время.
Материал и методы
Личинки и нимфы получены от самок I. ricinus, собранных в природных условиях на северо-востоке Калужской области (Жуковский район, окрестности с. Высокиничи) в 2002—2003 гг. Самок кормили в середине и конце лета на кроликах и взрослых беспородных белых мышах. Всего в опыте использовано 2 500 личинок и свыше 800 нимф. Клещи были разбиты на 9 групп, различающихся по фазе развития (личинки, нимфы), наличию ВКЭ (интактные, зараженные), срокам кормления (октябрь, февраль, май), фотопериодическим условиям содержания сытых клещей (либо искусственный длинный день — 18 ч света, либо короткий — 6 ч света). Всех самок и их потомство, вплоть по появления взрослых клещей нового поколения, обследовали на спонтанное и латентное носительство вируса. Голодных личинок и нимф до кормления содержали в течение 1 мес в коротко-дневных условиях с целью их сенсибилизации и дальнейшей возможности моделировать тип развития клещей, изменяя только фотопериодический режим содержания напитавшихся клещей. Смену фотопериодического режима производили исходя из представлений о короткодневно-длиннодневной фотопериодической реакции (ФПР) лесного клеща [3]. Каждый вариант опыта был представлен тремя группами клещей, в которые брали по 150—300 личинок и 50—100 нимф. Клещей в период их развития содержали при комнатной температуре (22 °С). Ход метаморфоза клещей оценивали по методике, включающей приемы стягивания дисперсионного окна и расчета коэффициентов пробит-регрессии [13].
Клещей заражали путем их кормления на зараженных беспородных белых мышах массой 15—18 г. Мышам вводили внутрибрюшинно по 0,3 мл 4—6 lg БОЕ штамма «ЭК-328», изолированного из клещей I. persulcatus в Эстонии. На каждую мышь в день заражения подсаживали по 50—70 личинок или 15—25
нимф. Напитавшихся и перелинявших клещей последующих стадий развития (голодные нимфы и голодные имаго) исследовали на зараженность ВКЭ через 15—30 дней после насыщения или после линьки. Ин-фицированность клещей определяли в культуре клеток почек эмбриона свиньи по стандартной методике [8].
Результаты и обсуждение
Планирование опыта и оценку полученных результатов проводили с учетом установленных к настоящему времени данных о механизмах диапаузы клещей рода Ixodes. Известно, что диапауза напитавшихся личинок и нимф регулируется с помощью ней-роэндокринной системы [2]. Диапауза возникает при недостаточном поступлении в гемолимфу клеща гормона линьки. Синдром гормональной недостаточности возникает обычно у клещей, напитавшихся во второй половине лета, в период начавшегося сокращения продолжительности светлой части суток. Существенное влияние на восприятие и оценку световых сигналов оказывает температура [10, 14]. При аномально холодных условиях, которые складываются в отдельные годы в конце весны — начале лета, детерминация диапаузы смещается на более раннее время, календарно совпадающее с периодом летнего солнцестояния или даже с периодом нарастания длины дня. Считывание информации о продолжительности дня осуществляется с помощью так называемого околосуточного осциллятора, представляющего собой эндогенный счетчик продолжительности светлой и темной части суток. Фотопериодическая реакция клещей рода Ixodes относится к короткодневно-длиннодневному типу, при котором бездиапаузное развитие возможно только в том случае, если чувствительная стадия воспитывается сначала при коротком дне, а затем попадает в условия длинного дня [3]. При таком типе ФПР индукция диапаузы личинок и нимф I. ricinus зависит не только от фотопериодических условий развития напитавшихся клещей, но и от режима освещенности, в котором находились голодные особи. Бездиапаузное развитие клещей даже в условиях длинного дня возможно только после того, как голодные клещи в течение 20 и более суток содержались в короткодневных условиях. Это обстоятельство постоянно учитывалось в ходе опыта. В природной обстановке голодные кле-
щи проходят короткодневную сенсибилизацию осенью. В лабораторных условиях клещей сенсибилизировали искусственно, помещая их за 1 мес до кормления в короткий день.
В условиях длинного дня все напитавшиеся и сенсибилизированные личинки и нимфы развиваются без диапаузы. Вместе с тем наблюдается зависимость продолжительности метаморфоза клещей от срока их насыщения. Особи, напитавшиеся в конце весны, развиваются без задержки. Первые перелинявшие особи появляются на 21—25-й день после кормления. Половина личинок и нимф линяет на 30—32-й и 40—44-й день, а 95% — на 32—35-й и 50—55-й день. Метаморфоз клещей от 15 до 85% протекает за 10—12 дней, т.е. так же, как это отмечается и в природных условиях [13, 14]. Развитие личинок и нимф, напитавшихся в феврале и октябре, задерживается на 25—40 и 16—32 дня соответственно. Темпы их метаморфоза замедляются, а период линьки растягивается на 15—18 и 15—20 дней. Ход линьки интактных и зараженных клещей не различался ни в одной из сезонных серий опыта.
Влияние сезонного фактора на ход метаморфоза проявляется в короткодневных условиях еще более отчетливо, чем в длиннодневных. Интактные и зараженные клещи обеих стадий развития, напитавшиеся в мае, развиваются без задержки. Половина личинок и нимф линяет в следующую стадию развития, так же как и при длиннодневных условиях содержания, на 31—35-й и 40—45-й день. У интактных личинок, напитавшихся в феврале, наблюдается значительная задержка развития. Критическая дата (дата линьки 50% клещей) у личинок приходится на 80—85-й день, что на 50—55 дней позже, чем у личинок, напитавшихся в мае. Линька личинок на нимф продолжается до 105—110 дней. Такую продолжительность метаморфоза можно расценивать либо как задержку развития бездиапаузных клещей, либо как ускорение развития диапаузирующих. Зараженные и интактные личинки, напитавшиеся в октябре, линяют на нимф только после продолжительной диапаузы. Массовое отрождение нимф начинается на 190—200-й день после насыщения личинок.
Интактные нимфы, напитавшиеся в феврале, развиваются с диапаузой, 50% нимф линяют на имаго через 145—150 дней после насыщения, а линька заканчивается через 175—185 дней. Нимфы осеннего питания развиваются также с диапаузой, причем их
диапауза оказывается более прочной, чем у особей, напитавшихся в феврале. Массовая линька нимф на имаго начинается через 215—225 дней после их кормления и заканчивается только через 240—250 дней.
Наличие вируса не отражается на ходе метаморфоза напитавшихся личинок и нимф, содержавшихся в условиях длинного дня. В короткодневных условиях наблюдается существенное ускорение развития клещей под действием ВКЭ, но только среди особей, питавшихся в начале астрономической весны. Средний критический период развития личинок и нимф, питавшихся в феврале, сокращается соответственно с 85 до 38 дней (разница 47 дней) и со 145 до 123 дней (22 дня). У личинок при этом наблюдается не только ускорение развития, но и глубокое качественное изменение хода метаморфоза, состоящее в инвертировании диапаузы на бездиапаузное развитие.
Изложенные данные выходят за рамки сложившихся представлений о регуляции скорости развития напитавшихся клещей с помощью одного только суточного осциллятора. При такой регуляции следовало бы ожидать однозначной реакции сенсибилизированных клещей на искусственное увеличение или сокращение длины дня, приводящего либо к бездиапаузно-му развитию, либо к диапаузе. Зависимость сроков развития от сезона кормления указывает на то, что развитие клещей зависит не только от накопленной информации о длине дня, но и информации о сезоне года. Учитывая условия проведения данного опыта, можно предположить, что такая информация хранится в генетической памяти клеща. Способность различать сезоны года без помощи циркадных ритмов показана для многих видов позвоночных и беспозвоночных животных [19]. Наблюдения за виварной популяцией рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) показали, например, что у этого зверька сохраняется четкая сезонность размножения на протяжении 25 поколений [7].
Анализ паразито-хозяинных отношений нередко сопряжен со значительными трудностями, возникающими из-за наличия дублирующих систем контроля этих отношений, действующих нередко независимо друг от друга, с различной скоростью и через различные физиологические каналы связи между компонентами. Результаты опыта показывают, что одним из наиболее существенных каналов связи между ВКЭ и переносчиком служит эндокринная система I. ricinus,
управляющая ходом метаморфоза напитавшихся личинок и нимф. Наличие вируса ведет, по-видимому, к стимулированию линочного гормона. В зависимости от фотопериодических условий и сезона года такая стимуляция становится причиной либо сокращения периода покоя, либо полного выхода клещей из диапаузы. В длиннодневных условиях содержания клещей эффект стимуляции линочного гормона вирусом оказывается замаскированным, поскольку в этом случае длинный день гарантирует бездиапаузное развитие всех напитавшихся клещей независимо от наличия паразита. Возможно, именно то обстоятельство, что в лабораторных исследованиях моделируется обычно бездиапаузное развитие клещей, не позволяло длительное время замечать влияние ВКЭ на скорость их метаморфоза.
Анализ собственных и литературных данных о механизмах формирования морфогенетической диапаузы у клещей рода Ixodes позволяет представить регулятор-ный аппарат их диапаузы в виде механизма, воспринимающего и перерабатывающего внешние сигналы о состоянии окружающей среды. Реализация полученной информации осуществляется на уровне нейроэндокрин-ного управляющего звена, отвечающего за выработку гормона-активатора или гормона-ингибитора у голодных клещей и гормона линьки у напитавшихся клещей. На рисунке показана часть принципиальной схемы такого механизма, работающего в короткодневных условиях.
Схема механизма регуляции развития напитавшихся личинок и нимф Ixodes ricinus в короткодневных условиях (6 ч света). Суточный осциллятор — счетчик фотопериодических сигналов; сезонный осциллятор — счетчик времен года; ВКЭ — вирус клещевого энцефалита; КД — искусственный короткий день (6 ч света); весна-1 — начало астрономической весны (февраль), весна-2 — конец астрономической весны (май)
Конструкция длиннодневной части схемы не отличается от короткодневной и представляет меньший интерес для целей исследования, поскольку реализация всех внешних воздействий в данном блоке сводится к бездиапаузному развитию клещей.
Среди множества экологических факторов, определяющих состояние активной жизнедеятельности и диапаузы членистоногих, продолжительность дня занимает особое место [6, 13]. В отличие от гигротерми-ческих и пищевых условий свет не является необходимым для основных процессов жизнедеятельности иксодовых клещей. Продолжительность дня служит лишь фактором сигнального порядка и позволяет клещам готовиться к неблагоприятным условиям года до их наступления. При сокращении длины дня ниже пороговых значений следует диапауза, которая наступает обычно задолго до осеннего похолодания.
В лабораторных условиях счетчик фотопериодов принудительно устанавливается на длинный или короткий день. Короткий день индуцирует диапаузу, разрывая связь между воспринимающим блоком и блоком — продуцентом гормона линьки. Полученные
данные дают основание предполагать, что работа ней-роэндокринной системы I. ricinus согласуется с работой биологических часов, имеющих не одну, как предполагалось ранее, а две стрелки, одна из которых указывает длину дня, а другая — сезоны года. Первая и вторая стрелки обозначены на схеме как суточный и сезонный осцилляторы. Сочетание работы этих двух счетчиков времени по включению и выключению соответствующих каналов связи, показанных на схеме (см. рисунок), приводит к определенному типу развития напитавшихся интактных клещей. Сезонный осциллятор закрепляет тенденцию к диапаузе в осенний период, тормозит развитие в начале астрономической весны (весна-1) и выступает в роли основного фактора, включающего выработку гормона линьки и приводящего к бездиапаузному развитию клещей в конце весны (весна-2) даже в условиях короткого дня.
В экспериментах, проведенных ранее в полевых условиях, показана существенная роль температуры в модификации фотопериодической реакции клещей [14]. Понижение температуры вызывает увеличение фракции особей, спонтанно формирующих диапаузу в длинном дне, так же как и чрезмерно высокая температура способствует наступлению диапапузы. Изучение степени температурных коррекций ФПР иксодовых клещей в лабораторных условиях не проводилось, но существует необходимость такого исследования, поскольку от этого во многом будет зависеть точность интерпретации вирусологических и паразитологических наблюдений за системой возбудитель — переносчик или паразит — хозяин. В жизни клещей существенное значение имеют не только средние температурные нормы, но и амплитуда суточных терморитмов. Как показано на примере различных видов насекомых, эффекты, возникающие при совместном действии фото- и терморитмов, далеко не всегда соответствуют тем, которые наблюдаются в условиях постоянной температуры, эквивалентной среднесуточным значениям ритмов. Нередко обнаруживаются противоположные тенденции в изменении нормы ФПР в зависимости от температурных значений крио- и термофазы [4].
На ход морфогенеза клещей заметное влияние оказывает ВКЭ, стимулируя при определенном сочетании внешних условий продукцию гормона линьки и ускоряя развитие векторной части популяции переносчика. Такая стимуляция носит специфический характер и отличается от последствий стрессорных воздействий, возни-
кающих после применения сублетальных доз пестицидов, микроволнового излучения, непатогенных для клеща агентов бактериальной природы или вследствие определенного сочетания гигротермических условий содержания клещей [1, 11, 15—17 и др.]. Благодаря специфичности взаимодействия ВКЭ с переносчиками возникает возможность обмена информацией между компонентами системы возбудитель — переносчик. От переносчика возбудитель получает опережающую информацию о предстоящих сезонных изменениях климата, физиологическом состоянии клеща и т.п. Это предоставляет возможность для своевременного перехода вируса в латентное состояние осенью и его активизации весной.
Заключение
Влияние ВКЭ на переносчиков многогранно и является следствием тесной интеграции двух взаимодействующих компонентов паразитарной системы, возникшей в ходе эволюции. Процессы репликации и накопления вируса синхронизированы с процессами питания клещей, переваривания крови, линек, чередованием периодов покоя и активности и т.п. [2]. Как следует из результатов настоящего исследования, ВКЭ использует не только энергетические, но и информационные ресурсы хозяина. Паразитарная система возбудитель — переносчик успешно функционирует на основе хорошо развитой системы обратных информационных связей между взаимодействующими компонентами. Возбудитель получает опережающую информацию о предстоящих сезонных изменениях климата, физиологическом состоянии и ходе онтогенеза клещей, что позволяет ему адекватно реагировать на эти изменения чередованием периодов покоя, активности и размножения.
В свете проведенных исследований о влиянии возбудителя на переносчика находят объяснение и полученные ранее данные о спонтанном размножении вируса в напитавшихся природных нимфах I. persulcatus с детерминированной диапаузой [9]. Тогда ежегодно на протяжении четырех лет (1988—1991) наблюдали многократное увеличение вирусофорности нимф, напитавшихся во второй половине лета. Оказалось, что в ходе трансфазовой передачи ВКЭ диапауза выступает в роли амплификатора, а не супрессора размножения вируса, как считали ранее [5]. В результате вклад диапаузирующих клещей в циркуляцию
вируса не уступает вкладу клещей, проходящих бездиапаузное развитие.
Сокращение продолжительности развития клещей под действием ВКЭ экологически выгодно для популяции возбудителя, поскольку это ведет к увеличению векторной части популяции переносчиков, повышает вероятность вертикальной и горизонтальной передачи возбудителя и его длительной циркуляции в очагах КЭ. Такое взаимодействие сформировалось, по-видимому, в ходе совместной эволюции хозяина и паразита и закрепилось естественным отбором.
Установленные закономерности указывают на необходимость дополнения регламента вирусологических исследований, оценивающих интенсивность вертикальной (трансфазовой) передачи ВКЭ, данными о фотопериодических условиях содержания экспериментальных партий клещей. Такой подход позволяет сократить неспецифическую дисперсию результатов эксперимента за счет дополнительной группировки клещей по признаку детерминированности и прочности диапаузы.
Литература
1. Алексеев А.Н. Система клещ — возбудитель и ее эмерд-жентные свойства. СПб.: Наука, 1993. 203 с.
2. Балашов Ю.С. Иксодовые клещи — паразиты и переносчики инфекций. СПб.: Наука, 1998. 287 с.
3. Белозеров В.Н. К характеристике параметров двухступенчатой фотопериодической реакции, регулирующей сезонное развитие нимф клеща Ixodes ricinus (Acarina: Ixodidae) // Паразитология. 1995. Т. 29. Вып. 4. С. 240— 249.
4. Волкович Т.А. Влияние постоянных и переменных температур на индукцию диапаузы у златоглазки Chrysopa phyllochroma Wesm. (Neuroptera, Chrysopidae) // Энто-мол. обозрение. 1997. Т. 76. № 2. С. 241—250.
5. Вотяков В.И., Злобин В.И., Мишаева Н.П. Клещевые энцефалиты Евразии. Вопросы экологии, молекулярной эпидемиологии, нозологии, эволюции. Новосибирск: Наука, 2002. 438 с.
6.Данилевский А.С. Система экологических адаптаций насекомых к сезонности климата // Проблемы фотопериодизма и диапаузы у насекомых. Л., 1972. С. 15—25.
7.ДеминаВ.Т., БернштейнА.Д., КоротковЮ.С. Сравни-
тельный анализ репродуктивного процесса у рыжих полевок в природе и в лабораторной колонии // Бюл. МОИП. 1997. Т. 102. Вып. 6. С. 11—19.
8. Дживанян Т.И., Королев М.Б., Карганова Г.Г. и др. Изменение зависимых от хозяина характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к белым мышам // Вопр. вирусологии. 1988. № 5. С. 589—595.
9. Кисленко Г.С., Коротков Ю.С., Чунихин С.П. Мелкие млекопитающие в природных очагах клещевого энцефалита средней Сибири // Мед. паразитология. 1995. № 1. С. 36—40.
10. Коротков Ю.С. Постепенная изменчивость паразитарной системы клещевого энцефалита // Вопр. вирусологии. 2005. Т. 50. № 3. С. 52—56.
11. КоротковЮ.С., БуренковМ.С., Буренкова Л.А. и др. Реакция клеща Hyaloma asiaticum (Acarina, Ixodidae) на микроволны 1—4 ГГц // Мед. паразитология. 1996. № 4. С. 18—21.
12. КоротковЮ.С., Буренкова Л.А. Влияние вируса клещевого энцефалита на скорость развития сытых личинок клеща Ixodes ricinus (Acari, Ixodidae) // Материалы VIII Всерос. акаралогического совещания. СПб., 2004. С. 52—54.
13. КоротковЮ.С., Кисленко Г.С. Морфогенетическая диа-пауза таежного клеща и методы ее количественной оценки в условиях полевого эксперимента // Паразитология. 1991. Т. 25. Вып. 6. С. 494—503.
14. Коротков Ю.С., Кисленко Г.С. Соотношение светового и гигротермического факторов в детерминации морфоге-нетической диапаузы личинок и нимф таежного клеща на северо-западных отрогах Восточного Саяна // Паразитология. 1995. Т. 29. № 3. С. 145—153.
15. КоротковЮ.С., КисленкоГ.С., Чунихин С.П. и др. Некоторые особенности акарицидного действия кропотекса — ингибитора развития клещей // Мед. паразитология. 1985. № 3. С. 44—48.
16.AlekseevA.N., Korotkov Y.S., BurenkovaL.A. Virus-Pesticide interaction in Ixodes persulcatus and Amblioma herbraeum tick (Acarina, Ixodidae) // Experimental & Applied Acarolo-gy. 1997. P. 561—568.
17. CisakE., Chimielewska-Badora J., Dutkiewicz J., Zwolinski J. Preliminary studies on the relationship between Ixodes ricinus activity and tick-borne infection among occupationally-exposed inhabitations of Eastern Poland // Ann. Agric. Environ. Med. 2001. V. 8. P. 293—295.
18. Perret J.L., Guerin P.M., Diehl P.F., et all. Darkness induces mobility, and saturation deficit limits questing duration, in the tick Ixodes ricinus // J. of Experimental biology. 2003. V. 206. P. 1809—1815.
19. SaundersD.S. Insect photoperiodism — the clock and counter: a revive // J. Insect. Phisiol. 1981. V. 6. P. 99—115.
Поступила в редакцию 06.01.2006 г.
