CC BY
86
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2014 БИОЛОГИЯ Вып. 2
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
RHODOCOCCUS RHODOCHROUS ИЭГМ 647
НА БИОДЕСТРУКЦИЮ ДРОТАВЕРИНА
ГИДРОХЛОРИДА - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО
ЭКОТОКСИКАНТА
А. Н. Мухутдинова
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13; annamukhutdinova@ya.ru; (342)2808114
Исследовано влияние абиотических (температура, кислотность, аэрация) и биотических (количество биомассы) факторов среды, определяющих оптимальные условия для роста R. rhodochrous ИЭГМ 647 в присутствии дротаверина гидрохлорида - фармацевтического экотоксиканта, а также глюкозы в качестве дополнительного источника углерода и энергии. Эффективная биодеструкция дротаверина возможна при 28°С, рН 6.8, в условиях использования гидродинамического режима с чередованием интенсивного и умеренного перемешивания (160, 60,
160 об/мин.). Влияние количества вносимой биомассы на продолжительность процесса разложения дротаверина не выявлено.
Ключевые слова: дротаверина гидрохлорид; Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 647; биодеструкция; условия культивирования.
Введение
В настоящее время остро стоит проблема загрязнения окружающей среды фармполлютантами - высокостабильными соединениями с разнообразной химической структурой и выраженной биологической активностью. Они обнаруживаются в почве, донных осадках водоемов, сточных, грунтовых водах и даже в питьевой воде [Се^, Tso, Aga, 2009; Баренбойм, Чиганова, 2012; Гетьман, Наркевич, 2013].
Известно, что аккумуляция фармполлютантов в природных экосистемах и их долговременное воздействие на живые организмы может сопровождаться развитием раковых клеток и нарушением функций работы почек у млекопитающих, снижением репродуктивной активности у рыб, а также другими патологическими изменениями [Bessems, Vermeulen, 2001; Lalumera et э1., 2004]. Загрязнение объектов окружающей среды отходами фармацевтической промышленности обусловлено неэффективностью способов их утилизации (сжигание, слив в промышленную канализацию, размещение на санитарных полигонах), также несовершенством методов очистки сточных вод от фармпол-
лютантов (озонирование, хлорирование, сорбирование углем и др.). Поэтому актуальной задачей является разработка экологически безопасных и результативных способов разложения, детоксикации и выведения подобных микрополлютантов и продуктов их разложения из экосистем.
Всё большее внимание привлекают способы микробной деструкции фармполлютантов. К наиболее активным биодеструкторам широкого ряда лекарственных средств относятся актинобактерии рода Rhodococcus [Yoshimoto et al., 2004; Kim et al., 2009; Gauthier, Yargeau, Cooper., 2010; Ivshina et al., 2012].
Большое число фармполлютантов, детектируемых в окружающей среде, представлены азотсодержащими гетероциклическими соединениями. Дротаверина гидрохлорид (C24H31NO4, CAS: 985-12-6, 1-(3,4-диэтоксибензилиден)-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетра-гидроизохинолина гидрохлорид, ДГ) - лекарственное вещество спазмолитического, миотропного и сосудорасширяющего действия, производное изохи-нолинового ряда. ДГ является одним из широко используемых в современной медицинской практике лекарственных средств. Ежегодное потребление его в развитых странах составляет сотни тонн, что неиз-
© Мухутдинова А. Н., 2014
бежно приводит к попаданию и аккумуляции ДГ в окружающей среде [Duca, Boldescu, 2009]. Есть данные, указывающие на эмбрио- и цитотоксиче-ское действие ДГ в отношении млекопитающих [Endrefly, Boda, 1983; Демушкин и др., 2011].
Ранее была установлена способность родококков к биодеструкции ДГ [Ivshina et al., 2012]. Использование различных приемов стимулирования деградирующей активности родококков: прединкубация клеток в присутствии низких концентраций поллютанта, введение в инкубационную среду дополнительных энергетических субстратов, иммобилизация клеток на твердых носителях обеспечивали полную биодеструкцию ДГ на 30 сут. ферментации. Однако полученный результат является довольно длительным периодом биодеструкции ДГ. Известно, что на эффективность процесса деструкции токсикантов влияет ряд абиотических (кислотность, температура, аэрация) и биотических (численность бактерий) факторов, определяющих условия роста бактерий - деструкторов.
Цель настоящей работы - поиск оптимальных условий культивирования родококков, необходимых для сокращения продолжительности процесса биодеструкции ДГ.
Материалы и методы
Эксперименты по биодеструкции ДГ проводили в колбах Эрленмейера, объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды «RS» следующего состава (г/л): KH2PO4, 2.0; K2HPO4, 2.0; (NH4)2SO4, 2.0; KNO3, 1.0; NaCl, 1.0; MgSO4^O, 0.2;
CaCb-2H2O, 0.02; FeCb^O, 0.001. В качестве биодеструктора ДГ использовали штамм R. rhodochrous ИЭГМ 647 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768, www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html). Посевным материалом служили родококки, предварительно выращенные в присутствии низких (0.0002%) концентраций ДГ. Оптическая плотность (ОП60о) вносимой клеточной суспензии составляла 0.2-2.0. Показатели оптической плотности измеряли с помощью спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin Elmer, США). ДГ в среду культивирования родо-кокков вносили из стерильного концентрированного (0.1%) раствора до конечной концентрации 0.002%. В качестве дополнительного энергетического субстрата использовали глюкозу (0.5%). Процесс биодеструкции ДГ вели при разных режимах температуры (18, 28, 35°C), кислотности (pH
5.0, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0) и аэрации среды культивирования. Уровень кислотности инкубационной среды доводили до необходимых значений с использованием 6н HCl. Условия аэрации регулировали за счет изменения гидродинамического режима (60, 160, 180 об/мин.), непрерывно перемешивая среду на орбитальной качалке Cetromat IS
(«Sartorius», Германия). В отдельных экспериментах показатели гидродинамического режима изменяли каждые 5 сут. с чередованием 160 и 60 об/мин.. Об эффективности разложения ДГ судили по его убыли из среды культивирования в процессе биодеструкции. Убыль ДГ регистрировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью хроматографа LC Prominence («Shimadzu», Япония), оборудованного колонкой с обращено-фазовым сорбентом Discovery С18 ® и диодно-матричным детектором. Во избежание фотодеградации и фотоинициированного окисления ДГ содержимое колб защищали с помощью светонепроницаемого материала. В качестве контроля использовали стерильный раствор ДГ в минеральной среде (для оценки абиотической деструкции ДГ) и раствор ДГ в минеральной среде с инактивированными автоклавированием при 1.0 атм. трехкратно в течение 20 мин. клетками родо-кокков (для оценки степени адсорбции ДГ на бактериальных клетках).
Результаты и их обсуждение
По нашим данным, процесс биодеструкции ДГ протекал в диапазоне значений кислотности среды культивирования от рН 6.2 до 6.8. Как видно из рис. 1, оптимальным уровнем кислотности для биодеструкции ДГ являлся pH среды 6.8, при этом остаточный уровень содержания ДГ на 15 сут. эксперимента составлял 38%. Общая продолжительность процесса биологического разложения ДГ в данных условиях составляла 42 сут. (рис. 2). Использование значений pH среды культивирования родококков 6.8, 6.6, 6.4. и 6.2 приводило к достоверному снижению деструктивной активности актинобактериальных клеток. Так, в слабокислых (рН 6.4, 6.6) условиях по истечении 15 сут. остаточное содержание ДГ в среде составляло еще 53 и 42% соответственно, а при значении pH 6.2 - 68%. В кислых (рН 5.0 и 6.0) условиях среды разложение ДГ не обнаруживалось, что, очевидно, объясняется низкой кислотоустойчивостью клеток R. rhodochrous ИЭГМ 647. Проведение экспериментов в нейтральных (pH 7.0) условиях среды культивирования родококков приводило к выпадению ДГ в хлопьеобразный осадок, ДГ становился недоступным для родококков. Для дальнейших экспериментов в качестве оптимального уровня водородного показателя среды было выбрано значение pH 6.8, обеспечивающее полную деструкцию ДГ клетками R. rhodochrous ИЭГМ 647.
Наиболее высокие показатели убыли субстрата через 15 сут. выявлялись при температуре 28°С (рис. 3). Проведение биодеструкции ДГ при 18°C приводило к незначительному снижению интенсивности разложения ДГ, тогда как увеличение показателей температуры до 35°C приводило к практически полному ингибированию процесса.
Влияние условий культивирования Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 647.
3
[-Н
И №| №l to ffi
пи
І
6.0 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0
Показатели рH
Рис. 1. Биодеструкция ДГ с использованием R. rhodochrous ИЭГМ 647 через 1S сут. при различном уровне кислотности среды (3):
1 - абиотический контроль, 2 - контроль биосорбции
Время, сут
Рис. 2. Биодеструкция ДГ с использованием R. rhodochrous ИЭГМ 647 при pH 6.8 (3):
1 - абиотический контроль, 2 - контроль биосорбции
Содержание ДГ, %
Рис. 3. Биодеструкция ДГ с использованием R. rhodochrous ИЭГМ 647 через 1S сут. в условиях разных температурных режимов
Как видно из рис. 4, при культивировании R. rhodochrous ИЭГМ 647 при 160 об/мин. полная биодеструкция ДГ достигалась по истечении 42 сут. Более высокий (180 об/мин.) уровень гидродинамического режима, как и низкий (60 об/мин.), не обеспечивали эффективную убыль ДГ. При чередовании высоких и низких (60 и 160 об/мин.) гидродинамических показателей продолжительность процесса биодеструкции ДГ значительно снижалась и составляла 1S сут. (рис. S).
Время, сут
Рис. 4. Влияние гидродинамического режима на продолжительность процесса биодеструкции ДГ с использованием R. rhodochrous ИЭГМ 647:
1 - 60 об/мин., 2 - 180 об/мин., 3 - 160 об/мин.
T 28 C
Время, сут
Рис. S. Биодеструкция ДГ с использованием R. rhodochrous ИЭГМ 647 в условиях переменного режима аэрации (3):
1 - абиотический контроль, 2 - контроль биосорбции
По нашим данным, зависимость между количеством вносимой биомассы и разложением ДГ через 10 сут. эксперимента не выявлялась (рис. 6). Более низкие значения остаточного содержания ДГ в среде культивирования при показателях ОП600
2.0, вероятно, обусловлены возможной сорбцией ДГ на клеточную биомассу.
1 2
і
fin
±L
fl
Г+1
iL
“Ei
pH 6.8,T 28 °С, °-2
160, 60, 160 об/мин
0.4 0.6 1.0
Значения ОП600
Рис. 6. Биодеструкция ДГ с использованием R. rhodochrous ИЭГМ 647 через 10 сут. культивирования при различной концентрации вводимой клеточной биомассы (3):
1 - абиотический контроль, 2 - контроль биосорбции
1 2 3
0
2.0
Заключение
В результате проведенных исследований установлено, что процесс биодеструкции ДГ с использованием R. rhodochrous ИЭГМ 647 наиболее эффективно протекал при 28°C, pH 6.8 и непрерывном перемешивании среды с чередованием гидродинамических показателей (160, 60, 160 об/мин.). При этом полная биодеструкция ДГ достигалась через 15 сут. культивирования R. rhodochrous ИЭГМ 647.
Исследование выполнено при поддержке гранта Программы фундаментальных исследований Президиума РАН “Живая природа: современное состояние и проблемы развития” (проект № 01201256869).
Библиографический список
Баренбойм Г.М., Чиганова МА. Загрязнение поверхностных и сточных вод лекарственными препаратами // Вода: химия и экология. 2012. № 10. С. 40-46.
Гетьман М.А., Наркевич И.А. Лекарственные средства в окружающей среде // Ремедиум. 2013. № 2. С. 50-54.
Демушкин В.П., Жаворонкова Е.В., Хаспеков Л.Г. Влияние дротаверина гидрохлорида на жизнеспособность культивируемых клеток-зерен мозжечка крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 152, № 10. С. 425-427.
Bessems J.G., Vermeulen N.P. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: molecular and
biochemical mechanisms, analogues and protective approaches // Critical Reviews in Toxicology. Vol. 31 (1). 2001. P. 55-138.
Celiz M.D., Tso J., Aga D.S. Pharmaceutical metabolites in the environment: analytical
challenges and ecological risks // Environmental Toxicology and Chemistry. 2009. Vol. 28 (12). P. 2473-2484.
Duca G., Boldescu V. Pharmaceuticals and personal care products in the environment. In: Bahadir AM, Duca G. (eds) The role of ecological chemistry in pollution research and sustainable development. Springer Science and Business Media B.V. Dordrecht. 2009. P. 27-35.
Endreffy E., Boda D. Effect of drugs used in obstetrics on the constriction by oxygen of the ductus arteriosus of the rabbit fetus // Acta Paediatrica Hungarica. 1983. Vol. 24 (3). P. 281-285.
Gauthier H, Yargeau V., Cooper D G. Biodegradation of pharmaceuticals by Rhodococcus rhodochrous and Aspergillus niger by co-metabolism // Science of the Total Environment. 2010. Vol. 408. P. 1701-1706.
Ivshina l.B. et al. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cell of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608 // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2012. Vol. 28. P. 2997-3006.
Kim Y.-u. et al. Steroid 9a-hydroxylation during testosterone degradation by resting Rhodococcus equi cells // Archiv der Pharmazie - Chemistry in Life Sciences. 2009. Vol. 340. P. 209-214.
Lalumera G.M. et al. Preliminary investigation on the environmental occurrence and effects of antibiotics used in aquaculture in Italy // Chemosphere. 2004. Vol. 54. P. 661-668.
Yoshimoto T. et al. Degradation of estrogens by Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi isolates from activated sludge in wastewater treatment plants // Applied and Environmental Microbiology. 2004. Vol. 70 (9). P. 5283-5289.
Поступила в редакцию 20.05.2014
Effect of Rhodococcus rhodochrous IEGM 647 cultivation on biodegradation of drotaverine hydrochloride, a pharma ecotoxicant A. N. Mukhutdinova, Phd student
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences. 13 Golev Street, Perm, Russia, 614081; AnnaMukhutdinova@ya.ru; (342)2808114
The influence of abiotic (temperature, pH, aeration) and biotic (biomass) environmental factors which determine the optimal conditions for the growth of R. rhodochrous strain IEGM 647 in the presence of drotaverine hydrochloride, a pharma ecotoxicant and glucose as additional source of carbon and energy. Effective biodegradation of drotaverine occurred at 28°C and pH 6.8, using the hydrodynamic regime with alternative intense or mild agitation (160, 60, 160 rpm). The biomass amount added to the medium did not affect the duration of the biodegradation process.
Key words: drotaverine hydrochloride; Rhodococcus rhodochrous IEGM 647; biodegradation; culture conditions.
Мухутдинова Анна Наилевна, аспирант
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН
