CC BY
13
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПРЯМОЕ ПРОРАСТАНИЕ, КАЛЛУСООБРАЗОВАНИЕ И РЕГЕНЕРАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ В КУЛЬТУРЕ НЕЗРЕЛЫХ _ЗАРОДЫШЕЙ ЯЧМЕНЯ_
Асадова Садагат Ширмамед кызы,
доктор философии по биологии, доцент, ведущий научный сотрудник, Институт молекулярной биологии и биотехнологий НАН Азербайджана и
НИИ Земледелия МСХ Азербайджана, Гамбарова Парвин Иса кызы, магистрант
Азербайджанского государственного аграрного университета МСХ Азербайджана,
г. Гянджа
DOI: 10.31618/ESU.2413-9335.2019.3.59.4-7 EFFECT OF DiFFERENT CULTiVATiON CONDiTiONS ON GERMiNATiON, CALLUSOGENESiS AND REGENERATiON POTENTIAL iN THE CULTURE OF iMMATURE
BARLEY EMBRYOS
Asadova Sadagat
PhD in Biology, Associate Professor, Leading Researcher, Institute of Molecular Biology and Biotechnology of the National Academy of Sciences of Azerbaijan and Research Institute of Crop Husbandry of the Ministry of Agriculture of Azerbaijan,
Baku
Gambarova Parvin
Master of
Azerbaijan State Agricultural University of Azerbaijan Ministry of Agriculture, Ganja
АННОТАЦИЯ
С целью изучения ответной реакции генотипов на различные условия культивирования и зависимости этих реакций от генотипических особенностей растения в культуру были введены незрелые зародыши 5-ти перспективных сортов Азербайджанской селекции. Инкубация зародышей осуществлялась в темноте, а также на свету в сочетании с повышенной температурой. Результаты показали, что разная реакция сортов на условия инкубации в большей степени проявляется при индукции каллусогенеза. При индукции морфогенеза по числу каллусов, давших растения-регенеранты, между контрольным и опытным вариантами существенной разницы выявлено не было.
ABSTRACT
In order to study the response of genotypes to various cultivation conditions as well as dependence of these reactions on the genotypic characteristics of the plant, immature embryos of 5 promising varieties of Azerbaijani selection were introduced into the culture. Incubation of the embryo was carried out in the dark, as well as in the light with elevated temperature. The results showed that the different reaction of the varieties to the incubation conditions is observed mostly during the induction of callusogenesis. During the induction of morphogenesis by the number of callus that produced regenerated plants, no significant difference between the control and experimental variants was revealed.
Ключевые слова: ячмень, незрелый зародыш, температура, освещение, особенности генотипа.
Key words: barley, immature embryo, high temperature, lighting, peculiarity of genotype
Введение
Ячмень - ценное для народного хозяйства растение, используемое в продовольственных, кормовых и технических целях. По сравнению с другими зерновыми культурами ячмень менее требователен к почвенным факторам, благодаря чему посевные площади под этой культурой с каждым годом увеличиваются. Только в Азербайджане по площади возделывания ячмень занимает второе после пшеницы место. Несмотря на это, урожай ячменя в достаточной степени колеблется по годам. Есть мнение, что тенденция к снижению урожая связана с изменением климатических условий на планете [5]. Азербайджан характеризуется 9 типами климата из 11 имеющихся: от сухого и влажного субтропического - до горного тундрового. Неоспоримый факт,
что урожай ячменя, полученный в каждом отдельном регионе республики, имеющим определенный тип почв и климата, будет неодинаков. Разнообразие климатических условий, а также наблюдаемое в последнее время глобальное потепление, предусматривает необходимость создания новых сортов сельскохозяйственных культур, приспособленных к конкретным условиям каждого отдельно взятого региона. В последние годы получила достаточно широкое распространение идея создания моделей идеальных сельскохозяйственных растений, приспособленных к определенным агро-климатиче-ским условиям, поскольку такой подход способствует целенаправленному созданию сортов растений с заданными свойствами [3]. В создании новых сортов достаточно значимую роль играют методы
клеточной селекции, благодаря которым создаются условия для ускорения селекционного процесса. Кроме того, создавая конкретные модели культивирования, в условиях in vitro можно проводить исследования на тканевом и клеточном уровнях [4, 6, 7]. Пользуясь возможностями этой технологии, мы ввели в культуру in vitro экспланты ряда перспективных современных сортов Азербайджанской селекции с целью изучения ответной реакции генотипов на различные условия культивирования и зависимости этих реакций от генетических особенностей растения.
Материал и методы
Эксперименты проводились в камере искусственного климата. В качестве материала исследования использовалось 5 перспективных сортов ячменя, различающихся между собой по источникам происхождения, количеству рядов в колосе, устойчивости к экологическим факторам и болезням: районированный сорт Нахчивандани, полученный в 1939 году из местных сортов многорядного ячменя, и 4 сорта, которые благодаря многолетним селекционным работам были выведены из различных питомников, интродуцированных из Международного центра ICARDA. Из них: засухо-и морозоустойчивый сорт Гудратли-48, полученный из международного питомника гибридов озимого ячменя (IB-CB-WT); засухоустойчивый сорт Джалилабад-19, полученный из формы английского двурядного ячменя K-26788; сорт Бахарлы, полученный из сортообразца многорядного ячменя Rihani-03, избегающий благодаря скороспелости весенне-летние засухи; засухо- и морозоустойчивый сорт озимого ячменя Даянатли, полученный из международного питомника наблюдения (IBON-VVT).
Зерна всех сортов, собранные на стадии восковой спелости, подвергались стерилизации в течение 5-ти минут в 70%-ном этаноле, 18-и минут - в 1%-ном растворе хлоргексидина и после смены каждого стерилизующего агента 3-4 раза промывались стерильной дистиллированной водой. Вычлененные из зерен незрелые зародыши высаживались на питательную среду Gamborg (B5) с добавлением в
качестве фитогормонов 2,4-дихлорфеноксиуксус-ной кислоты и кинетина. Применяли 3 варианта культивирования: 1) темнота + 26^ (контроль); 2) слабое освещение (3 тыс. люкс) + 260^ 3) освещение (16 тыс. люкс) + высокая температура (34±20С). Образцы 2-го и 3-го варианта через 2 недели культивирования переносились в условия рассеянного освещения.
Результаты и их обсуждение
Наблюдения показали, что в образцах 2-ого варианта опыта (слабое освещение+260С), индукция каллуса началась на 2-3 дня позже по сравнению с контролем. В этом эксперименте наблюдались как случаи прорастания зародышей, так и образование имеющих зеленоватый оттенок каллусных клеток. Однако пролиферация шла настолько медленно, что в большинстве случаев регистрировался процесс некроза в тканях, некротические участки разрастались и, в конечном итоге, покрывали всю поверхность зародыша, приводя к его гибели. После 2 пассажей, в зависимости от сорта, 70-90% зародышей погибали. В связи с тем, что данный вариант опыта оказался неперспективным, он был выведен из эксперимента. Вся последующая работа проводилась с 1 -м и 3 -м вариантами опыта. Во время культивирования у всех исследуемых сортов наблюдались случаи прорастания зародышей в обоих вариантах эксперимента. Прорастание зародышей - явление нежелательное, но в клеточной культуре ячменя встречается достаточно часто. Ранее мы проводили эксперименты, целью которых было предотвратить прорастание зародышей. В связи с этим мы изучали влияние на этот процесс гидролизата казеина, кинетина, сульфата меди и температуры [1, 2]. Однако цель настоящего эксперимента заключалась в выявлении условий инкубации, повышающих регенерационный потенциал исследуемых сортов на питательных средах с одинаковым минеральным и фитогормональным составом.
Наблюдения показали, что реакция сортов на условия инкубации была различной Так, у 4-х сортов условия освещения стимулировали прорастание зародышей (Таблица 1). Менее склонными к прорастанию оказались зародыши
Число проросших зародышей по сортам, в %
Гудратли-48 Джалилабад-19 Нахчивандани Бахарлы Даянатли
контроль 3-ий вар. контроль 3-ий вар. контроль 3-ий вар. контроль 3-ий вар. контроль 3-ий вар.
0 22,3 14,3 33,3 75,0 22,3 25,0 33,4 12,5 55,6
Таблица 1. Прямое прорастание в культуре незрелых зародышей ячменя
сорта Гудратли-48, причем число зародышей, образовавших каллусную ткань у этого сорта было больше, чем у других исследуемых сортов (таблица 2). Нашими предыдущими исследованиями было показано, что, независимо от типа экспланта, минерального состава питательной среды и концентрации фитогормонов у сорта Гудратли- 48, индуцировать каллусогенез удавалось у большего числа экс-плантов. Однако в 3-м варианте опыта (освещение
34±20C) у этого сорта количество эксплантов, образовавших морфогенные каллусы уменьшалось. Сходная картина наблюдалась и у сорта Бахарлы, но показатели в данном случае были значительно ниже, чем у других сортов. В целом, первый вариант культивирования (темнота+260С), используемый в качестве контроля, был более благоприятным для индуцирования каллусогенеза у всех изученных сортов, за исключением сорта Нахчивандани. Однако, если у сорта Нахчивандани
для образования и пролиферации каллусной ткани более благоприятным условием было культивирование эксплантов в условиях освещенности и высокой температуры, то регенерационный потенциал его реализовался примерно одинаково в обоих вариантах опыта. Можно предположить, что в ходе
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) #2 (59), 2019 данных исследований проявление генетических особенностей сортов Бахарлы и Нахчывандани в меньшей степени зависело от выбранных условий культивирования, т.е. два этих сорта оказались более пластичными при адаптации к различающимся условиям инкубации.
Таблица 2
Влияние условий культивирования на каллусо-и морфогенез в культуре незрелых зародышей ячменя с различной потенциальной продуктивностью_
Название сорта Варианты инкубации Количество зародышей, образо- Количество мор-фогенных каллу- Потенциальная продуктивность
вавших каллусы сов т/га
Гудратли-48 контроль 100%±0% 55,5%±16,3% 5.0-5.5
3-ий вариант 77,7%±27,4% 33,3%±15,3%
Джалилабад-19 контроль 85,7%±26,2% 14,8%±13,1% 6.0-7.0
3-ий вариант 55,5%±9,4% 22,2%±13,7%
Нахчивандани контроль 25,0%±9,8% 50,0%±17,6% 5,5-6,0
3-ий вариант 77,7%±27,4% 55,5%±16,3%
Бахарлы контроль 75,0%±30,6% 37,5%±17,1% 6,5-7,0
3-ий вариант 66,6%±31,0% 33,0%±15,3%
Даянатли контроль 87,5%±23,2% 50,0%± 17,6% 5,0-5,5
3-ий вариант 44,4%±32,6% 66,6%±15,5%
Сочетание света и высокой температуры стимулировало процессы регенерации у сортов Дая-натли и Джалилабад-19. И, хотя Джалилабад-19 характеризовался очень низким регенерационным потенциалом в контрольных условиях культивирования, этот показатель в достаточной степени повышался в третьем варианте эксперимента.
Различная морфогенетическая реакция сортов на условия культивирования объясняется зависимостью этих реакций от ряда присущих конкретному растению особенностей [4]. Результаты многочисленных исследований также подтверждают, что для успешного размножения требуемых растений необходимо разрабатывать специфические условия для каждого отдельно взятого генотипа [4,6,7]. Особенно, когда это касается генотипов с хозяйственно ценными признаками, потому что есть мнение, что такие растения отличаются слабыми характеристиками при in vitro культивировании. В нашем исследовании в обоих вариантах опыта самый низкий регенерационный потенциал наблюдался у сортов Джалилабад-19 и Бахарлы, которые, как видно из таблицы 2, характеризуются более высокими показателями потенциальной продуктивности.
Что касается результатов нашего эксперимента, то на основании вышесказанного мы не можем дать однозначной оценки различающимся условиям инкубации, поскольку в данном эксперименте в большей степени проявились генотипиче-ские особенности исследуемых сортов. Кроме того, полученные результаты не дают нам основание утверждать, что культивирование незрелых зародышей на свету при повышенной температуре приведет к увеличению их регенерационного потенциала, поскольку оценка данных по критерию Стью-дента, показала отсутствие существенной разницы
между средними. Это еще раз подтверждает мнение о том, что для каждого ценного с точки зрения исследователя растения, необходимо разрабатывать свой протокол регенерации.
Список литературы
1. С.Ш. Асадова, З.А. Гарибов, А.М. Лабаза-нова, П.И. Гамбарова. Некоторые особенности кал-лусо- и морфогенеза в культуре ткани ячменя Азербайджанской селекции. III-я научно-практическая конференция «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Севере» с международным участием, и научная школа по клеточной биотехнологии. 4-8 июня, 2018, Якутия, Саха, стр. 114-117
2. Асадова С.Ш., Гамбарова П.И. Некоторые методические аспекты культивирования in vitro зрелых зародышей местных сортов ячменя. Международная конференция PLAMIC-2018 «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего». Уфа, 13-17 июня 2018, с.92
3. Гашимова Х.Дж., Аббасов В.А. Основные элементы высокопродуктивного модельного сорта ячменя для орошаемой зоны Нагорного Карабаха. /Yuxari Qrabaq suvarma zonasi ûçûn yüksak mahsuldarligi tamin edan arpa sortu modelinin asas elementlari./ Сб. Трудов НИИ Земледелия, т.ХХ1Х, 2018, 89-92. (азерб.)
4. Фадеева Т.С. 1979. Регенерация у растений как генетический признак /Т.С. Фадеева, О.Г. Козырева, Л.А. Лутова // Исследования по генетике. Л: Изд-во ЛГУ, 1979. -№ 8. - С. 161-170.
5. Brisson N., Gate P., Gouache D., Charmet G.,Oury Fx,Huard F. 2010. Why are wheat yield stagnating in Europe? A comprehensive data analysis for France/ Field Crops Res/ 2010, V. 119, 201-212
6. Carnes M.G.. Wright M.S. Endogenous hor- 7. Investigation of the response of bread wheat
mone levels of immature corn kernels of A188, mis- cultivars to salinity by using callus culture. 2005. / T. souri-17, and DeKalb XL-12. Article in Plant Dokuyucu, S. Akke-ceci, A. Akkaya [at el] // J. Envi-Science, 1988, 57(3):195-203. ron. Biol. - 2005. - Vol. 26. - N 2, 251-255
ИЗМЕНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС ПОСЛЕ IN VIVO ДЕЙСТВИЯ ЦИСПЛАТИНА
Асатрян Ануш Левоновна1,
'научный сотрудник, Ереванский государственный университет Арцруни Ирина Гегамовна2, Матинян Карине Степановна2
2к.б.н. доцент кафедры биофизики, Ереванский государственный университет Геворкян Эмиль Сосевич3
3д.б.н., профессор кафедры биофизики, Ереванский государственный университет
АННОТАЦИЯ
Ингибиторы поли(АДФ-рибозо)полимеразы 1 (ПАРП 1) проходят клинические испытания и применяются в химиотерапии онкологических заболеваний совместно с цисплатином. Настоящая работа посвящена исследованию действия цисплатина на эффективность ингибирования ПАРП 1 в ядрах клеток печени крыс конкурентным (бензамид) и аллостерическим (АТФ) ингибиторами. Исследования проводились на крысах двух возрастных групп, наиболее часто используемых в фармакологических тестах (самцы, 6 и 10 недель). Показано, что активность ПАРП 1 значительно уменьшается в процессе взросления животного. Введение крысам цисплатина вызывает разнонаправленное изменение активности ПАРП 1 у животных исследуемых возрастных групп. Полученные результаты показывают, что степень ингибирования фермента АТФ зависит от его исходной активности. Введение животным цисплатина не вызывает изменения эффективности АТФ в ядрах 6-и недельных крыс, одновременно резко увеличивая ее у 10-и недельных животных. Исследование действия конкурентного ингибитора ПАРП 1 бензамида выявило большую эффективность у крыс старшей возрастной группы, как в контроле, так и после действия цисплатина.
Результаты настоящей работы указывают на необходимость коррекции химиотерапевтических схем с учетом возрастных особенностей действия ингибиторов ПАРП 1 различной природы.
ABSTRACT
Poly(ADP-ribos)yl polymerase 1 (PARP 1) inhibitors currently enter clinical trials and are co-administrated with cisplatin in treatment of patients with oncological diseases.
In present paper we investigated the impact of cisplatin on efficacy of PARP 1 inhibition by competing (ben-zamide) and allosteric inhibitor (ATP) in rat liver nuclei. The rats of two different age groups (males, 6 and 10 week old) were examined (these age groups are examined in routine pharmacological testing). The results come to show that PARP 1 activity is down-regulated in the course of animals growth. The in vivo treatment of rats with cisplatin elicited oppositely directed changes in PARP 1 activity estimated for different age groups. It was demonstrated that the extent of inhibition by ATP depended on the baseline activity of enzyme. Administration of cisplatin to 6 wk old animals did not affect ATP efficiency, concomitantly enhancing the latter in 10 wk old rats. Examination of PARP 1 inhibition by competing inhibitor benzamide revealed its elevated efficiency in elder rats regardless to treatment with cisplatin.
Results of present study necessiate further correction of chemotherapeutic schemes which should consider age-dependent variables in PARP 1 inhibition by different inhibitors.
Ключевые слова: активность ПАРП 1, ингибирование, АТФ, бензамид, цисплатин
Keywords: PARP 1 activity, inhibition, ATP, benzamide, cisplatin
Введение
Поли(АДФ-рибозо)полимераза 1 (ПАРП 1) является хроматин-ассоциированным ферментом, задействованным практически во всех известных механизмах репарации ДНК, и подавление его активности приводит к усилению терапевтического эффекта ДНК-алкилирующих препаратов, применяемых в лечении онкологических больных. В настоящее время ингибиторы ПАРП 1 проходят клинические испытания различных уровней, а при лечении BRCA-дефицитных опухолей применя-
ются в качестве монотерапевтических агентов. Ингибиторы ПАРП 1 часто применяются совместно с цисплатином и темозоламидом [1,2]. Известно, что терапевтический эффект, как и токсическое действие лекарственных препаратов, имеет выраженную возрастную зависимость. Однако действие фармакологических ингибиторов ПАРП 1 в этом контексте мало изучено. Настоящее исследование направлено на изучение действия конкурентного ингибитора ПАРП 1 - бензамида и аллостериче-ского ингибитора-АТФ на активность ПАРП 1 ядер клеток печени крыс 6-и и 10-и недельного возраста
