ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ АШВАГАНДЫ (WITHANIA SOMNIFERA) IN VITRO Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Сельскохозяйственные науки

СЕЛЬСКОХОЗЯЙШИВЕННЫЕ НАУ

КИ

УДК 577.13

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ АШВАГАНДЫ (WITHANIA SOMNIFERA) IN VITRO

АЛРАШИДИ Ашраф Айял, аспирант каф. генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства, [email protected]

КАЛАШНИКОВА Елена Анатольевна, д-р биол. наук, профессор, каф. генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства, [email protected]

КИРАКОСЯН Рима Нориковна, канд. биол. наук, ассистент, каф. генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства, [email protected]

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева

Целью исследований явилось изучение влияния гормонального состава питательной среды на морфогенетический потенциал изолированных тканей ашваганды (Withania somnífera) in vitro. Объектом исследования служили семена и растения-регенеранты ашваганды. Для получения стерильной культуры применяли стерилизацию семян раствором сулемы (хлорид ртути) в концентрации 0,1% в течение 10 минут с последующим культивированием их на безгормональной питательной среде Мурасига и Скуга (МС) с целью получения стерильных проростков и растений. Полученные растения в дальнейшем черенковали и выращивали на среде МС, содержащей различные регуляторы роста: цитокинины (БАП, кинетин), ауксины 2,4-Д (ИУК) в различных концентрациях и сочетаниях. В результате многоплановых экспериментов установлено, что оптимальной питательной средой на этапе микроразмножения является среда, содержащая минеральные соли по прописи Мс, а также БАП в концентрации 0,5 мг/л. В этих условиях средняя высота микропобегов составила 4,7 см, а коэффициент размножения - 13-14, что позволяет получать в течение 6 месяцев культивирования до 20 тыс. шт. микрорастений из одного первичного экспланта. Для быстрого получения хорошо пролиферирующей каллусной ткани целесообразно добавлять в состав питательной среды 2,4-Д в концентрации 2 мг/л в сочетании с кинетином 0,5 мг/л. В этих условиях формируется рыхлая каллусная ткань, которую можно в дальнейшем использовать для получения суспензионной культуры с целью получения веществ вторичного метаболизма. Для получения растений-регенерантов из каллусной ткани необходимо применять БАП в концентрации 0,5 мг/л. Установленные оптимальные условия культивирования позволят с высокой эффективностью получать растения-регенеранты ашваганды - лекарственного растения, источника веществ, обладающих противораковой активностью.

Ключевые слова: withania somnifera, ашваганда, клональное микроразмножение, in vitro, регуляторы роста, микропобеги, каллусная ткань, морфогенез.

Введение

В настоящее время интерес исследователей привлекают лекарственные растения как источник ценных веществ вторичного метаболизма, которые нашли широкое применение в фармакологии, медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и в других областях народного хозяйства. Это связано с тем, что многие из вторичных метаболитов обладают широким спектром действия по отношению к микроорганизмам, фитопатогенам, а также к раковым клеткам. Однако в последнее время наметилась тенденция резкого сокращения численности ценных лекарственных растений, что обусловлено неконтролируемым сбором растительного сырья, ограниченностью ареала их распространения, а также воздействием факторов абиотической и биотической природы. Решить данную проблему возможно за счет при-

менения современных методов биотехнологии, в частности, клонального микроразмножения, а также получения веществ вторичного метаболизма путем выращивания в условиях in vitro кал-лусных или суспензионных культур [4].

Ашваганда (Withania somnifera) или зимняя вишня, индийский женьшень, физалис солнечно-листный, является перспективной культурой для изучения в условиях in vitro, с целью получения витоферина, обладающего противораковым действием. Растение относится к семейству Пасленовые (Solanaceae), в котором насчитывается 84 рода и около 3000 видов, произрастающих по всему миру [5]. Для растений ашваганды в литературе существует много сведений о регенерации видов W. somnifera в культуре in vitro, но, к сожалению, очень мало сообщений об индукции каллусной ткани с использованием в качестве

© Алрашиди А .А, Калашникова Е. А., Киракосян Р. Н., 2017г.

13-

Вестник РГАТУ, № 3 (35), 2017

эксплантатов листьев, стеблей, корней, сегментов гипокотиля и др. Кроме того, в литературе нет публикаций о регенерации растений из первичной и пересадочной каллусной ткани.

Исходя из вышеизложенного, цель данной работы - изучение влияния гормонального состава питательной среды на морфогенетический потенциал изолированных тканей ашваганды (Withania somnífera) в культуре in vitro.

Объекты и методы Объектом исследования служили семена Withania somnifera, а также листовые сегменты, изолированные с растений-регенерантов. Для получения стерильной культуры семена стерилизовали 0,1%-м раствором сулемы в течение 10 минут, трижды промывали дистиллированной водой, после чего их культивировали на безгормональной питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС). На этапе микроразмножения изучали влияние 6-бен-зиламинопурина (БАП) в концентрациях 0,5; 1; 2 и 3 мг/л. Для получения каллусной ткани в питательную среду добавляли вещества с ауксиновой активностью (2,4-Д, ИУК) в различных концентрациях и сочетаниях с цитокининами (БАП, кинетин).

Все исследования проводили в условиях световой комнаты, где поддерживалась температура 250С, 16-ти часовой фотопериод и интенсивность освещения белыми люминесцентными лампами 3,5 тыс.лк. [2].

Учет результатов проводили в конце пассажа, при этом оценивали: число стерильных эксплан-тов (%); количество адвентивных почек на один эксплант (шт); биометрические показатели микрорастений - высота (см) и наличие корневой системы (%); коэффициент размножения; способность соматических клеток к каллусогенезу и морфогенезу.

Все эксперименты были проведены дважды с 25-кратной повторностью. Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием параметрических критериев Стью-дента и Дункана с помощью программы AGROS (версия 2.11), а также стандартных пакетов программы Windows Excel 2010. На диаграммах представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения.

Экспериментальная часть Все исследования по культуре изолированных клеток и тканей растений начинаются с оптимизации условий стерилизации растительных объектов с целью получения хорошо растущей и выровненной стерильной культуры [1]. Полученные результаты показали, что выбранная схема стерилизации позволяет получать в среднем 94,2% сте-

рильных проростков, которые имели на 30-е сутки культивирования среднюю высоту надземной части 2,3 см, и корневой системы - 4,8 см. Полученные таким образом проростки в дальнейшем делили на сегменты стебля с одной пазушной почкой и использовали в экспериментах по изучению влияния гормонального состава питательной среды на микроразмножение, каллусогенез и морфогенез. Основные результаты приведены на рисунках 1-4

■ lili

контрол ь БАП 0,5 БАП 1 мг/л БАП 2 мг/л БАП 3 мг/л мг/л

Рис. 1 - Влияние концентрации БАП на образование адвентивных побегов

Экспериментально установлено, что с увеличением концентрации БАП в питательной среде возрастает коэффициент размножения, который при концентрации 3 мг/л достигал значения 17-18 (рис. 1). Однако в этих условиях формировались сильно витрифицированные, укороченные побеги, высота которых составляла всего 0,5 см (рис. 2). Такие микропобеги в дальнейшем не были способны к размножению. Оптимальным условием для индукции образования адвентивных почек и их последующего роста была среда, содержащая БАП в концентрации 0,5 мг/л. Коэффициент размножения в этом варианте составил 13-14, а средняя высота микропобегов - 4,7 см. Такая способность микропобегов к размножению и росту сохранялась на протяжении всех изучаемых 6 субкультивирований (рис. 3).

6 m О о» 5 40 0 1 4 ае И3- 3 2 т 1 1 <и Я-

1

■

контроль БАП 0,5 БАП 1 мг/л БАП 2 мг/л БАП 3 мг/л мг/л

Рис. 2 - Влияние концентрации БАП на высоту адвентивных побегов

а - контроль, б - 0,5 мг/л, в - 1 мг/л, г - 3 мг/л Рис. 3 - Образование адвентивных побегов на среде МС, содержащей разные концентрации БАП

Сельскохозяйственные науки

Полученные микропобеги в дальнейшем были использованы в качестве донора листовых пластинок, которые были использованы в исследованиях по каллусогенезу и морфогенезу. Так, в экспериментах по получению каллусной ткани нами установлено, что с увеличением концентрации 2,4-Д в питательной среде возрастает способность соматических клеток к формированию каллуса рыхлой консистенции, а замена 2,4-Д на ИУК стимулировала, как правило, образование каллуса плотного типа (рис. 4).

б - на среде с ИУК

Рис. 4 - Каллусная ткань, полученная из листовых эксплантов растений-регенерантов ашваганды

Кроме того, отмечено, что начало образования каллусной ткани различно, и этот процесс находится под контролем исследуемых гормонов и их концентраций. Так, на среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 2 мг/л калллусогенез был отмечен уже на 4-е сутки с начала культивирования, в то время как при концентрации этого гормона 1 мг/л образование каллуса начиналось только на 10-е сутки. Что касается замены 2,4-Д на ИУК, то в этом случае начало каллусогенеза было отмечено лишь на 23-и сутки. Следует отметить, что увеличение концентрации 2,4-Д в питательной среде приводило к значительному усилению про-лиферативной активности каллусной ткани. Причем, максимальный прирост каллуса был отмечен в варианте, где 2,4-Д присутствовал в питательной среде в концентрации 2 мг/л.

При изучении морфогенеза каллусной ткани разными авторами показано, что начало морфогенеза в первичной каллусной ткани зависит от исследуемого гормона и его концентрации [3]. Нами установлены некоторые закономерности в морфогенетических процессах каллусной ткани: с увеличением концентрации цитокининов дифференциация меристематических очагов наступает раньше на 7 и 3 суток при использовании БАП и кинетина, соответственно. Причем, дополнительное внесение в питательную среду ауксина (ИМК) не оказало существенного влияния на скорость морфогенеза. Кроме того, показано, что с повышением концентрации гормонов в питательной среде среднее количество образовавшихся адвентивных почек на один каллус также возрастает.

При анализе биометрических показателей адвентивных побегов нами было установлено, что высокие концентрации цитокининов способствуют формированию укороченных микропобегов, высота которых не превышает 0,3-0,5 см, в то время как при концентрации 0,5 мг/л БАП учитываемый показатель был 2,5-3 см.

Заключение

Таким образом, в результате многоплановых экспериментов установлено, что оптимальной питательной средой на этапе микроразмножения является среда, содержащая минеральные соли по прописи МС, а также БАП в концентрации 0,5 мг/л. Для быстрого получения хорошо пролиферирую-щей каллусной ткани целесообразно добавлять в состав питательной среды 2,4-Д в концентрации 2 мг/л в сочетании с кинетином 0,5 мг/л, а для получения растений-регенерантов применять БАП в концентрации 0,5 мг/л. Подобранные условия культивирования каллусной культуры были применены нами в последующих экспериментах по получению суспензионной культуры Withania somnífera.

Список литературы

1. Алтанцэцэг, Э. Размножение астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) в условиях in vitro. / Э. Алтанцэцэг, Е. А. Калашникова // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 6. - С. 40-48.

2. Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии / Е. А. Калашникова, Е. З. Кочиева, О. Ю. Миронова. - М. : КолосС. -2006. - 162 с.

3. High frequency plant regeneration in Ashwagandha (Withania somnifera (L.) Dunal): an important medicinal plant / B. Govindraju, R. Ramgopal, R.B. Venugopal, S.G. Kiran, C.P. Kaviraj, R. Srinath // Plant Cell Biotech. Mol. Biol. - 2003. - № 4 (1-2). - Р. 49-56.

4. Hina, T. Appraisal of an important Flavonoid, Quercetin, in callus cultures of Citrullus colocynthis / T. Hina, S. Ali, M.R. Asi // International Journal of Agriculture and Biology. - 2012. - №14(4). - С. 528532.

5. Singh, S. Withania somnifera: The Indian Ginseng Ashwagandha / S. Singh; S. Kumar // Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants: Lucknow, India. - 1998. - 293 р.

Вестник РГАТУ, № 3 (35), 2017

THE INFLUENCE OF CULTURE CONDITIONS ON THE MORPHOGENESIS OF TISSUE CULTURE ASHWAGANDA (WITHANIA SOMNIFERA) IN VITRO

Alrashidi Ashraf A., postgraduate student, Department of Genetics, Biotechnology, Breeding and Seed Production, [email protected]

Kalashnikova Elena A., Doctoral Sciences (Biol.), Professor, Department of Genetics, Biotechnology, Breeding and Seed Production, [email protected]

Kirakosyan Rima N., PhD (Biol.) Sciences, [email protected] RSAU-MTAA named after K. A. Timiryazev, Moscow

The research aim was to study the influence of a nutrient medium hormonal composition on morphogenetic potential of Aswanaganda isolated tissues (Withania somnifera) in vitro. The research object was ashwaganda seeds and plants-regenerants. To obtain a sterile culture, seeds were sterilized with a solution of mercuric chloride at a concentration of 0.1% for 10 minutes, followed by their cultivation on the Murashige and Skoog (MS) hormone-free nutrient medium to get sterile shoots and plants. The plants obtained were subsequently grafted and grown on MS medium containing various growth regulators: cytokinins (BAP, kinetin), auxins 2.4-D, IAA) in various concentrations and combinations. As a result of many-sided experiments it was found that the most optimal nutrient medium at the stage of micropropagation is the medium containing mineral salts according to the MS recipe, as well as BAP at a concentration of 0.5 mg /l. Under these conditions the average micro-shoot height was 4.7 cm, and the multiplication factor was 13-14, which allows obtaining within 6 months of cultivation, up to 20,000 micro-plants from one primary explant. To obtain quickly a well proliferating callus tissue, it is advisable to add 2.4-D to the medium at the concentration of 2 mg /l in combination with kinetin of 0.5 mg /l. Under these conditions a loose callus tissue is formed, which can later be used to produce suspension culture in order to obtain secondary metabolism substances. To get regenerating plants from callus tissue, it is necessary to apply BAP at a concentration of 0.5 mg /l. The established optimal conditions for cultivation will make it possible to obtain regenerating plants of ashwagandha, as a medicinal plant and a source of substances with highly efficient anticancer activity.

Key words: withania somnifera, ashwaganda, clonal micropropagation, in vitro, growth regulators, microshoots, callus tissue, morphogenesis.

Literatum

1. Altancjecjeg, Je. Razmnozhenie astragala mongol'skogo (Astragalus mongholicus Bge.) v uslovijah in vitro. / Je. Altancjecjeg, E.A. Kalashnikova // Izvestija Timirjazevskoj sel'skohozjajstvennoj akademii. - 2013. - № 6. - S. 40-48.

2. Kalashnikova, E.A. Praktikum po sel'skohozjajstvennoj biotehnologii. / E.A. Kalashnikova, E.Z. Kochieva, O.Ju. Mironova - M.: KolosS. - 2006. - 162 s.

3. Govindraju, B. High frequency plant regeneration in Ashwagandha (Withania somnifera (L.) Dunal): an important medicinal plant. / B. Govindraju, R. Ramgopal, R.B. Venugopal, S.G. Kiran, C.P. Kaviraj, R. Srinath // Plant Cell Biotech. Mol. Biol. - 2003. - 4 (1-2) - Р. 49-56.

4. Hina, T., Ali, S., Asi, M.R. Appraisal of an important Flavonoid, Quercetin, in callus cultures of Citrullus colocynthis / T. Hina, S. Ali, M.R. Asi // International Journal of Agriculture and Biology. - 2012. - №14(4). -С.528-532.

5. Singh, S. Withania somnifera: The Indian Ginseng Ashwagandha / S. Singh; S. Kumar // Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants: Lucknow, India. - 1998. - 293 р.

УДК 636.087.72+612.3+612.12

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ У ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ КЛИНОПТИЛОЛИТА НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ

БОГОЛЮБОВА Надежда Владимировна, канд. биол. наук, рук. отдела физиологии и биохимии с.-х. животных, [email protected],

РОМАНОВ Виктор Николаевич, канд. биол. наук, доцент, вед. научн. сотрудник отдела физиологии и биохимии с.-х. животных

ДЕВЯТКИН Владимир Анатольевич, канд. с.-х. наук, ст. научн. сотрудник отдела физиологии и биохимии с.-х. животных

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт имени академика Л.К.Эрнста»

От полноценного функционирования рубца в значительной степени зависит здоровье и продуктивность животных. Ведущая роль в протекании процессов рубцового пищеварения отводится популяции микроорганизмов. Их непрерывный рост обеспечивается периодическим поступлением

_© Боголюбова Н. В., Романов В. Н., Девяткин В. А., 2017г._