CC BY
38
Биомедицина . № 3, 2017, С. 82-94
Влияние ультрадисперсных систем на основе комплексов сукцинамида хитозана с коллоидными частицами йодида серебра на иммунологическую реактивность
Л.А. Шарафутдинова1, М.В. Базунова1, Е.И. Кулиш1, H.H. Курчатова2, В.Г. Шамратова1, З.Р. Хисматуллина1, М.Р. Даминов1
1 - ФГБОУВО «Башкирский государственныйуниверситет», Уфа
2 - Всероссийский центр глазной и пластической хирургии МЗ РФ, Уфа
Контактная информация: Шарафутдинова Люция Ахтямовна, [email protected]
В статье представлены результаты исследования влияния натриевой соли - сукцинамида хитозана (СХТЗ) (5%) и дисперсий СХТЗ с коллоидными частицами йодида серебра CXT3:AgJ (исходная концентрация СХТЗ - 5%, в объёмном соотношении исходных компонентов 1:1) на активационные процессы иммунокомпетентных клеток человека in vitro. Показано, что растворы СХТЗ и дисперсии CXT3:AgJ повышают фагоцитарно-метаболические характеристики нейтрофилов, вызывают умеренное повышение экспрессии активационных рецепторов CD25+, CD95+ и HLA-DR+ на лимфоцитах, увеличивают пролиферативную активность лимфоцитов наряду с возрастанием количества клеток с внутриклеточными признаками апоптоза.
Ключевые слова: хитозан, коллоидные частицы йодида серебра, фагоцитарная активность лейкоцитов, пролиферативная активность лимфоцитов.
Введение
В последние годы активно ведутся исследования по созданию систем направленной доставки лекарственных препаратов пролонгированного действия. В качестве матриц для создания таких систем часто используются нанораз-мерные системы на основе природных и синтетических биодеградируемых биосовместимых полимеров, в т.ч. хитозана (ХТЗ) и его производных [2, 12, 13, 16].
Одним из подходов к созданию стабильных нано структурированных дисперсных систем с регулируемыми размерами может быть использование способности макромолекул к самосборке путем межмолекулярной ассоциации через нековалентные связи - на приме-
ре полимер-коллоидных комплексов (ПКК) ХТЗ и его производных (например, натриевой соли сукцинамида хитозана, СХТЗ) с неорганическими коллоидными частицами лиофобных золей (например, золя йодида серебра) [14]. Результаты многочисленных исследований показывают, что препараты на основе полисахаридов проявляют иммуномодулирующее, антибактериальное, антиоксидантное, гиполипиде-мическое, ранозаживляющее действие [3,4, 6,8,21].
Коллоидные неорганические частицы лиофобных золей могут выступать в качестве ядра при капсулировании малорастворимых лекарственных веществ с использованием нано- и микроразмер-
ных контейнеров. Для материалов на основе наноразмерных частиц серебра и его соединений возможен широкий спектр медицинского применения [17, 18]. Так, известно, что в низких дозах наночастицы серебра стимулируют восстановительные процессы в тканях живых организмов, улучшают энергетический обмен, обладают хорошим иммуномодулирующим и антибактериальным действием [29]. Более перспективными для применения являются га-логениды серебра - в частности, йодид серебра, частицы которого отличаются отсутствием мутагенного действия и не оказывают дестабилизирующего действия на мембраны клеток [23].
Целью данной работы явилось исследование влияния образцов р-ров СХТЗ и СХТЗ с коллоидными частицами йодида серебра на активационные процессы иммунокомпетентных клеток человека.
В настоящей работе представлены результаты исследования иммуномоду-лирующих свойств гибридных полимерных комплексов на основе натриевой соли - сукцинамида хитозана. В качестве модельных систем для исследования биологических свойств исследуемых соединений использована культура мононуклеаров периферической крови человека. Проведены сравнительные исследования фагоцитарно-метаболических характеристик нейтрофильного звена иммунитета как важного показателя неспецифической резистентности организма, количественной оценки про-лиферативной активности лимфоцитов и апоптоза. Оценка действия указанных соединений на функцию иммунокомпетентных клеток человека может
быть полезна с точки зрения расширения представлений об иммунотропных свойствах полимер-коллоидных комплексов СХТЗ и СХТЗ с золем AgJ.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования использовали СХТЗсМ.м.=207кДаихарак-теристической вязкостью [п]=3,60 дл/г (ТУ 9284-027-11734126-08) производства ЗАО «Биопрогресс» (г. Щелково, Россия).
Йодид серебра является чрезвычайно малорастворимым веществом и в водных средах обычно используется в виде коллоидного р-ра (золя). Учитывая тот факт, что с увеличением суммарной межфазной поверхности частиц биологическая активность золя повышается, а агрегативная устойчивость системы снижается (вследствие большой поверхностной энергии и небольшого их заряда) [9], были определены условия, позволяющие получить агрегативно устойчивые золи йодида серебра с малым средним размером частиц и высокой межфазной поверхностью [25]. Для получения р-ра с высоким количеством частиц размером 50-60 нм, входящего в интервал истинно-коллоидных систем и обладающего максимальной межфазной поверхностью, смешивали 0,01 Н р-ра нитрата серебра и 0,01 Н р-ра иодида калия в объемном соотношении 7:10 (AgJ-1) (концентрация частиц дисперсной фазы - 0,004 моль/л).
Для получения дисперсий полимер-коллоидных комплексов СХТЗ с золем AgJ использовали два способа. В первом, к р-ру СХТЗ исходной концентрации 0,1, 0,2 или 1% ма. добавляли золь AgJ в различном объемном соотношении компонентов. При использовании
второго способа навеска СХТЗ растворялась в заранее синтезированном золе. Растворение осуществлялось путём магнитного перемешивания при комнатной температуре в течение 24 ч.
В качестве модельной системы для оценки влияния образцов р-ров СХТЗ и СХТЗ с коллоидными частицами йодида серебра на активационные процессы иммунокомпетентных клеток человека использовалась культура мононукле-аров периферической крови человека, поскольку эти клетки контактируют с лекарственными препаратами при внутривенном или любом другом способе введения. Для выделения клеток использовали гепаринизированную кровь 10-ти здоровых доноров-волонтеров, не имеющих в анамнезе проявлений инфекционного, аутоиммунного и аллергического симптомов. Все доноры относились к одной возрастной группе - 25-30 лет.
Для подбора оптимальной дозы гибридных полимерных комплексов на основе натриевой соли - сукцинамида хитозана проводили культивирование клеток крови здоровых доноров в 24-лу-ночных планшетах в С02-инкубаторе (37°С, 5% С02) в течение 24 и 72 ч. По истечении срока культивирования клетки собирали и оценивали стимулирующее действие гибридных полимерных комплексов на основе натриевой соли -сукцинамида хитозана (1, 2, 5, 5, 10, 15 и 20 мкг/мл) по пролиферации клеток. Полученные показатели сравнивали с контрольными культурами клеток (без добавления исследуемых образцов) и с "положительным контролем". В качестве контрольных образцов использовались стимулятор митогенеза Т-лимфо-цитов КонА, 10мкг/мл, и В-клеточный митоген лаконоса (МЛ), 5 мкг/мл. В
культурах лимфоцитов здоровых доноров было обнаружено, что добавление гибридных полимерных комплексов на основе натриевой соли - сукцинамида хитозана приводит к усилению пролиферации клеток, начинающемуся с 24-х ч культивирования и достигающему максимума к 72-му ч культивирования. Исследуемые р-ры вызывали повышение митогенеза лимфоцитов в культуре, оцениваемое по индексу стимуляции (ИС), но не превышали показатели. Наиболее выраженное действие в стимуляции клеточного роста показала концентрация 2,5 мкг/мл. Поэтому для проведения дальнейших исследований была выбрана именно эта доза.
Оценку фагоцитарной активности нейтрофилов определяли по способности клеток поглощать частицы латекса (диаметр частицы 1,49 мкм). Кровь (40 мкл) инкубировали с равным объемом суспензии латекса с добавлением исследуемых образцов р-ров СХТЗ и СХТЗ с коллоидными частицами йодида серебра (2,5 мкг/мл) при температуре 37°С 30 мин в лунках полистеролового кру-глодонного планшета, центрифугировали и ресуспендировали в 20 мкл фос-фатно-солевого буферного р-ра (ФСБР). Переносили суспензию клеток на предметные стекла, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали 0,5% р-ром нейтрального красного. Учет результата проводили в световом микроскопе под иммерсией (10х100) путем просматривания 200 клеток. Определяли фагоцитарный индекс (ФИ - процент поглотивших объекты лейкоцитов из числа потенциальных фагоцитов клеток) и фагоцитарное число (ФЧ - среднее количество поглощенных частиц в пересчёте на один фагоцит).
Определение общей окислительно-восстановительной активности нейтрофилов в тесте восстановления нитросинего тетразолия проводили традиционным способом [11]. Для постановки реакции в лунки полистероло-вого круглодонного планшета к 40 мкл крови добавляли 40 мкл 0,1% р-ра нитросинего тетразолия фирмы «Sigma» (спонтанный НСТ-тест). Для постановки стимулированного НСТ-теста к такому же объему крови добавляли р-р НСТ и индуктор кислородного взрыва (зимозан). Суспензии клеток инкубировали при 37°С 30 мин с добавлением исследуемых образцов (р-ров СХТЗ и дисперсий на основе ПКК СХТЗ с AgJ), центрифугировали и ресуспенди-ровали в 20 мкл ФСБР, переносили суспензию клеток на предметные стекла, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали 0,5% р-ром нейтрального красного. Учет результата проводили в световом микроскопе под иммерсией (10x100) путем просматривания 200 клеток и определяя процент положительно прореагировавших клеток на 100 фагоцитов как в спонтанном, так и в стимулированном тесте. В каждом мазке подсчитывали количество нейтрофилов, среди которых определяли процент клеток, содержащих включения дифор-мазана. Индекс активации нейтрофилов (ИАН) рассчитывали по формуле [10]: ИАН=(Ах0+Вх1+Сх2+0х3)/100, где А - количество клеток, не содержащих диформазановых включений; В, С и D - количество клеток, содержащих гранулы диформазана в тех или иных количествах.
Для определения активационных рецепторов CD25+, CD95+ и HLA-DR+ использовались моноклональные
антитела CD25+, CD95+ и HLA-DR+ (Caltag). Лимфоциты выделялись и культивировались с добавлением образцов р-ров CXT3 и дисперсий CXT3 с коллоидными частицами йодида серебра, а затем окрашивались моноклональными антителами в соответствии с требованиями фирмы-производителя. Результаты учитывались на однолазерном проточном цитофлюориметре FACSCalibur («Becton Dickinson», США).
Оценку пролиферативной активности лимфоцитов проводили с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) in vitro. В данной работе применялся вариант постановки РБТЛ с использованием проточного ци-тофлюориметра по методу, описанному в работе [27]. В качестве исследуемого материала использовались выделенные на градиенте плотности мононуклеа-ры периферической крови человека, культивируемые в питательной среде с добавлением соответствующих мито-генов. Для оценки состояния функциональной активности лимфоцитов учитывали процент выявленных бластов.
Оценка апоптоза лимфоцитов проводилась с использованием метода окрашивания ДНК йодистым пропиди-ем [19] при помощи проточного цитоф-люориметра. Процедура окрашивания проводилась в стандартных пробирках для цитометрии. Клетки отмывали после этанола ФСБР и ресуспендировали в красящем р-ре, содержащем 0,005% йодистого пропидия, 0,1% цитрата натрия, 0,1% тритона X100. Непосредственно перед проведением процедуры к красящему р-ру добавляли РНК-азу (Sigma) в концентрации 50 мкг/мл для удаления примесей двуспиральной РНК в образцах. Анализ полученных образцов про-
водили в проточном цитофлюориметре (FL3, >600 нм), с использованием логарифмического канала флюоресценции.
Математико-статистическую обработку данных производили с использованием лицензионного пакета прикладных программ Statistica 7.0 («Stat Soft Inc.», США). В модуле «Основные статистики» («Basic Statistics») по всем изученным количественным показателям были подсчитаны следующие основные характеристики: выборочное среднее (среднее арифметическое, Mean), стандартная ошибка среднего (standard error of mean) и стандартное отклонение (standard deviation).
Для всех выборок проводили анализ соответствия вида распределения количественных признаков закону нормального распределения с помощью кри-
терия Шапиро-Уилка ^Ьарко^Пк'з Поскольку распределение признаков в группах являлось нормальным, сравнительный анализ групп проводился с помощью параметрических методов (^критерий Стьюдента). Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Количественные данные в таблице представлены в виде M±Sd, где М - выборочное среднее, Sd - стандартное отклонение.
Результаты и их обсуждение
Важным показателем состояния неспецифической резистентности организма являются характеристики фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов.
Результаты проведенного исследования показали (табл. 1), что р-ры СХТЗ
Таблица 1
Показатели фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов при действии р-ра СХТЗ концентрацией 5% мас. и дисперсий СХТЗ:А§1 (исходная концентрация СХТЗ 5%) в объёмном соотношении исходных компонентов 1:1
Группа Фагоцитарная активность нейтрофилов Mx±Sd (n=10) Кислородзависимый метаболизм нейтрофилов Mx±Sd (n=10)
Фагоцитарный индекс, % Фагоцитарное число Спонтанная активность Зимозан-активированная активность
НСТ-спонтанные нейтрофилы, % ИАН спонтанный НСТ-индуцированные нейтро-филы,% ИАН индуцированный
Контроль 56,10±2,10 6,74±0,41 8,60±0,42 0,15±0,01 47,80±2,62 0,69±0,04
СХТЗ 5% 59,60±2,34 7,54±0,42 14,50±1,3 * 0,28±0,03 * 55,20±1,30 * 1,17±0,03 *
CXT3:AgJ 5% 1:1 65,10±2,53 *# 8,62±0,46 *# 21,40±2,25 *# 0,51±0,05 *# 68,3±2,04 *# 1,44±0,03 *#
Примечание: * - статистически значимое отличие по сравнению с контрольной группой, # - статистически значимое отличие по сравнению с группой СХТЗ 5%.
и дисперсии CXT3:AgJ увеличивают количество активных фагоцитов, о чем свидетельствует повышение фагоцитарного индекса и показателя интенсивности фагоцитоза - фагоцитарного числа. Причем более выраженное повышение указанных показателей по сравнению с контролем (ФИ - 56,10±2,10; ФЧ -6,74±0,41) выявлено в ответ на инкубацию клеток с CXT3:AgJ: ФИ составил 65,10±2,53%; ФЧ - 8,62±0,46 (р<0,05).
При анализе результатов спонтанного HCT-теста установлено, что исследуемые образцы усиливают метаболическую активность нейтрофилов, причем обнаружено статистически значимое повышение числа активных фагоцитов в ответ на инкубацию с CXT3:AgJ (р<0,05). Так, если в контроле описываемый показатель составил 8,60±0,42%, то в группе CXT3:AgJ - 21,40*2,25%.
Добавление индуктора респираторного взрыва (зимозана) вызывает увеличение количества диформазан-по-зитивных клеток и уровня активности оксидативных процессов в этих клетках по сравнению с контролем, где процент индуцированных фагоцитов составил 47,80±2,62, тогда как в группе CXT3 -55,20*1,30%, а в группе CXT3:AgJ -68,3±2,04; индекс активности нейтрофилов в контрольной группе - 0,69*0,04, и в группах CXT3 и CXT3:AgJ - 1,17*0,03 и 1,44*0,03 соответственно.
Cледовательно, можно сделать вывод о том, что проведенный индуцированный тест с HCT, позволяющий оценить функциональный резерв кислородзави-симого механизма бактерицидности фагоцитов, свидетельствует о сохранении внутриклеточной антибактериальной активности в фагоцитах при добавлении исследованных образцов.
Интересным моментом является тот факт, что испытанные образцы, усиливая оксидативность нейтрофилов, действуют очень мягко, поскольку количество диформазан-позитивных нейтрофилов не выходит за пределы нормальных значений, оцениваемых у здоровых людей (1-9%). Это очень важно, поскольку известно, что избыточная активация метаболитов кислорода, генерируемых гранулоцитами и моноцитами, может привести к повреждению мембран клеток в организме, репарации ДНК клеток, что ведёт к деструктуризации тканей и конечном итоге повышает риск развития аутоиммунных процессов [7].
Таким образом, влияние р-ров СХТЗ и дисперсий на основе ПКК СХТЗ с AgJ на фагоцитарно-метаболические характеристики нейтрофильного звена иммунитета можно оценить как стимулирующее.
Лимфоциты - единственный тип клеток крови, для которых пролиферация в периферических тканях является физиологической нормой и обязательным этапом в развитии иммунного ответа. Поэтому количественная оценка пролиферативной активности лимфоцитов в спланированных экспериментальных условиях может служить мерой реактивности лимфоцитов на тот или иной внешний стимул. Процесс активации лимфоцита, исходом которого является клональная экспансия, или пролиферация, начинается с экспрессии активаци-онных рецепторов на мембране клетки.
Одним из важнейших маркёров, появляющихся на клетках и служащих признаком активации лимфоцитов, является рецептор к ИЛ-2 - СБ25+. Этот рецептор экспрессирует на себе акти-
вированные Т-лимфоциты, стимулирующие антителообразование и цито-токсичность. В нашем исследовании мы провели оценку уровня экспрессии рецептора CD25+, результаты которой представлены в табл. 2. В работе мы использовали часовую инкубацию выделенных мононуклеаров с исследуемыми образцами СХТЗ.
Анализ уровня экспрессии рецептора CD25+ показал увеличение этого показателя при добавлении СХТЗ и CXT3:AgJ, причем более существенное - при инкубации с CXT3:AgJ (19,9*0,5% против 15,7±1,3% в контроле, р<0,05).
Одновременно определялась экспрессия иммунокомпетентными клетками антигена CD95+, указывающего на готовность к программируемой клеточной гибели в случае необходимости устранения избытка активированных клеток, а также клеток с нарушенной генетической программой. Результаты исследования показали повышение экспрессии активационных рецепторов CD95+, при этом более существенное - при культивировании в среде с CXT3:AgJ 5% 1:1 (21,01±0,95% против 18,2±1,25% в контроле, р<0,05).
Определение экспрессии маркеров поздней и длительной активации лейкоцитов - HLA-DR+ продемонстрировало
повышение указанного показателя как в случае культивирования с СХТЗ, так и CXT3:AgJ.
Для правильного понимания формирования полного иммунного ответа на попавший в организм антиген необходимо хорошо представлять, какие процессы развиваются в клетке после этого события и какую роль играют кооперативные взаимодействия различных популяций клеток (лимфоциты, макрофаги).
При попадании в организм антигена происходит активация лимфоцитов, под которой понимают серию событий, происходящих в покоящихся клетках, в результате которых лимфоциты стимулируются. Это процесс, на котором базируются практически все иммунологические реакции. Пролиферация служит главнейшей предпосылкой иммунного ответа, т.к. на стимулятор реагирует небольшое число клеток, и для развития достаточно интенсивной реакции необходимо их дополнительное размножение.
В данной работе в качестве активатора иммунокомпетентных клеток использовали образцы CXT3 и CXT3:AgJ. Анализ пролиферативной активности лимфоцитов проводился в реакции бласттрансформации лимфоцитов (ET)
Показатель Контроль СХТЗ 5% СХТЗ^ 5% 1:1
Экспрессия CD25+,% 15,7±1,3 16,1±0,9 19,9±0,5*
Экспрессия CD95+,% 18,2±1,25 19,04±0,68 21,01±0,95*
Экспрессия HLA-DR+,% 3,9±0,35 4,6±0,2 4,21±0,33
Tаблица 2
Экспрессия CD25+, CD95+ и HLA-DR+ при инкубации р-ра СХТЗ концентрацией 5% мае. и дисперсий CXT3:AgJ (исходная концентрация СХТЗ 5%) в объёмном соотношении исходных компонентов 1:1
Примечание: * - статистически значимое отличие по сравнению с контрольной группой.
с использованием проточного цитофлю-ориметра БТ - это способность лимфоцитов пролиферировать и делиться в ответ на воздействие митогенов. При этом происходит превращение лимфоцитов в бласты - большие пиронинофильные клетки, способные к пролиферации и дифференцировке, что приводит к увеличению в лимфоидной ткани количества реагирующих клеток.
Поскольку результаты исследования показали, что СХТЗ и его соединение с йодидом серебра вызывают умеренное повышение экспрессии активационных рецепторов СБ25+, СБ95+ и НЬА-ВЯ+ на лимфоцитах уже через 1 ч после их добавления в культуру, большой интерес для исследования представляло определение судьбы активационных сигналов через 24 ч воздействия (начало изменений внутри клетки) и через 72 ч после воздействия, когда ответ клетки на стимулятор достигает своего максимального значения.
Результаты суточного культивирования мононуклеаров с р-рами СХТЗ и СХТЗ:АgJ (табл. 3) убедительно демонстрируют их действие на иммунные
клетки как стимулирующее (пролиферация), о чем свидетельствует повышение количества бластных клеток в культуре. При этом возрастает количество клеток с признаками деструкции ядра, выявляемое флюорохромами, что может свидетельствовать о процессе позитивной активации клеток, вызванной митоген-индуцирующими свойствами исследуемых образцов. Так, через сутки инкубирования количество клеток увеличивается (р<0,05) как при добавлении СХТЗ 5% (16,29*1,60%), так и СХТЗ^ 5% (16,22*1,65%), тогда как в контроле этот показатель составил 11,14*1,10%. Аналогичная картина наблюдается и через 72 ч культивирования: количество клеток статистически значимо выше при добавлении в среду испытываемых образцов (р<0,05).
В последние годы стало очевидным, что развитие многих иммунопатологических состояний обусловлено нарушением функционирования клеток иммунной системы, процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов. Доказано, что при врожденных и приобретенных иммунодефицитных
Таблица 3
Пролиферативная активность и апоптоз лимфоцитов при добавлении р-ра СХТЗ концентрацией 5% мас. и дисперсий СХТЗ:А§1 (исходная концентрация СХТЗ 5%) в объёмном соотношении исходных компонентов 1:1 через 24и78ч культивирования, %
Группа Пролиферация, 24 ч, % Mx±Sd (П=10) Апоптоз, 24 ч,% Mx±Sd (П=10) Пролиферация, 72 ч, % Mx±Sd (П=10) Апоптоз, 72 ч, % Mx±Sd (П=10)
Контроль 11,14±1,10 2,93±0,23 13,83+1,26 3,35+0,19
СХТЗ 5% 16,29±1,60* 3,63±0,27 17,94±1,21* 3,91+0,31
СХТЗ:AgJ 5% 16,22±1,65* 4,29±0,32*# 15,19±1,09*# 5,36±0,24*#
Примечание: * - статистически значимое отличие по сравнению с контрольной группой; # - статистически значимое отличие по сравнению с группой СХТЗ 5%.
состояниях, аутоиммунных заболеваниях, аллергиях нарушены функции Т-лимфоцитов, осуществляющих регуляцию эффекторных иммунных реакций в организме. Результаты проведенного нами исследования убедительно демонстрируют, что введение образцов СХТЗ 5% и СХТ3^1 в культуру клеток оказывает стимулирующее влияние на пролиферативную активность Т-лимфоцитов в реакции бластной трансформации.
Активационные процессы, происходящие в организме, результатом которых является достижение конкретной цели -пролиферация и накопление определённого клона клеток - неразрывно связаны с альтернативными механизмами, которые приводят к клеточной гибели. Отдельная клетка может погибнуть как в результате некроза, вызванного прямым повреждающим действием окружающей среды, так и в результате программируемой клеточной смерти или апоптоза.
В связи с этим представляла интерес оценка программированной клеточной гибели лимфоцитов - апоптоза. В данной работе использовался метод оценки апоптоза по структурным изменениям ядерной ДНК путем окрашивания клеток йодистым пропидием.
При суточном культивировании мо-нонуклеаров с исследуемыми образцами было показано, что количество клеток с внутриклеточными признаками апоптоза увеличивается к третьим суткам и достигает значений 3,91±0,31% и 5,36±0,24 в группах СХТЗ 5% и СХТ3:AgJ против 3,35±0,19 в контроле. Причем более выраженная реакция наблюдалась в случае культивирования с СХТЗ^ (р<0,05).
Сопоставляя полученные данные с результатами оценки пролиферативной активности, следует отметить, что к третьим суткам культивирования сохраняется высокое количество пролифери-рующих клеток в культурах культивирования, и к этому же сроку начинают работать механизмы программированной гибели клеток, что выражается в увеличении количества лимфоцитов с внутриклеточными признаками апоптоза. Этот факт является отражением физиологических процессов обеспечения нормального баланса клеток иммунной системы и их взаимодействия между собой и факторами окружающей среды.
Программированная клеточная смерть путем апоптоза рассматривается в настоящее время как основной механизм поддержания иммунного го-меостаза, играющего ключевую роль в регуляции численности иммунокомпе-тентных клеток, их созревания и диффе-ренцировки Т- и В-клеток, обеспечения адекватной силы и продолжительности иммунного ответа, сохранения ауто-толерантности [22, 24, 28]. Благодаря апоптозу в организме обеспечивается баланс между пролиферацией клеток, их дифференцировкой и элиминацией. В ходе иммунного ответа путём апоптоза удаляются лимфоциты, не получившие адекватного стимула и не способные выполнить свою функцию, а по завершении иммунного ответа необходимо избавиться от большого числа активированных клеток, которые опасны в плане развития аутоагрессии и повреждения собственных тканей. «Дефицит» апоптоза является важным звеном патогенеза многих аутоиммунных реакций и причиной лимфопроли-феративной патологии, а преобладание
апопотоза иммунокомпетентных клеток приводит к нарушениям иммунологической защиты [20]. Нарушения механизмов программированной клеточной смерти иммунокомпетентных клеток нередко лежат в основе иммунотоксично-сти ксенобиотиков [10, 15]. Выяснение характера влияния изучаемых соединений на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов представляется весьма важным для понимания механизмов иммуномодулирующего действия полисахаридов.
В результате проведенного нами исследования показана сбалансированная реакция между пролиферацией и программированной клеточной гибелью, она может рассматриваться как находящаяся под контролем иммунной системы для обеспечения необходимых регу-ляторных процессов.
Полученные в ходе работы данные позволяют заключить, что полимер-коллоидные комплексы натриевой соли -сукцинамида хитозана с неорганическими коллоидными частицами золя йодида серебра оказывают иммуномо-дулирующий эффект. Хорошо известно, что в низких дозах наночастицы серебра стимулируют восстановительные процессы в тканях живых организмов, улучшают энергетический обмен, обладают хорошим иммунотропным и антибактериальным действием. Частицы йодида серебра отличаются отсутствием мутагенного действия и не оказывают дестабилизирующего действия на мембраны клеток [23, 30]. Однако Ag0 начинает проявлять антимикробные свойства только после поверхностного окисления, т.е. при образовании ионов Ag+ [30]. К тому же, водорастворимые соли серебра в некоторой степени ток-
сичны и могут вызывать аргирию. В связи с этим в нашей работе использованы более перспективные для применения в медицине соединения - галогени-ды серебра. Возможно, обнаруженный нами иммуномодулирующий эффект комплекса CXT3:AgJ достигается присутствием сукцинамида хитозана, выбранного в качестве наностабилизиру-ющего компонента, предотвращающего агрегацию наночастиц и обладающего комплексом уникальных свойств, среди которых - биосовместимость, биодегра-дируемость, антибактериальное и анти-оксидантное действия.
Все вышесказанное аргументирует целесообразность применения гибридных полимерных комплексов натриевой соли - сукцинамида хитозана с неорганическими частицами золя йодида серебра в составе средств направленной доставки лекарственных препаратов или исходных систем для получения полимерных композиционных материалов биомедицинского назначения (раноза-живляющих покрытий в виде гелей и плёнок, матриксов для тканевой инженерии и др.).
Список литературы
1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. - М.: Эдито-риал УРСС. 2002. 320 с.
2. Болотова Г.В. Полимерные носители для противотуберкулёзных лекарственных средств на основе хитозана // Молодой учёный. 2010. № 5 (16). T. 2.
3. Быков В.П. Состояние и перспективы развития производства хитина, хитозана и продуктов на их основе из панциря ракообразных // Материалы 5-й конф. «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». - М.: ВНИРО. 1999. С. 12-15.
4. Бычков A.B., Быкова В.М., Кривошеина Л.И. Применение «Хитана» в клинической практике // Современные перспективы в ис-
следовании хитина и хитозана / Мат-лы 7-й Междунар. конф. / Под ред. В.П. Варламова и др. - М.: ВНИРО. - 2003. - С. 156-157.
5. Гамзазаде А.И. Производные хитина/хитоза-на контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов: Автореф. дисс. ... д.х.н. - М. 2005. 48 с.
6. Гамзазаде А.И., Насибов С.М., Лукин О.В. Антибактериальная активность хитозанов / Мат-лы 8-й Междунар. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Казань. 2006. С. 183-186.
7. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. - Екб.: УрО РАН. 2001.
8. Жоголев К.Д., Щедрина В.Ю., Никитин
B.Ю., Ващенко В.И. Иммунокорригирующее действие препарата хитозан при бактериально и гриппозной инфекции // Иммунокоррекция при инфекционной патологии. - Л. 1998. С. 32.
9. Иванова О.С., Шекунова Т.О., Иванов В.К. и др. Доклады Академии наук. 2011. 437. № 5.
C. 638.
10. Имельбаева Э.А., Теплова С.Н., Камилов Ф.Х., Ахметова Б.Х. Иммунотропные эффекты феноксигербицидов. - Уфа: Из-во Башкирского ун-та. 2000. 116 с.
11. Имельбаева Э.А., Хайруллина P.M., Медведев Ю.А. Методические указания к занятиям по иммунологии и серологии: Уч.-мет. пособ. для спец. по клин. и лаб. диагностике. - Уфа. 2006. 87 с.
12. Иноземцева О.А. Российские нанотехноло-гии. 2007. Т. 2. № 9. С. 68-80.
13. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии. - СПб.: Интермедика. -2002. - 600 с.
14. Корчагина Е.В. Агрегация хитозана и его производных в разбавленных водных растворах: автореф. дисс. ... к. ф.-м.н. - М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. - 2012. - 232 с.
15. Кулиш Е.И., Базунова М.В., Валиев Д.Р. Перспективы использования полимер-коллоидных дисперсий на основе сукцината-хитозана и золей йодида серебра в биомедицинских целях // В кн.: Тезисы докладов X Всероссийской конференции «Химия и медицина» с Молодежной научной школой. 2015. С. 104-105.
16. Мочалова А.Е., Никищенкова Л.В., Смирнова Н.Н., Смирнова Л.А. Термодинамические свойства гидрогелей на основе хитозана в области от Т^0 до 350 К // Высокомолекулярные соединения. Серия Б. 2007. Т. 49. № 2. С. 371-376.
17. Нежинская Г.И., Копейкин В.В., Гмиро В.Е.
Препринт № 4. - Новосибирск: СО РАМН. 1995. С. 151.
18. Савадян Э.Ш., Мельников В.М., Беликов Г.П. Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т. 34. № 11.874 с.
19. Сибиряк С.В., Вахитов В.А., Курчатова Н.Н. Цитохром Р450 и иммунная система: факты, гипотезы, перспективы. - Уфа: ГИЛЕМ. 2003.211 с.
20. Сибиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях. - Екб. 2008. 59 с.
21. Сливкин А.И., Лапенко ВЛ., Арзамасцев А.П. и др. Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2005. № 2. С. 73.
22. Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Апоптоз, как важный этап оценки иммунной системы по патогенетическому принципу // Клин. лаб. диагностика. 1997. № 7. С. 31-34.
23. Шамратова В.Г., Шарафутдинова Л.А., Хисматуллина З.Р., Базунова М.В. и др. Биомедицина. 2015. № 3. С. 69.
24. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996. № 6. С. 10-23.
25. Bazunova M.V., Valiev D.R., Zamula Yu.S., Chernova V.V., Kolesov S.V., Kulish E.I. Russian J. ofPhysical Chemistry. 2017. V. 11. P. 513-520.
26. Eliopoulos P., Mourelatos D. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 1998. V. 18. Issue 6. P. 303.
27. Gaines H., Anddersson L., Biberfeld G. A new method measuring lymphoproliferation at the single-cell level in whole blood cultures by flow cytometry // J. Immun. Methods. 1996. Vol. 195. P. 63-72.
28. KrammerP. CD95's deadly mission in the immune system//Nature. 2000. Vol. 407. P. 789-800.
29. Pandey D., Ortiz C., Torres R. Int. J. Nanomedicine. 2013. V. 3. No. 9. Р. 1361.
30. Wright J.B., Lam K., Burrell R.E. Am. J. of Infection Control. 1998. V. 26. No. 6. P. 572.
References
1. Baryshnikov A.Yu., Shishkin Yu.V.
Immunologicheskie problemy apoptoza. - M.: Ehditorial URSS. 2002. 320 s.
2. Bolotova G.V. Polimernye nositeli dlya protivotuberkulyoznyh lekartsvennyh sredstv na osnove hitozana // Molodoj uchyonyj. 2010. №5(16). T.2.
3. Bykov V.P. Sostoyanie i perspektivy razvitiya proizvodstva hitina, hitozana i produktov na
ih osnove iz pancirya rakoobraznyh // Mat-ly 5-j konf. «Novye perspektivy v issledovanii hitina i hitozana». - M.: VNIRO. 1999. S. 12-15.
4. Bychkov A.B., Bykova V.M., Krivosheina L.I.
Primenenie «Hitana» v klinicheskoj praktike // Sovremennye perspektivy v issledovanii hitina i hitozana / Mat-ly 7-j Mezhdunar. konf. / Pod red. V.P. Varlamova i dr. - M.: VNIRO. - 2003. - S. 156-157.
5. Gamzazade A.I. Proizvodnye hitina/hitozana kontroliruemoj struktury v kachestve potencial'no novyhbiomaterialov.: Avtoref. diss. . ..d.h.n. - M. 2005.48 s.
6. Gamzazade A.I., Nasibov S.M., Lukin O.V. Antibakterial'naya aktivnost' hitozanov / Mat-ly 8-j Mezhdunar. konf. «Sovremennye perspektivy v issledovanii hitina i hitozana». - Kazan'. 2006. S. 183-186.
7. Dolgushin I.I., Buharin O.V. Nejtrofily i gomeostaz. - Ekb.: UrO RAN. 2001.
8. Zhogolev K.D., Shchedrina V. Yu., Nikitin V. Yu., Vashchenko V.I. Immunokorrigiruyushchee dejstvie preparata hitozan pri bakterial'no i grippoznoj infekcii // Immunokorrekciya pri infekcionnoj patologii. - L. 1998. S. 32.
9. Ivanova O.S., Shekunova T.O., Ivanov V.K. i dr. Doklady Akademii nauk. 2011. 437. № 5. S. 638.
10. Imel'baeva Eh.A., Teplova S.N., Kamilov F.H., Ahmetova B.H. Immunotropnye ehffekty fenoksigerbicidov. - Ufa: Iz-vo Bashkirskogo un-ta. 2000. 116 s.
11. Imel'baeva Eh.A., Hajrullina R.M., Medvedev Yu.A. Metodicheskie ukazaniya k zanyatiyam po immunologii i serologii: Uch.-met. posob. dlya spec. po klin. i lab. diagnostike. - Ufa. 2006. 87 s.
12. Inozemceva O.A. Rossijskie nanotekhnologii. 2007. T. 2. № 9. S. 68-80.
13. Karpishchenko A.I. Medicinskie laboratornye tekhnologii. - SPb.: Intermedika. - 2002. 600 s.
14. Korchagina E.V. Agregaciya hitozana i ego proizvodnyh v razbavlennyh vodnyh rastvorah: avtoref. diss. ... k.f.-m.n. - M.: MGU im. M.V. Lomonosova. - 2012. - 232 s.
15. Kulish E.I., Bazunova M.V., Valiev D.R. Perspektivy ispol'zovaniya polimer-kolloidnyh dispersij na osnove sukcinatahitozana i zolej jodida serebra v biomedicinskih celyah // V kn.: Tezisy dokladov X Vserossijskoj konferencii «Himiya i medicina» s Molodezhnoj nauchnoj shkoloj. 2015. S. 104-105.
16. Mochalova A.E., Nikishchenkova L.V., Smirnova N.N., Smirnova L.A.
Termodinamicheskie svojstva gidrogelej na osnove hitozana v oblasti ot T^0 do 350 K // Vysokomolekulyarnye soedineniya. Seriya B.
2007. T.49.№2.S.371-376.
17. Nezhinskaya G.I., Kopejkin V.V., Gmiro V.E. Preprint № 4. - Novosibirsk: SO RAMN. 1995. S. 151.
18. Savadyan Eh.Sh., Mel'nikov V.M., Belikov G.P.
Antibiotiki i himioterapiya. 1989. T. 34. № 11. 874 s.
19. Sibiryak S.V., Vahitov V.A., Kurchatova N.N.
Citohrom R450 i immunnaya sistema: fakty, gipotezy, perspektivy. - Ufa: GILEM. 2003. 211 s.
20. Sibiryak S.V., Hajdukov S.V., Zurochka A.V., Chereshnev V.A. Ocenka apoptoza v immunologicheskih issledovaniyah. - Ekb.
2008. 59 s.
21. Slivkin A.I., Lapenko V.L., Arzamascev A.P. i
dr. Vestnik Voronezhskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Himiya. Biologiya. Farmaciya. 2005. № 2. S. 73.
22. Cheredeev A.N., Koval'chuk L.V. Apoptoz, kak vazhnyj ehtap ocenki immunnoj sistemy po patogeneticheskomu principu // Klin. lab. diagnostika. 1997. №7. S. 31-34.
23. Shamratova V.G., Sharafutdinova L.A., Hismatullina Z.R., Bazunova M.V. i dr. Biomedicina. 2015.№3.S.69.
24. Yarilin A.A. Apoptoz i ego mesto v immunnyh processah // Immunologiya. 1996. № 6. S. 10-23.
25. Bazunova M.V., Valiev D.R., Zamula Yu.S., Chernova V.V., Kolesov S.V., Kulish E.I.
Russian J. of Physical Chemistry. 2017. V. 11. P. 513-520.
26. Eliopoulos P., Mourelatos D. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 1998. V. 18. Issue 6. P. 303.
27. Gaines H., Anddersson L., Biberfeld G. A new method measuring lymphoproliferation at the single-cell level in whole blood cultures by flow cytometry // J. Immun. Methods. 1996. Vol. 195. P. 63-72.
28. Krammer P. CD95's deadly mission in the immune system // Nature. 2000. Vol. 407. P. 789-800.
29. Pandey D., Ortiz C., Torres R. Int. J. Nanomedicine. 2013. V. 3. No. 9. P. 1361.
30. Wright J.B., Lam K., Burrell R.E. Am. J. of Infection Control. 1998. V. 26. No. 6. P. 572.
Influence of ultradisperse systems on the basis of complexes of a chitosan and its derivatives with colloidal particles of silver iodide on the immune status
L.A. Sharafutdinova, M.V. Bazunova, E.I., Kulish, N.N. Kurchatova, Z.R. Hismatullina, M.R. Daminov
The article presents the results of a study of the solution of the sodium salt of chitosan succinamides (5%) effect and dispersions of the sodium salt of chitosan succinamide with AgJ (1:1) on the activation processes ofimmunocompetent cells in vitro. It is shown that the solutions ofthe sodium salt ofchitosan succinamide and dispersion of colloidal particles of silver iodide increase the phagocytic and metabolic characteristics of neutrophils, cause a moderate increase in expression ofactivation receptors CD25+, CD95+ and HLA-DR+ lymphocytes, and increase the proliferative activity of lymphocytes along with an increase in the number of cells with intracellular apoptosis signs.
Key words: chitosan, colloidal particles of silver iodide, phagocytic activity of leukocytes, proliferative activity oflymphocytes.
