CC BY
40УДК: 618.177-089.888.11]-078.33:616.69-008.8
ВЛИЯНИЕ УЛИНОСТАТИНА НА ИММУННЫЕ СВОЙСТВА И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ СПЕРМЫ У МУЖЧИН С НАРУШЕНИЕМ ФЕРТИЛЬНОСТИ
Алейник Владимир Алексеевич д.м.н., профессор Бабич Светлана Михайловна к.м.н., доцент
Ходжиматов Гуломиддин Минходжиевич
д.м.н., профессор Ибрагимова Санталатхон Рузиевна
ассистент
Шокирова Садокатхон Мухамматсолиевна
ассистент
Андижанский государственный медицинский институт
Андижан, Узбекистан
Исследованы 42 эякулята мужчин с различным состоянием фертильности. Установлено, что применение препарата улиностатина в качестве иммунокоррегирующего фактора спермы мужчин способствует улучшению её иммунных характеристик. После лечения улиностатином у мужчин с нарушением фертильности отмечалось снижение антипротеолитической и увеличение протеолитической активности спермы.
Ключевые слова: улиностатин, антипротеолитическая активность, ц протеолитическая активность, фертильность, сперма.
INFLUENCE OF ULINOSTATIN ON IMMUNE PROPERTIES AND PROTEOLYTIC ACTIVITY OF SEEM IN MEN WITH FERTILITY DISTURBANCES
Aleynik V.A., Babich S.M., Khodzhimatov G.M., Ibragimova S.R.,Shokirova S.M.
42 ejaculates of men with different fertility conditions were examined. It was established that the use of the drug ulinostatin as an immunocorrecting factor in men sperm contributes to the improvement of its immune characteristics. After treatment with ulinostatin in men with impaired fertility, a decrease in antiproteolytic and an increase in sperm proteolytic activity were noted.
Key words: ulinostatin, antiproteolytic activity, proteolytic activity, fertility, sperm.
ФЕРТИЛ БУЗИЛИШЛИ ЭРКАКЛАР СПЕРМАСИНИНГ ИММУН ВА ПРОТЕОЛИТИК ФАОЛЛИГИГА УЛИНОСТАТИННИНГ ТАЪСИРИ
Алейник В.А., Бабич С.М., Ходжиматов F.M., Ибрагимова С.Р., Шокирова С.М.
Турли фертил х,олатдаги 42 нафар эркак эякуляти текширилди. Улиностатин препаратининг кулланиши, эркаклар спермаси иммунологик характеристикасини яхшилаши аникланди. Даволанишдан сунг сперманинг антипротеолитик хусусияти камайиб, протеолитик фаоллиги ортиши аникланди.
Калит сузлар: улиностатин, антипротеолитик фаоллик, протеолитик фаоллик, фертиллик, сперма.
Актуальность. Известно, что нормальная имплантация и последующее развитие эмбриона и плода обеспечиваются
уникальными иммунологическими механизмами, в частности включающими влияние
компонентов семенной плазмы (СП), на репродуктивную функцию женщины. Долгое время СП рассматривалась, прежде всего, как транспортная среда,
обеспечивающая возможность прохождения сперматозоидов через слизистый барьер цервикального канала, направленный трафик сперматозоидов и выживаемость их во «враждебной» среде женского репродуктивного тракта. Тем не менее, накопленные за последние годы факты значительно расширили существовавшие ранее представления [1].
Семенная плазма содержит активные иммунорегуляторные факторы, придающие ей уникальные свойства и
позволяющие проявлять
иммуносупрессорные и
противовоспалительные свойства -простагландины, цитокины, -росттрансформирующие факторы, интерлейкины (ИЛ) и их растворимые рецепторы.
Плазменная фракция спермы является богатым источником цитокинов. Концентрация
отдельных цитокинов в семенной жидкости значительно превышает аналогичные сывороточные
концентрации, что указывает на потенциальную роль цитокинов в 12 репродуктивной физиологии
человека [2, 3].
В последние годы в сперме, показана самая высокая концентрация трансформирующего фактора роста-Р (ТОБ-Р) по сравнению с другими
биологическими жидкостями. Также было показано, что TGF-P спермы является основным стимулирующим агентом в посткоитальном иммунном ответе, стимулируя синтез
провоспалительных цитокинов и
хемокинов в маточной
ткани, вызывает реакцию лимфоцитов, которая проявляется в лимфатических узлах крыла матки в форме пониженного ответа Т-лимфоцитов на мужские аллоантигены. TGF-ß является ключевым фактором в нарушении иммунного ответа, который приводит к патологии развития плаценты на ранних сроках беременности. TGF-ß необходим для индукции иммунной толерантности к антигенам семенной плазмы [4,5,6,7,8].
Показано, что TNF-а ослабляет ответ клеток на TGF-ß и который, проявляет
антагонистические эффекты в отношении индуцированного TGF-ß гена. Антагонистической активности TNF-а против TGF-ß, имеет решающее значение в контексте восстановления тканей и поддержания гомеостаза тканей [9].
Ингибиторы протеаз
усиливают биологическое действие TGF-ß, вызывая повышение электрофоретической
подвижности, за счет, освобождая TGF-P из его комплекса с альфа-2-макроглобулином [10, 11].
Улинастатин (Ю-трип)
является поливалентным
ингибитором протеазы серина типа Кунитц, найденным в моче и крови человека. Улинастатин ингибирует маркеры воспаления, трипсин, поджелудочную эластазу,
лейкоцитарную эластазу и производство ФНО-альфа и интерлейкина 1,8 и 6. Улинастатин ослабляет повышение
высвобождения нейтрофилов
эластазы, таким образом, замедляя рост провоспалительных
цитокинов, а также ингибирует секрецию провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-11, TNF, NO, PAF. Он ингибирует коагуляцию и фибринолиз и способствует микроперфузии. Имеет свойство стабилизировать лизосомальных мембран и сокращать производство свободных кислородных
радикалов. Улинастатин
ингибирует активность различных
13
гидролаз и высвобождение воспаления и
повышенное медиаторов улучшает
микроциркуляцию и тканевую перфузию. [12,13,14].
Таким образом, применение улинастатина может
способствовать ингибированию производства TNF-a, являющегося антагонистом TGF-P и усилению содержания TGF-P в сперме мужа, а также ингибированию потенциально опасных клеточно-опосредованных иммунных
реакций против антигенов, что может способствовать улучшению иммунных характеристик спермы мужа и содействовать более эффективной индукции у жены иммунной толерантности к антигенам мужа.
Цель исследования: у мужчин, имеющих нарушение фертильности, изучить в эякуляте протеолитическую и анти-протеолитическую активность, TGF-P1, а также показатели про- и противовоспалительных интерлейкинов после лечения
ингибитором протеаз
улинастатином.
Материал и методы. В
рамках изучения причин нарушения фертильности у семейных пар, были обследованы 42 мужчины, у которых были исследованы 42 эякулятов. Все обследованные мужчины были разделены на 3 группы. В 1 группу вошли 16 мужчин с
подтвержденной фертильностью, они имели нормальные показатели спермограммы и содержания лейкоцитов. Во 2 группу вошли 12 мужчин, у жен которых было 2 и более выкидыша, а у мужчин имелись нормальные показатели спермограммы и содержания лейкоцитов. 3 группу составили 14 мужчин, у жен которых в анамнезе не было беременностей, у мужчин сперма имела повышенную вязкость и повышенное содержание лейкоцитов.
В сперме до и после лечения улинастатином определяли
показатели интерлейкинов:
провоспалительных - интерлейкин-
14
1бета (ИЛ-1), фактор некроза опухолей-а (ФНО-а), и противовоспалительных -
интерлейкин -10 (ИЛ-10) методом ИФА с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» Россия, а также трансформирующего фактора роста-р1 (ТСР-Р) методом ИФА с использованием тест-систем
«DRG» Германия.
В сперме определяли также протеолитическую активность (ОПА) казеинолитическим
методом по учету продуктов гидролиза казеина в единицах активности (Ед) по тирозину, ингибиторную - анти-
протеолитическую - активность (АПА) также казеинолитическим методом, Ингибиторную
активность выражали в
ингибиторных единицах (ИЕд) по трипсину и по папаину [15].
Улинастатин (Ю-трип)
назначали в дозе 200 тыс. ЕД, который вводился внутривенно капельно в 100 мл раствора натрия хлорида 0,9% 1 раз в день в течении 10 дней.
Полученные данные
подвергались статистической
обработке с использованием стандартных программ
MicшsoftExcel 2007 c вычислением средних величин (М), их средних ошибок (т), а также коэффициента достоверности разности средних величин Стьюдента-Фишера (1).
Результаты и их обсуждение. Результаты и их обсуждение. Полученные данные показали (табл. 1), что средний показатель провоспалительного интерлейкина ФНО-а в спермы мужчин второй группы был достоверно выше, чем у мужчин первой группы, а у мужчин третьей группы еще более высокий по сравнению с первой группой и достоверно выше, чем во второй группе (Р<0,001).
После лечения улиностатином отмечалось достоверное снижение показателей ФНО-а у мужчин второй и третьей групп относительно показателей до лечения (Р<0,001).
Аналогичные тенденции
динамики отмечены и у средних
15
показателей ИЛ-1бета в сперме мужчин (табл. 1) (Р<0,01).
Таблица 1
Изменение показателей провоспалительных (ФНО-а, ИЛ-1бета) и противовоспалительных (ИЛ-10) интерлейкинов в сперме мужчин исследуемых групп до и после лечения улиностатином
1 контрольная группа 2 группа 3 группа
до лечения после лечения до лечения после лечения
ФНО пг/мл 24,2 ± 2,8 48,3 ± 5,1* 29,3±3,1** 61,4±5,8* 32,6±3.7**
ИЛ-1 пг/мл 34,5±3,1 52,8±5,6* 36,4±2,9** 58,7±6,2* 39,1±4.3**
ИЛ-10 пг/мл 47,2±4,5 32,8±3,1* 43,7± 4.2** 62,5±5,9* 85,3± 7.4**
TGF-31 нг/мл 43,5±3,9 26,5±2,3* 41,7± 4.2** 22,8±2,4* 39,7± 4.1**
Примечание: * - достоверно отличающиеся величины относительно показателей 1 группы.
** - достоверно отличающиеся величины относительно показателей до лечения.
После лечения трипсином также отмечено снижение показателей ИЛ-1 бета у мужчин второй и третьей групп относительно соответствующих показателей до лечения (Р<0,05). Показатели у мужчин третьей группы превышали показатели мужчин второй группы.
Показатели противовоспалительного ИЛ-10 в сперме мужчин второй группы были ниже как до лечения, так и после относительно показателей контрольной и третьей группы
(табл. 1). Тогда как показатели 16 третьей группы были выше и первой, и второй групп как до, так и после лечения. Необходимо отметить, что показатель ИЛ-10 был значительно выше, особенно относительно второй группы (Р<0,05).
Показатели TGF-Pl в составе спермы мужчин второй и третьей групп (рис. 1) были достоверно ниже по сравнению с таковыми показателями первой группы (Р<0,05). После лечения улиностатином у мужчин второй и
третьей групп в сперме показатели TGF-Pl достоверно высились по сравнению созначениями до лечения (Р<0,001) и приблизились повеличине к показателю контрольной группы, но не превысили его.
Также результаты
исследования показали, что средние показатели ОПА спермы мужчин второй группы до лечения
улиностатином были достоверно ниже по сравнению с первой (контрольной) группой мужчин (Р<0,001) (табл. 2). После лечения улиностатином у мужчин второй группы показатели ОПА спермы достоверно повышались
относительно значений до лечения, но оставались ниже, чем в контрольной группе.
Таблица 2.
Изменение показателей общей протеолитической активности (ОПА) и антипротеолитической активности (АПА) спермы мужчин с нарушением фертильности до и после лечения улиностатином
17
1 контрольная группа 2 группа 3 группа
до лечения после лечения до лечения после лечения
ОПА Ед /мл 132,4 ± 12,9 67,3 ± 6,5* 123,1±11,9 ** 81,4 ± 7,8* 128,5±12,1**
АПА ИЕд/мл по трипсину 64,7± 5,9 98,3 ± 8,9* 69,4±6,1** 79,8 ± 8,1* 59,2±5,4 **
АПА ИЕд/мл по папаину 31,7 ± 2,9 59,4 ± 6,2* 42,8± 3,9** 75,8 ± 7,7* 50,4±4,8**
* - достоверно отличающиеся величины относительно показателей первой (контрольной)группы.
** - достоверно отличающиеся величины относительно показателей до лечения.
У мужчин третьей группы до лечения улиностатином также наблюдались достоверно более низкие значения ОПА спермы по
сравнению с показателями мужчин контрольной группы (Р<0,01) (табл. 2). После лечения улиностатином у мужчин третьей группы показатели
ОПА спермы по сравнению с данными до лечения достоверно повышались (Р<0,05), но оставались несущественно ниже контроля.
В этих же исследованиях показатели антипротеолитической активности по трипсину спермы мужчин второй группы до лечения были достоверно выше по сравнению с первой группой мужчин (Р<0,05) (табл. 2). После лечения трипсином у мужчин этой группы показатели
антипротеолитической активности по трипсину спермы, по сравнению с таковыми значениями до лечения, достоверно снижались,
приближаясь по величине к показателям контроля.
У мужчин третьей группы показатели антипротеолитической активности по трипсину до лечения были недостоверно выше
относительно показателей первой группы мужчин (Р>0,05). После лечения улиностатином у мужчин третьей группы показатели антипротеолитической активности
спермы по трипсину по сравнению со значениями до лечения незначительно, но достоверно снижались (Р<0,05).
Показатели антипротеолитической активности по папаину спермы мужчин второй группы до лечения улиностатином были достоверно выше по сравнению с показателями первой группы мужчин (Р<0,01) (табл. 2), После лечения улиностатином у мужчин второй группы показатели антипротеолитической активности
18
по папаину относительно значений до лечения достоверно снижались (Р<0,05).
У мужчин третьей группы показатели антипротеолитической активности по папаину до лечения улиностатином были
незначительно выше по сравнению с таковыми значениями первой группы мужчин (Р<0,001) (табл. 2). После лечения улиностатином у мужчин третьей группы показатели
антипротеолитической активности по папаину спермы по сравнению
со значениями до лечения достоверно снижались (Р<0,01).
Таким образом, применение препарата улиностатин
способствует снижению
показателей провоспалительных интерлейкинов в сперме и повышению содержания
противовоспалительных интерлейкинов. По-видимому, фертильность мужчины может определяться не только наличием сперматозоидов, способных к оплодотворению, но и
компонентами семенной плазмы, обеспечивающими иммунорегуляцию репродуктивной функции женщины. Определение иммунорегулирующего потенциала спермы и использование иммуномодулирующих свойств семенной плазмы может явиться перспективным направлением для повышения эффективности лечения нарушения фертильности у женщин [1].
Из полученных данных также видно, что показатели ОПА спермы снижены в большей мере у мужчин
с нарушением фертильности. После лечения трипсином у этих мужчин отмечалось значительное
восстановление ОПА. Снижение ОПА спермы, но в меньшей степени, сохраняется и у мужчин с нарушением фертильности, но с отсутствием выраженных
воспалительных явлений по результатам спермограммы. После лечения трипсином у этих мужчин так же отмечалось значительное восстановление ОПА.
Значительное увеличение
19
антипротеолитической активности спермы по трипсину отмечалось у мужчин с нарушением
фертильности и выраженным воспалительным процессом,
проявляющемся в повышенном количестве лейкоцитов по результатам спермограммы, после лечения трипсином показатели антипротеолитической активности по трипсину существенно снижались. У мужчин с
нарушением фертильности, но без выраженных проявлений
воспаления, антипротеолитическая
активность спермы по трипсину была незначительно выше, а после лечения трипсином снижалась.
Исходя из этого полученные нами данные
антипротеолитической активности спермы по папаину и трипсину можно интерпретировать таким образом, что при лечении трипсином принимают участие в большей степени системные механизмы защиты у мужчин с нарушением фертильности, но без выраженных проявлений
воспаления, а местные механизмы - в большей степени у мужчин с нарушением фертильности и выраженным воспалительным процессом, проявляющемся в повышенном количестве
лейкоцитов по результатам спермограммы.
Вывод. Применение препарата улиностатина в качестве
иммунокоррегирующего фактора спермы мужчин способствует улучшению её иммунных характеристик.
У мужчин с нарушением фертильности отмечается снижение общей протеолитической
активности и нарастание антипротеолитической активности спермы. Нарастание
антипротеолитической активности в большей мере связано с местной и системной реакцией на воспалительный процесс, но в
20
меньшей степени с
ингибированием протеаз спермы. После лечения улиностатином у мужчин с нарушением
фертильности отмечалось
снижение антипротеолитической и увеличение протеолитической активности спермы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабаян А.А., Смольникова В.Ю., Николаева М.А., Степанова Е.О., Калинина Е.А. Влияние иммунорегуляторных свойств семенной плазмы на репродуктивную функцию женщин// Гинекология, 2012, №4, С. 80-84
2. Eggert-Kruse W. et al. Relationship of seminal plasma interleukin (IL)-8 and IL-6 with semen quality //Human reproduction. - 2001. - Т. 16. - №. 3. - С. 517-528.
3. Robertson, S.A., Guerin L.R., Bromfield J.J., Branson K.M., Ahlstrom A.C., Care A.S. Seminal fluid drives expansion of the CD4+ CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biology of reproduction, 2009, 80(5), 1036-1045.
4. Kubiczkova L. et al. TGF-P-an excellent servant but a bad master //Journal of translational medicine. - 2012. - T. 10. - №. 1. - C. 183.
5. Johansson M. et al. Semen activates the female immune response during early pregnancy in mice //Immunology. - 2004. - T. 112. - №. 2. - C. 290-300.
6. Jones R. L. et al. TGF-P superfamily expression and actions in the endometrium and placenta //Reproduction. - 2006. - T. 132. - №. 2. - C. 217-232.
7. Yang L., Pang Y., Moses H. L. TGF-P and immune cells: an important regulatory axis in the tumor microenvironment and progression //Trends in immunology. - 2010. - T. 31. - №. 6.
- C. 220-227.
8. Sadat Z., Kalahroudi M. A., Saberi F. The effect of short duration sperm exposure on development of preeclampsia in primigravid women //Iranian Red Crescent Medical Journal.
- 2012. - T. 14. - №. 1. - C. 20.
9. Yamane K. et al. Antagonistic effects of TNF-a on TGF-P signaling through down-regulation of TGF-P receptor type II in human dermal fibroblasts //The Journal of Immunology. - 2003. - T. 171. - №. 7. - C. 3855-3862.
10. McCaffrey T. A. et al. Transforming growth factor-beta activity is potentiated by heparin via dissociation of the transforming growth factor-beta/alpha 2-macroglobulin inactive complex //The Journal of Cell Biology. - 1989. - T. 109. - №. 1. - C. 441-448.
11. Nelson S. M., Greer I. A. The potential role of heparin in assisted conception //Human Reproduction Update. - 2008. - T. 14. - №. 6. - C. 623-645.
12. Ito K. et al. Effect of Ulinastatin, a human urinary trypsin inhibitor, on the oleic acid-induced acute lung injury in rats via the inhibition of activated leukocytes //Injury. - 2005. - 21 T. 36. - №. 3. - C. 387-394.
13. Molor-Erdene P. et al. Urinary trypsin inhibitor reduces LPS-induced hypotension by suppressing tumor necrosis factor-a production through inhibition of Egr-1 expression //American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. - 2005. - T. 288. - №. 3. - C. H1265-H1271.
14. Cao Y. Z. et al. Protective effect of Ulinastatin against murine models of sepsis: inhibition of TNF-a and IL-6 and augmentation of IL-10 and IL-13 //Experimental and Toxicologic Pathology. - 2012. - T. 64. - №. 6. - C. 543-547.
15. Krol J., Kowalski R., Demska-Zak^s K., Hliwa P., Glogowski J. Proteolytic and anti-proteolytic activity in the seminal plasma of Eurasian perch (Percafluviatilis L.) during the spawning period. Czech J. Anim. Sci., 2011, vol. 56, no9, 390-397.
