Влияние тяжелых металлов на клетки метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 543.9

ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА КЛЕТКИ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ ИАШЕЖЬА POLYMORPHA

М. Г. Зайцев, Е. А. Воронцова

Иммобилизованные клетки метилотрофных дрожжей использовали в качестве тест-объекта при оценке влияния воздействия ионов тяжелых металлов. Для изготовления биораспознающего элемента биосенсора применили способ адсорбции клеточной биомассы на стекловолоконных фильтрах GF. Относительное стандартное отклонение (для 10 последовательных измерений и доверительной вероятности 0,95) равно 0,4 и 4 % при детекции метанола без воздействия ионов меди и в присутствии ионов Cu(1000ПДК) соответственно. Величина константы Михаэлиса увеличилась примерно в 2 раза в присутствии ионов меди в растворе.

Ключевые слова: метилотрофные дрожжи, биосенсор, ионы тяжелых металлов, метанол.

Введение

Экологическая безопасность окружающей среды является одним из приоритетных направлений государственной политики современности. Одним из источников загрязнения природных экосистем, являются побочные продукты предприятий металлургической, машиностроительной, приборостроительной, автомобильной и других отраслей промышленности, содержащие значительное количество загрязняющих веществ, в состав которых входят различные органические вещества - спирты, кислоты, поверхностно-активные вещества и нефтепродукты, а также высокие концентрации ионов тяжелых металлов [1].

Состав таких загрязнителей чрезвычайно разнообразен, он изменяется в процессе появления новых производств и усовершенствования существующих. Наряду с этим происходит адсорбция тяжелых металлов в органическом веществе природных экосистем. Отмечается высокое содержание таких тяжелых металлов как 7п, Fe, Mn, Со и т.д., наиболее токсичными из которых являются - Cd, Pb, & [2].

Актуальной задачей является определение влияния ионов тяжелых металлов на живые организмы окружающей среды. В настоящей работе провели оценку влияния ионов некоторых тяжелых металлов на дыхательную активность метилотрофных дрожжей.

Дрожжи являются представителями эукариот и обладают способностью поддерживать большинство посттрансляционных модификаций, характерных для эукариотических клеток, а также обладают способностью к эффективной секреции белков в культуральную среду. При этом культивирование дрожжей не требует дорогостоящего оборудования и сред, а выделение и очистка рекомбинантного белка существенно облегчена

тем, что количество эндогенных секретируемых белков дрожжей сравнительно невелико [3].

Цель работы: определить влияние некоторых ионов тяжелых металлов на параметры биораспознающих элементов микробного биосенсора кюветного типа.

Материалы и методы

Штамм микроорганизмов. В работе использовали метилотрофные дрожжи НатепЫа polymorpha NCYC 495 1п, предоставленные лабораторией биосенсоров ИБФМ РАН г. Пущино.

Культивирование метилотрофных дрожжей. Для выращивания дрожжей НатепЫа polymorpha NCYC 495 1п использовали питательную среду для культивирования дрожжевых микроорганизмов. Клетки выращивали в шейкере - инкубаторе (190 об/мин) при 28 °С в колбах Эрленмейера с 200 мл среды, содержащей: (КН4)^04 - 2,5 г, MgSO4 - 0,2 г, КН2Р04-3Н20 - 0,7 г, NaH2PO4•2H2O - 3,0 г, дрожжевой экстракт (Тип Д) -0,5 г, DL лейцин - 0,17 г, глицерин - 8,3 мл, микроэлементы - 1 мл. [4]. Полученную биомассу осаждали центрифугированием при 8000g в течение 15 мин. Дрожжевые клетки помещали в морозильную камеру (Т= -200С), чтобы увеличить время хранения.

Формирование рабочего электрода. Рабочий электрод формировали следующим образом: 50 мг дрожжевых клеток смешивали со 150 мкл калий натрий фосфатным буферным раствором (рН=7,6; концентрация солей 60 мМ). На фрагмент мембраны 4х4 мм2 носили 40 мкл суспензии клеток и подсушивали на воздухе в течение 30 мин. Затем ее закрепляли на рабочей поверхности электрода при помощи пластикового кольца. Сформированный рабочий электрод с биораспознающим элементом хранили в буферном растворе в холодильнике. Схема биосенсорной установки представлена на рис. 1.

Биосенсорные измерения. Регистрацию сигнала в биосенсорном анализе проводили, с использованием рабочего электрода. В качестве преобразователя использовали установку БПК - термооксиметр Эксперт-001(Эконикс-ЭКСПЕРТ): объем кюветы 5 см3; натрий-калиевый фосфатный буфер рН 7,6; перемешивание раствора в кювете осуществляли с использованием магнитной мешалкой (скорость перемешивания 300 об/ мин); ввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема (20-200 мкл, 1000-5000 мкл) («ЛЕНПИПЕТ», Россия). Добавляли аликвоту анализируемого вещества и ожидали завершения изменений концентрации растворенного кислорода в кювете, после чего находили тангенс угла наклона кривой.

Рис. 1. Схема рабочего электрода

Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость развития сигнала. После каждого измерения осуществляли промывание электрода буферным раствором в течение 2-3 минут до достижения стабильного базового уровня растворенного кислорода.

Результаты и их обсуждение

В настоящей работе одним из показателей влияния ионов тяжелых металлов на дыхательную активность иммобилизованных микроорганизмов рассматривали операционную стабильность биосенсора на основе дрожжевых клеток.

Операционная стабильность сенсоров характеризуется относительным стандартным отклонением ответа биосенсора при многократном измерении стандартного образца (анализируемое вещество - метанол (0,5 мМ) после нескольких последовательных измерений в течение определенного периода времени [5].

На рис. 2 и в табл. 1 представлены результаты определения операционной стабильности. Было проведено 10 последовательных измерений ответа сенсора на раствор метанола.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой воспроизводимости результатов, таким образом возможно более эффективно оценить возможное негативное влияние некоторых ионов тяжелых металлов.

Наряду с величиной операционной стабильности в качестве оценочного параметра влияния ионов тяжелых металлов можно использовать величину константы Михаэлиса для природного окисляемого субстрата - метанола. Изменение величины Км - следствие влияния ионов металлов на ферментную систему дрожжевых клеток.

Рис. 2. Операционная стабильность биосенсора

Таблица 1

Параметры операционной стабильности биосенсора

Среднее значение, мг/дм3*с 0,231±0,002

Относительное стандартное отклонение, % 0,4

На рис. 3. показана построенная градуировочная зависимость отклика биосенсора от концентрации метанола в измерительной кювете (на начальном этапе для биосенсора).

Концентрация метанола, мМ

Рис. 3. Зависимость ответа сенсора от концентрации метанола

Полученная зависимость была обработана в координатах уравнения ферментативной кинетики Михаэлиса-Ментен:

Я _ Ятах[ 5 ]

Км + [ 5 ]'

где Я - скорость ферментативной реакции, мг/дм3*с; Ятах - максимальная скорость ферментативной реакции при полном насыщении фермента субстратом, мг/дм3*с; Км - кажущаяся константа Михаэлиса - концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной скорости, мМ; [5] - начальная концентрация субстрата, мгО2/дм3.

Рассчитанные параметры зависимости представлены в табл. 2.

Таблица 2

Параметры градуировочной зависимости биосенсора

Максимальная скорость Ятах, мг/дм3*с 0,41±0,06

Константа Михаэлиса Км, мМ 0,26±0,02

Коэффициент смешанной корреляции 0,98

Найденная величина КМ показывает высокое сродство ферментных систем клеток метилотрофных дрожжей к метанолу и сходится с результатами, представленными в работе [4].

Для выбора металла, оказывающего максимальное воздействие на дрожжевые микроорганизмы использовали растворы ионов Cd2+, РЬ2+, 7п2+, М2+, Си2+ в определенных концентрациях [6]. Концентрации растворов приведены в табл. 3.

Таблица 3

Влияние ионов тяжелых металлов оценивали по изменению величины отклика биосенсора

Ион металла Концентрация иона в растворе, г/дм3

ПДК 10 ПДК 100 ПДК 1000 ПДК

Си2+ 0,0025 0,0252 0,2515 2,5200

7П2+ 0,0044 0,0442 0,4423 4,4200

Cd2+ 0,0031 0,0314 0,3136 3,1000

РЬ2+ 0,0016 0,0160 0,1600 1,6000

М2+ 0,0041 0,0405 0,4050 4,0500

Измерение величины отклика биосенсора проводилось при концентрациях ионов металлов в буферном растворе в диапазоне 1 ПДК - 100 ПДК и концентрации метанола в кювете 0,01 моль/дм3. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Изменение ответа биосенсора под влиянием ионов тяжелых металлов

в различных концентрациях

Концентрация иона, ПДК

Ион металла 0 1 10 100

7П2+ 0 -1 -10 -8 Снижение ответа биосенсора, %

М2+ 0 5 14 -30

Си2+ 0 -17 -46 -72

РЬ2+ 0 2 21 20

Cd2+ 0 17 25 41

При анализе полученных результатов было определено, что наиболее четкое негативное влияние на дыхательную активность отмечено для ионов меди, поэтому для дальнейшей работы использовали ионы меди.

Воспроизводимость результатов биосенсора оценивали при концентрации меди (II) в буферном растворе 2,52 г/дм3 (1000 ПДК). Анализируемое вещество метанол (0,5 мМ) Результаты определения представлены в табл. 5.

Таблица 5

Воспроизводимость результатов биосенсора в присутствии ионов меди

(1000 ПДК)

Среднее значение, мг/дм3*с 0,24±0,03

Относительное стандартное отклонение, % 4

Стоит отметить, что после стрессового воздействия ионов тяжелых металлов на иммобилизованные микроорганизмы, наблюдается заметное снижение воспроизводимости результатов.

Дальнейшую оценку влияния ионов меди оценивали с использованием градуировочной зависимости ответов биосенсора от концентрации метанола. Полученные результаты представлены в табл. 6.

Таблица 6

Параметры градуировочной зависимости микробного биосенсора

под действием ионов меди

Максимальная скорость Ятах, мг02/дм3*с 0,5±0,01

Константа Михаэлиса Км, мМ 0,58±0,07

Коэффициент смешанной корреляции 0,96

Значительное увеличение константы Михаэлиса по сравнению с контрольным опытом в отсутствии влияния ионов Cu2+ свидетельствует о снижении активности ферментных систем дрожжевых микроорганизмов.

Заключение

Полученные результаты определения операционной стабильности микробного биосенсора и параметров градуировочной зависимости показывают возможность использования иммобилизованных дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 495 ln в качестве тест-объекта токсичного влияния ионов Cu2+

Список литературы

1. Вудворд Д., Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир, 1988. 215 с.

2. Diagnosis of soil contamination using microbiological indices: A review on heavy metal pollution. / J. Tang, J. Zhang, L. Ren [at al.] // Journal of Environmental Management. 2019. V.242. P.121-130.

3. Yeasts associated with pods and exudates of algarrobo trees (Prosopis spp.) and species of columnar cacti in northwest. / D. M. Spencer, J. F. T. Spencer, L. I. de Figueroa [at al.] // Appl Microbiol Biotechnol. 1996. P. 736-739.

4. Характеристика рецепторных элементов биосенсоров при двух способах иммобилизации метилотрофных дрожжей. / М. Г. Зайцев, В. А. Арляпов, В. А. Алфёров [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология 2012. Т. 48. С. 570-576.

5. Improvements in the stability characteristics of biosensors using protein-polyelectrolyte complexes / T. D. Gibson, B. L. J. Pierce, J. N. Hulbert [at al.] // Sensors and Actuators B: Chemical. 1996. V. 33. P. 13-18.

6. Романов Г.Г., Спицына Т.Е. Влияние тяжелых металлов на биологическую активность почвы // Тр. Коми научный центр Уральского отделения (НЦ УрО) РАН. 1996. Т.146. С. 101-108.

Зайцев Максим Геннадьевич, канд. хим. наук, доцент, m.g.zaytcev@gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Воронцова Елизавета Александровна, магистрант, elizavetavorontsova. pomme'a yandex.ru Россия, Тула, Тульский государственный университет

INFLUENCE OF HEAVY METALS ON HANSENULA POLYMORPHA METHYLOTROPHIC YEAST CELLS

M. G. Zaitsev, E. A. Vorontsova

Methylotrophic yeast Immobilized cells were used as a test object in assessing the impact of heavy metal ions. A method of adsorption of cellular biomass on GF fiberglass filters was used to manufacture the biosensor element. The relative standard deviation (for 10 consecutive

measurements and a confidence probability of 0.95) is 0.4% and 4% when detecting methanol without copper ions and in the presence of Cu ions (1000PDC), respectively. The value of the Michaelis constant increased by about 2 times in the presence of copper ions in the solution.

Key words: methylotrophic yeast, biosensor, heavy metal ions, methanol.

Zaytsev Maxim Gennadievich., candidate of chemical sciences, assistant professor, m. g. zaytcev@gmail. com, Russia, Tula, Tula State University,

Vorontsova Elizaveta Aleksandrovna, graduate student, elizavetavorontsova. pomme'ayandex. ru, Russia, Tula, Tula State University