CC BY
30
УДК 504.5:582.252 DOI: 10.17217/2079-0333-2023-63-87-100
ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ДИНАМИКУ ЧИСЛЕННОСТИ И ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ ALEXANDRIUMAFFINE (DINOPHYTA)*
Маркина Ж.В.1, Огнистая А.В.1, 2, Зинов А.А.1, 2
1 Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского, ДВО РАН, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17.
2 Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток, о. Русский, п. Аякс, 10.
Исследовано действие тяжелых металлов: кадмия, свинца, никеля (в концентрациях 10 и 20 мкг/л), цинка и железа (50 и 100 мкг/л) на динамику численности, морфологию клеток и фотосинтетический аппарат (по содержанию фотосинтетических пигментов - хлорофилла а и каротиноидов, флуоресценции хлоропласта) динофитовой водоросли Alexandrium affine в течение семи суток. Показано, что наиболее угнетающее воздействие на водоросль оказывал кадмий: численность клеток снижалась и не восстанавливалась к концу опыта. Также отмечено снижение содержания фотосинтетических пигментов. Внесение свинца приводило к небольшому увеличению численности клеток, при этом увеличивалось содержание фотосинтетических пигментов. Присутствие в среде никеля, железа и цинка провоцировало возрастание численности клеток, однако содержание хлорофилла а и каротиноидов снижалось. Все металлы приводили к изменению флуоресценции хлоропласта и морфологическим нарушениям клеток.
Ключевые слова: железо, кадмий, никель, свинец, цинк, флуоресценция, хлорофилл а, численность клеток, каротиноиды, Alexandrium affine.
INFLUENCE OF HEAVY METALS ON POPULATION DYNAMICS AND PHOTOSYNTHETIC APPARATUS OF ALEXANDRIUM AFFINE (DINOPHYTA)
Markina Zh. V.1, Ognistaya A.V. 1 2, Zinov A.A.1, 2
1 A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok, Palchevsky Str. 17.
2 Far Eastern Federal University, Vladivostok, Island Russkiy, Ajax Village 10.
The effect of heavy metals: cadmium, lead, nickel (in concentrations of 10 and 20 (xg/l), zinc and iron (50 and 100 (g/l) on the dynamics of population, cell morphology and photosynthetic apparatus (according to the content of photosynthetic pigments - chlorophyll a and carotenoids, chloroplast fluorescence) of Alexandrium affine dinophyte algae during 7 days. It was shown that cadmium had the most depressing effect on the algae: the number of cells decreased and did not recover by the end of the experiment. There was also a decrease in the content of photosynthetic pigments. The addition of lead led to a slight increase in the number of cells, while the content of photosynthetic pigments increased. The presence of nickel, iron and
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 21-74-30004) (The work was carried out with the financial support of the Russian Science Fund grant (project № 21 -74-30004)).
zinc in the medium provoked an increase in the number of cells, but the content of chlorophyll a and carote-noids decreased. All metals led to changes in chloroplast fluorescence and morphological disorders of cells.
Key words: iron, cadmium, nickel, lead, zinc, fluorescence, chlorophyll a, cell number, carotenoids,
Alexandrium affine.
ВВЕДЕНИЕ
Представители рода Alexandrium широко распространены в прибрежных водах морей разных широт [Turner, Borkman, 2005; Farrell et al., 2013; Imai et al., 2021; Anderson et al., 2021]. Они привлекают внимание исследователей вследствие того, что на протяжении многих лет вызывают вредоносные «цветения» [Vershinin, Orlova, 2008; Anderson et al., 2012; Farrell et al., 2013; Laania et al., 2013; Guallar et al., 2017; Montoya et al., 2018]. При таких явлениях численность клеток может достигать 4 500 клеток в миллилитре [Brandenburg et al., 2017]. Вредоносные «цветения» наносят ущерб как марикультурным хозяйствам, так и природным экосистемам [Anderson et al., 2012; Montoya et al., 2018].
До настоящего времени остается открытым вопрос о причинах возникновения данных явлений. Так, имеются сведения, что триггером для начала «цветения» Alexandrium spp. может являться сильный ветер совместно со стабильной температурой воды около 20°С [Laanaia et al., 2013; Brandenburg et al., 2017], низкое соотношение растворенного неорганического азота к растворенному неорганическому фосфору, малая численность выедателей [Brandenburg et al., 2017], резкое изменение солености в комплексе с другими факторами среды [Kremp et al., 2019]. Несмотря на то, что «цветение» представителей рода Alexand-rium обусловливают физические факторы среды [Brandenburg et al., 2017], хорошо известно, что обогащение вод биогенными элементами приводит к массовому размножению водорослей в целом. Также
микроэлементы, включающие в себя тяжелые металлы, считаются важным фактором, который контролирует «цветение» воды [Martin et al., 1994; He et al., 2010].
Использование тяжелых металлов для нужд человека год от года только увеличивается, соответственно, возрастает их поступление в окружающую среду. Так, на 2020 г. мировая добыча кадмия составляла - 23 тыс. т, свинца - 44 тыс. т, никеля -2,5 млн т, цинка - 12 тыс. т, железа -2,4 млн т [USGS, 2021]. Опасность тяжелых металлов для водных организмов усугубляется тем, что в водной среде они присутствуют в более активных растворенных формах, чем в наземной [Rahman, Singh, 2019].
Часть тяжелых металлов относится к эссенциальным элементам, жизненно необходимым для нормального функционирования организмов, в том числе микроводорослей, часть - неэссенциальным, которые не включены в норме в биологические процессы. Примером первых могут служить никель, цинк и железо, включенные в окислительно-восстановительные реакции, как кофакторы ферментов, важных для дыхания, фотосинтеза, ассимиляции и продуцирования различных веществ. Примером вторых является кадмий и свинец, вызывающие даже в небольших концентрациях биохимические и морфологические изменения у растений [Nagajyoti et al., 2010; Masmoudi et al., 2013; Rahman, Singh, 2019]. Представители динофлагел-лят в плане исследований по действию тяжелых металлов остаются слабо изученными [Soyer, Prevot, 1981; Weng et al., 2008; Herzi et al., 2013; Chetouhi, 2020].
Традиционно оценку действия токсических веществ, наряду с другими показателями, проводят по численности клеток, так как это интегральный показатель, отражающий происходящие в организмах микроводорослей процессы [La Rocca et al., 2009; He et al., 2010; Martinez-Ruiz, Martinez-Jeromo, 2015]. Пристальное внимание исследователей к воздействию тяжелых металлов на фотосинтетический аппарат связано с тем, что, во-первых, хлоропласты ответственны за многие процессы в растительной клетке, а во-вторых, они являются основной мишенью действия любых токсических веществ у растений [Carfagna et al., 2013].
В качестве параметров оценки состояния фотосинтетического аппарата используют содержание пигментов (хлорофилла а и каротиноидов) и флуоресценцию хлоропласта [La Rocca et al., 2009; Gan et al., 2019; Zamani-Ahmadmahmoodi et al., 2020]. Хлорофилл а необходим для осуществления непосредственно процесса фотосинтеза. Каротиноиды участвуют в поглощении света и защищают фотосинтетический аппарат от окислительного стресса: гасят триплетные состояния хлорофиллов, вызывающих формирование атомарного кислорода, помогают сбрасывать энергию с поврежденных хлорофиллов [Masmoudi et al., 2013; Zhu et al., 2019].
В связи с вышеизложенным, цель настоящей работы заключалась в исследовании действия кадмия, свинца, никеля, цинка и железа на численность клеток и фотосинтетический аппарат динофлагелляты Alexandrium affine (H. Inoue & Y. Fukuyo) Balech.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование микроводорослей. Культура Alexandrium affine AFRU-12 предоставлена ресурсным центром «Морской биобанк» Национального научного центра морской биологии им. А.В. Жирмунского
ДВО РАН. Водоросли выращивали на среде f [Guillard, Ryther, 1962], приготовленной на основе фильтрованной и стерилизованной морской воды соленостью 32%о в 250-мл колбах Эрленмейера с объемом питательной среды 200 мл, при температуре 18°C, интенсивности освещения 70 мкмоль/м2-с в области видимого света и 14-часовом световом дне. В качестве инокулята использовали культуры на стадии экспоненциального роста. Начальная концентрация клеток составляла 1 000 клеток/мл. Эксперимент проводился семь суток. Измерения всех показателей выполняли на третьи и седьмые сутки.
Исследованные концентрации Cd2+, Ni2+ и Pb2+ составили: 10 и 20 мкг/л, Zn2+, Fe3+ -
50 и 100 мкг/л. В связи с тем что, как пра-
2+
вило, в морской среде содержание Zn и Fe3+ выше, чем Cd2+, Ni2+ и Pb2+ [Wei et al., 2008; Zhang et al., 2016; Bonanno, Raccuia, 2018; Lee et al., 2018]. Cd2+ добавляли в виде 3CdSÜ4 x 8H2O, Ni2+ - NiSÜ4 x 7H2O, Pb2+ - PbCl2, Zn2+ - ZnSO4x 7H2O, Fe3+ -- FeCl3 x 6H2O с пересчетом на ионы металлов.
Подсчет численности клеток. Клетки подсчитывали в счетной камере Седжви-ка-Рафтера с помощью системы визуализации Evos-5000 (Thermo Fisher Scientific, США).
Измерение содержания хлорофилла а и каротиноидов. Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофилла а и суммарного содержания каротиноидов) анализировали из собранных на мембранный фильтр образцов. Пигменты экстрагировали 90%-ным ацетоном, затем центрифугировали для удаления взвеси в течение 15 минут при 7 000 об/мин. Супернатант отбирали и определяли с помощью спектрофотометра UV 2550 (Shimadzu, Япония) на следующих длинах волн: 480, 630, 647, 664 и 750 нм. Расчет концентраций пигментов проводили по стандартным формулам
[Jeffrey, Humphrey, 1975]. Начальная концентрация хлорофилла а - (107 ± 26) мкг/л, суммы каротиноидов - (242 ± 53) мкг/л.
Оценка флуоресценции. Флуоресценцию хлорофилла а оценивали с помощью светодиодного куба InvitrogenCy5 от системы визуализации Evos-M5000 (Thermo Fisher Scientific, США).
Статистический анализ. Эксперименты проводили в трех повторностях. Статистическую обработку данных выполнили с помощью ^-критерия Манна - Уитни, расчет проводили в программе Excel. На графиках представлены средние значения и стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Численность клеток. Численность клеток A. affine в контроле возрастала с начала эксперимента по седьмые сутки (рис. 1). При добавлении в среду кадмия в концентрации 10 мкг/л численность клеток водоросли на третьи сутки не отличалась от таковой в контроле, а на седьмые была в три раза ниже контрольной (рис. 1). При внесении 20 мкг/л кадмия на третьи сутки количество клеток превышало контрольное, а на седьмые существенно снижалось.
Схожая тенденция отмечена при уровнях содержания свинца как 10 мкг/л, так и 20 мкг/л: число клеток A. affine на третьи сутки в два раза превышало контрольное и оставалось на этом же уровне и на седьмые сутки (рис. 1).
Никель в концентрациях 10 и 20 мкг/л приводил к выраженной стимуляции роста популяции микроводоросли (рис. 1). Особенно увеличивалось количество клеток к седьмым суткам опыта - в 3,2 и 2,8 раза соответственно.
Добавление 50 мкг/л железа вызывало небольшое снижение числа клеток A. affine (рис. 1). В присутствии 100 мкг/л железа отмечен рост популяции, наиболее выра-
жен на седьмые сутки опыта (число клеток было выше контрольного в 2,5 раза).
При внесении 50 мкг/л цинка количество клеток существенно не отличалось от контрольного на протяжении опыта (рис. 1), а содержание 100 мкг/л цинка вызывало интенсивный рост микроводоросли (число клеток превышало контрольное в 1,9 и 2,5 раза на третьи и седьмые сутки соответственно).
Таким образом, кадмий в концентрациях 10 и 20 мкг/л вызывал ингибирование роста A. affine. Цинк и железо при уровне содержания 50 мкг/л не оказывали влияние на численность клеток водоросли. Свинец в концентрациях 10 и 20 мкг/л оказал слабое стимулирующее действие на рост микроводоросли. Содержание никеля 10 и 20 мкг/л, цинка и железа в концентрации 100 мкг/л оказывало выраженный стимулирующий эффект.
Содержание хлорофилла а и каротиноидов. При внесении 10 и 20 мкг/л кадмия отмечено падение содержания хлорофилла а и каротиноидов к третьим суткам опыта (рис. 2 и 3). На седьмые сутки показатели оставались также на низком уровне.
Добавление свинца в концентрациях 10 и 20 мкг/л приводило к увеличению содержания фотосинтетических пигментов по сравнению с таковым в контроле на третьи сутки, наиболее выражено в случае 20 мкг/л (рис. 2 и 3). К седьмым суткам содержание пигментов снижалось, особенно хлорофилла а.
Никель в среде в концентрации 10 мкг/л приводил к увеличению содержания хлорофилла а и каротиноидов на третьи сутки, однако не настолько сильно, как при внесении свинца (рис. 2 и 3). На седьмые сутки зарегистрировано уменьшение содержания фотосинтетических пигментов.
Внесение в среду 50 и 100 мкг/л железа оказывало негативное влияние на содержание хлорофилла а и каротиноидов: оно снижалось на третьи сутки (рис. 2 и 3) и только при концентрации 100 мкг/л увеличивалось на седьмые сутки, но не достигало такового в контроле.
7000 и
6000 -
5000 -
□ 3-й день
17-й день
н о
е
Ч £
3000 2000 -1000 -0
0 Cd 10 Cd 20 Pb 10 Pb 20 Ni 10 Ni 20 Fe 50 Fe 100 Zn 50 Zn 100 Концентрации, мкг/л
Рис. 1. Численность клеток Alexandrium affine в контроле (0) и при добавлении в среду тяжелых металлов Fig. 1. The number of Alexandrium affine cells in the control (0) and when heavy metals are added in medium
ал л и -e
о р
рол /л
й £
250
200
150
100
р
е д
3 50
0
Шft
] 3 -й день □ 7-й день
0 Cd 10 Cd 20 Pb 10 Pb 20 Ni 10 Ni 20 Fe 50 Fe 100 Zn 50 Zn 100 Концентрации, мкг/л
Рис. 2. Содержание хлорофилла а у Alexandrium affine в контроле (0) и при добавлении в среду тяжелых металлов Fig. 2. The content of chlorophyll a in Alexandrium affine in the control (0) and when heavy metals are added in medium
в
о дои
о н и т о
р /л ак г/к
еи м
н
р
е д
о С
300
250
200
150 -
100
50
3 -й день □ 7-й день
I,
iU к i i i
0 Cd 10 Cd 20 Pb 10 Pb 20 Ni 10 Ni 20 Fe 50 Fe 100 Zn 50 Zn 100 Концентрации, мкг/л
Рис. 3. Содержание каротиноидов у Alexandrium affine в контроле (0) и при добавлении в среду тяжелых металлов Fig. 3. The content of carotenoids in Alexandrium affine in the control (0) and when heavy metals are added in medium
0
Действие цинка при концентрациях 50 и 100 мкг/л оказывало негативное влияние на содержание хлорофилла а на третьи и седьмые сутки, в отличии от каротинои-дов, количество которых не отличалось от контроля (рис. 2 и 3). В случае с хлорофиллом а изменения были более выраженные, чем с каротиноидами.
Следовательно, тяжелые металлы оказывали разное влияние на содержание фотосинтетических пигментов. На третьи сутки эксперимента добавление свинца в обоих концентрациях увеличивало содержание пигментов. На седьмые сутки содержание пигментов при внесении металлов было ниже контрольных значений, за исключением свинца в концентрации 20 мкг/л, при которой не зарегистрировано воздействия на фотосинтетические пигменты. Соотношение хлорофилл а/кароти-ноиды было выше такового в контроле на третьи сутки при содержании в среде 20 мкг/л кадмия, 50 мкг/л цинка и 100 мкг/л железа (табл.); на седьмые при 10 и 20 мкг/л свинца, 10 мкг/л никеля, 50 мкг/л цинка. Достоверно ниже соотношение было на седьмые сутки при содержании в среде 10 и 20 мкг/л кадмия, 100 мкг/л цинка, 50 и 100 мкг/л железа.
Морфология клеток и флуоресценция хлоропласта. В контроле на третьи сутки клетки неправильной округлой формы (рис. 4, а). На световом уровне хлоропласт отчетливо виден, флуоресценция яркая, выраженная (рис. 4, б). На седьмые сутки характеристики и форма клеток не изменялись (рис. 4, в, г).
При воздействии кадмия в концентрации 10 мкг/л форма клеток становилась более округлой, наблюдалась более тусклая флуоресценция (рис. 4, е, д). На седьмые сутки клетки были сходными с таковыми в контроле (рис. 4, ж, з). При 20 мкг/л на третьи сутки клетки деформировались, флуоресценция отличалась от контрольной (рис. 4, и, к). На седьмые сутки клетки оставались деформированными (рис. 4, л), флуоресценция хлоропласта была слабее контрольной (рис. 4, м).
Внесение свинца в концентрации 10 мкг/л на третьи сутки не вызывало изменение формы клеток (рис. 4, н), однако флуоресценция была яркой, как в контроле (рис. 4, о). На седьмые сутки морфологические изменения были более выраженными (рис. 4, п), флуоресценция хлоропласта более тусклой (рис. 4, p). Внесение 20 мкг/л вызывало сходные нарушения (рис. 4, с - ф).
Таблица. Соотношение хлорофилл а/каротиноиды в контроле, при содержании металлов в среде
Table. The ratio of chlorophyll a/carotenoids in control when metals are in the medium
Сутки 0 мкг/л Cd2+ Pb2+ Ni2+ Fe2+ Zn2+
10 мкг/л 20 мкг/л 10 мкг/л 20 мкг/л 10 мкг/л 20 мкг/л 50 мкг/л 100 мкг/л 50 мкг/л 100 мкг/л
3 1,34 1,23 1,98* 1,31 1,39 1,34 1,30 1,37 1,66 2,28 1,28
7 1,50 1,28** 1,32 1,84 2,49 1,78 1,44 1,38 1,33 1,65 1,32
* Жирный шрифт - значительно выше контрольного уровня, р < 0,05 ** Курсив - значительно ниже контрольного уровня, р < 0,05
* Bold font is significantly higher than the control level, p < 0,05
** Italics is significantly lower than the control level, p < 0,05
rW
Рис. 4. Клетки Alexandrium affine в контроле, при воздействии кадмия и свинца (световая микроскопия -a, в, д, ж, и, л, н, п, с, у и флуоресценция хлоропласта - б, г, с, з, к, м, о, р, т, ф): а, б - контроль третьи сутки; в, г - контроль седьмые сутки; д, е - 10 мкг/л Cd2+ третьи сутки; ж, з - 10 мкг/л Cd2+ седьмые сутки; и, к - 20 мкг/л Cd2+ третьи сутки; л, м - 20 мкг/л Cd2+ седьмые сутки; н, о - 10 мкг/л Pb2+ третьи сутки; п, р - 10 мкг/л Pb2+ седьмые сутки; с, т - 20 мкг/л Pb2+ третьи сутки; у, ф - 20 мкг/л Pb2+ седьмые сутки
Fig. 4. Alexandrium affine cells in control, when exposed to cadmium and lead (light microscopy - a, в, д, ж, и, л, н, п, с, у and chloroplast fluorescence - б, г, с, з, к, м, о, р, т, ф): а, б - control on the third day; в, г - control on the seventh day; д, е - 10 pg/l Cd2+ the third day; ж, з - 10 pg/l Cd2+ the seventh day; и, к - 20 pg/l Cd2+ the third day; л, м - 20 pg/l Cd2+ seventh day; н, о - 10 pg/l Pb2+ third day; п, р - 10 pg/l Pb2+ seventh day; с, т - 20 pg/l Pb2+ third day; у, ф - 20 pg/l Pb2+ seventh day
Никель в концентрации 10 мкг/л не влиял на форму клеток, часть их в суспензии была разрушенной, визуально большое количество клеток было меньшего размера, чем в контроле (рис. 5, а), хлоропласт изменялся, хотя его флуоресценция не отли-
чалась от контрольной (рис. 5, б). Изменения клеток сохранялись и на седьмые сутки (рис. 5, в, г). При 20 мкг/л токсиканта также отмечено нарушение морфологии клеток, флуоресценция хлоропласта была слабее контрольной в течение опыта (рис. 5, д - з).
25 цт
(И)
(B)
'Л
25 цт
(ж) vl^H j. rjje
H ^
25 цт
(л)
25 цт
(П)
25 цт
(У)
.а 25 цт
(ч)
55 цт
__J
Рис. 5. Клетки Alexandrium affine при воздействии никеля, железа и цинка (световая микроскопия - a, в, д, ж, и, л, н, п, с, у, х, ч и флуоресценция хлоропласта - б, г, с, з, к, м, о, р, т, ф, ц, ш): а, б - 10 мкг/л Ni2+ третьи сутки; в, г - 10 мкг/л Ni2+ седьмые сутки; д, е - 20 мкг/л Ni2+ третьи сутки; ж, з - 20 мкг/л Ni2+ седьмые сутки; и, к - 50 мкг/л Fe3+ третьи сутки; л, м - 50 мкг/л Fe3+ седьмые сутки; н, о - 100 мкг/л Fe3+ третьи сутки; п, р - 100 мкг/л Fe3+ седьмые сутки; с, т - 50 мкг/л Zn2+ третьи сутки; у, ф - 50 мкг/л Zn2+ седьмые сутки; х, ц - 100 мкг/л Zn2+ третьи сутки; ч, ш - 100 мкг/л Zn2+ седьмые сутки
Fig. 5. Alexandrium affine cells when exposed to nickel, iron and zinc (light microscopy - a, в, д, ж, и, л, н, п, с, у, х, ч and chloroplast fluorescence - б, г, с, з, к, м, о, р, т, ф, ц, ш): а, б - 10 ^g/l Ni2+ third day; в, г - 10 ^g/l Ni2+ seventh day; д, е - 20 ^g/l Ni2+ third day; ж, з - 20 ^g/l Ni2+ seventh day; и, к - 50 ^g/l Fe3+ third day; л, м - 50 ^g/l Fe3+ seventh day; н, о - 100 ^g/l Fe3+ third day; п, р - 100 ^g/l Fe3+ seventh day; с, т - 50 ^g/l Zn2+ third day; у, ф - 50 ^g/l Zn2+ seventh day; х, ц - 100 ^g/l Zn2+ third day; ч, ш - 100 ^g/l Zn2+ seventh day
Железо в концентрации 50 мкг/л вызывало изменение формы на более округлую (рис. 5, и), флуоресценция хлоропласта была яркой, как в контроле (рис. 5, к). На седьмые сутки отмечена сходная картина (рис. 5, л, м). При добавлении 100 мкг/л железа отмечено изменение формы клеток, хлоропласт дезорганизовывался (рис. 5, н), флуоресценция не отличалась от контрольной (рис. 5, о). К концу опыта морфологические изменения сохранялись (рис. 5, п), флуоресценция хлоропласта становилась более тусклой (рис. 5, p).
Внесение 50 мкг/л цинка вызывало деформацию клеток (рис. 5, с), флуоресценция хлоропласта была слабее контрольной (рис. 5, т). К завершению эксперимента клетки становились более уродливыми (рис. 5, у, ф). Содержание 100 мкг/л цинка приводило к морфологическим нарушениям и снижению интенсивности флуоресценции на всем протяжении опыта (рис. 5, х - ш).
ОБСУЖДЕНИЕ
Хорошо известно, что тяжелые металлы вызывают окислительный стресс прежде всего в результате увеличения количества свободных радикалов [Nagajyoti et al., 2010; Andorch et al., 2012]. Повышение уровня активных форм кислорода приводит к снижению фотосинтетической продуктивности в результате повреждения биомолекул, нарушению метаболизма митохондрий и обмена между цитозолем и хлоропластом [Masmoudi et al., 2013]. В наших опытах данные явления выражались в изменении содержания фотосинтетических пигментов и флуоресценции хлоропласта A. affine. Одновременно тяжелые металлы вызывали изменения роста популяции A. affine. Ранее показано, что никель, кадмий и цинк влияют на реакционный центр ФС II, приводя к снижению кванто-
вого выхода флуоресценции, не фотохимического и фотохимического тушения уже через час воздействия. Свинец и цинк блокируют поток электронов на сайте разложения воды [Mallick, Mohn, 2003].
Кадмий вызывает изменение структуры хлоропласта микроводорослей и высших растений [Andorch et al., 2012; Singh et al., 2015; Dobrikova, Apostolova, 2019], нарушение синтеза каротиноидов и инак-тивирование ряда ферментов, участвующих в процессе фотосинтеза [Singh et al., 2015], нарушение ассимиляции CO2 [Penen et al., 2017]. У A. affine мы отмечали уменьшение численности клеток, резкое снижение содержания хлорофилла а и каротинои-дов, а например, у Dunaliella salina через шесть часов после экспозиции со 100 мкг/л кадмия отмечено небольшое стимулирование роста клеток ультраструктура клеток не изменялась [Zhu et al., 2019].
Действие кадмия на содержание каро-тиноидов строго зависит от концентрации кадмия и вида растения. В обзоре Добрико-вой и Апостоловой [Dobrikova, Apostoliva, 2019] указано, что каротиноиды меньше подвергаются действию кадмия, чем хлорофилл, следовательно, соотношение ка-ротиноиды/хлорофилл выше у растений, подвергающихся действию кадмия. Однако в нашем исследовании такое отмечено только при 20 мкг/л кадмия на третьи сутки опыта. На Chlorella sorokiana выявлено, что кадмий способствует увеличению скорости дыхания, уменьшению или полному исчезновению пиреноида, скорости фотосинтеза. Кадмий ингибирует ФС II в результате повреждения тилакоидов и реакционных центров [La Rocca et al., 2009; Carfagna et al., 2013]. В то же время есть сведения, что кадмий влияет на обе фотосистемы. Кадмий способен встраиваться в хлорофилл вместо иона магния. Ингиби-рование биосинтеза хлорофилла происходит
через влияние на продуцирование прото-хлорофиллида и активирование ферментативной деградации хлорофиллов хлоро-филлиазой [Dobrikova, Apostoliva, 2019]. Кадмий влияет на метаболизм фосфора у водорослей, что также приводит к снижению скорости роста клеток и содержания хлорофилла а [Chia et al., 2013].
У другой динофитовой водоросли Pro-rocentrum micans при 20 мкг/л кадмия после шести дней экспозиции не отмечено изменений в хлоропластах, только увеличивался размер пиреноидов. Повреждения, вызываемые кадмием в клетках, связаны с нарушением клеточного метаболизма, в частности дыхания [Soyer, Prevot, 1981].
Свинец оказывал слабое стимулирующее влияние на рост популяции A. affine, при этом содержание фотосинтетических пигментов на третьи сутки эксперимента увеличивалось, а на седьмые снижалось. Следует отметить, что свинец 20 мкг/л не влиял на содержание фотосинтетических пигментов. При возрастании содержания хлорофилла а отмечена более слабая, чем в контроле флуоресценция хлоропласта. При возрастании содержания хлорофилла а отмечена более слабая, чем в контроле флуоресценция хлоропласта. Повреждение хлоропласта отмечено и на Dunaliella salina [Kemer et al., 2020]. Также свинец приводит к снижению квантового выхода флуоресценции, уменьшению размера фотосинтетической антенны [Dao, Beardall, 2016; Gan et al., 2019]. Свинец может заменять магний в молекуле хлорофилла, однако такие хлорофиллы не связаны прочно с лигандами пигмент-белкового комплекса. Таким образом, водоросли синтезируют больше молекул хлорофилла на реакционный центр для компенсации нефункциональных хлорофиллов и поддержания производительности фотосинтеза [Dao, Berdall, 2016; Zamani-Ahmadmahmoodi et al., 2020].
Это наблюдалось и в нашем опыте. Возможно, такой механизм действует и в присутствии других тяжелых металлов. Увеличивается содержание каротиноидов для защиты органелл клетки от действия активных форм кислорода, что показано на примере Nannochloropsis oculata. При особо токсичных концентрациях металлов содержание каротиноидов, наоборот, снижается, что свидетельствует о высоком стрессе для водорослей [Zamani-Ahmadmahmoodi et al., 2020].
Никель приводил к выраженной стимуляции роста A. affine. Численность клеток зеленой водоросли Ankistrodesmus falcatus снижалась при концентрациях 15-30 мкг/л уже через 24 часа опыта. Снижение содержания хлорофилла а и каротиноидов происходило при 1 мкг/л никеля. При 8 мкг/л клетки увеличивались и изменяли форму, а при 17 мкг/л деформировались хлоропла-сты [Martinez-Ruiz, Martinez-Jeromo, 2015]. В нашем опыте также отмечена деформация хлоропласта и его более слабая, чем в контроле, флуоресценция при 20 мкг/л металла, с одновременным увеличением численности A. affine. У Phaeodactylum tri-cornutum регистрировали уменьшение квантового выхода флуоресценции, скорости электрон-транспортного потока, увеличение содержания хлорофилла а и активных форм кислорода [Guo et al., 2022]. Ингибирование роста зеленых пресноводных микроводорослей наблюдали при концентрации 200 мкг/л металла [Ahmad et al., 2020].
Железо вызывало стимуляцию роста A. affine при концентрации 100 мкг/л с одновременным снижением содержания хлорофилла а и каротиноидов. Уменьшение данных показателей одновременно с интенсивностью флуоресценции свидетельствует о поражении фотосинтетического аппарата под действием железа, в том числе за счет активных форм кислорода. Ранее
также отмечено, что при токсическом воздействии железа в первую очередь страдают хлоропласты и митохондрии [RajabiIslami, Assareh, 2019]. Механизм генерирования активных форм кислорода под воздействием железа изучен слабо. Предполагается, что оно происходит за счет реакции Фентона, реакций, подобных реакции Фентона, и реакции Хабер - Вейс-са [RajabiIslami, Assareh, 2019; Rana, Prajapati, 2021].
Железо также оказывает влияние на жирно-кислотный состав [RajabiIslami, Assareh, 2019; Concas et al., 2021] и накопление липидов [Wan et al., 2014; RajabiIslami, Assareh, 2019; Rana, Prajapati, 2021]. Липи-ды синтезируются и аккумулируются при стрессовых условиях как наиболее выгодный источник энергии [Wan et al., 2014]. Например, у Chlorella vulgaris при 25 мкг/л железа происходит увеличение скорости роста и интенсивности синтеза нейтральных липидов в форме триацилглицеридов [Concas et al., 2021]. Работы по исследованию действия железа на представителей рода Alexandrium касаются в основном его недостаточных для нормального роста концентраций, при которых снижается численность клеток, нарушается синтез хлорофилла, углеводов и белков [He et al., 2010; Yarimizu et al., 2022].
Цинк в концентрации 100 мкг/л, как и железо, приводил к более интенсивному, чем в контроле, росту A. affine. Однако добавление 100 мкг/л цинка ингибирует рост динофлагелляты P. micans [Kayser, 1977]. Цинк в токсичных концентрациях замедляет процесс деления клеток, вызывает снижение содержания хлорофилла а, аминокислот, фосфотазной активности [Báscik-Remisiewicz et al., 2009], увеличение содержания липидов [Yang et al., 2015]. Даже при 5 000 мкг/л металла у Isochrysis galbana численность клеток не изменялась, однако
снижалось содержание хлорофилла а [Kumar et al., 2015]. В нашем исследовании при стимулирующей численность водоросли концентрации металла происходило также снижение содержания хлорофилла а и каротиноидов. Данный токсикант влияет на электрон-транспортную цепь в результате замены марганца на цинк на сайте разложения воды. На диатомовых Entomo-neis paludosa и Nitzschia palea показано, что цинк снижает выход кислорода и вызывает увеличение карбоангидразной активности [Masmoudi et al., 2013]. У Tisochrysis lutea ингибирование роста на 50% наблюдали при 1 055 мкг/л цинка [Tato, Beiras, 2019]. Такое же явление происходило у зеленых Bracteacoccus minor и Lobosphaera incisa при 2,92 мг/л и 3,48 мг/л соответственно [Maltsev et al., 2021].
Работ по исследованию действия тяжелых металлов на представителей рода Alexandrium немного. Для Alexandrium catenella показано, что при наличии в среде меди, кадмия, свинца, цинка увеличивается количество выделяемых из клеток полисахаридов, особенно глюкозы [Herzi et al., 2013]. В случае Alexandruim pacificum, выращенного на смеси металлов цинка, свинца, меди и кадмия, показано, что рост водоросли замедлялся, а размер клеток увеличивался, протеомные изменения затрагивали мембраны, мембранный транспорт, фотосинтез и энергетический метаболизм [Chetouhi et al., 2020]. Таким образом, тяжелые металлы вызывали биохимические изменения у разных видов рода Alexandrium.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Кадмий вызывал снижение численности A. affine. Рост водоросли увеличивался незначительно при внесении свинца, однако существенно стимулировался при
добавлении никеля, железа и цинка. Это позволяет сделать вывод, что наличие в среде данных металлов в исследованных концентрациях может быть предпосылкой для «цветения» A. affine. С другой стороны, все исследованные металлы нарушают функционирование фотосинтетического аппарата и вызывают морфологические повреждения клеток. В присутствии более устойчивых к данным металлам конкурирующих за ресурсы среды с A. affine видов клетки A. affine с измененными физиологическими процессами не смогут доминировать продолжительное время в условиях загрязнения тяжелыми металлами.
REFERENCES
Ahmad N., Rahbani J., Tayeh J., Lteif R. 2020. Bio-remediation of Ni, Al and Pb by the living cells of a resistant strain of microalga. Water Science and Technology. Vol. 82. № 5. P. 851-860. Anderson D.M., Alpermann T.J., Cembella A., Collos Y. 2012. The globally distributed genus Alexandrium: multifaceted roles in marine ecosystems and impacts on human health. Harmful Algae. Vol. 14. P. 10-35. Anderson D., Fachon E., Pickart R.S. et al. 2021. Evidence for massive and recurrent toxic blooms of Alexandrium catenella in the Alaskan Arctic. Proceedings of the National Academy of Sciences. Vol. 118. № 41. e2107387118. Andosch A., Affenzeller M., Lütz C. et al. 2012. A freshwater green alga under cadmium stress: ameliorating calcium effects on ultrastructure and photosynthesis in the unicellular model Micrasterias. Journal of Plant Physiology. Vol. 169. № 15. P. 1489-1500. Bascik-Remisiewicz A., Tomaszewska E., Labuda K. et al. 2009. The effect of Zn and Mn on the toxicity of Cd to the green microalga Desmodesmus armatus cultured at ambient and elevated (2%) CO 2 concentrations. Polish Journal of Environmental Studies. Vol. 18. № 5. P. 775-780. Bonanno G., Raccuia S.A. 2018. Seagrass Halophila stipulacea: capacity of accumulation and biomonitoring of trace elements. Science of the Total Environment. Vol. 633. P. 257-263. Brandenburg K.M., de Senerpont Domis L.N., Wohlrab S. et al. 2017. Combined physical, chemical and biological factors shape
Alexandrium ostenfeldii blooms in the Netherlands. Harmful Algae. Vol. 63. P. 146-153.
Carfagna S., Lanza N., Salbitani G. et al. 2013. Physiological and morphological responses of lead or cadmium exposed Chlorella sorokiniana 211-8K (Chlorophyceae). Springer Plus. Vol. 2. № 1. P. 1-7.
Chia M.A., Lombardi A.T., Maria da Graga G.M., Parrish C.C. 2013. Lipid composition of Chlorella vulgaris (Trebouxiophyceae) as a function of different cadmium and phosphate concentrations. Aquatic Toxicology. Vol. 128. P. 171-182.
Chetouhi C., Masseret E., Satta C.T. et al. 2020. In-traspecific variability in membrane proteome, cell growth, and morphometry of the invasive marine neurotoxic dinoflagellate Alexandrium pacificum grown in metal-contaminated conditions. Science of the Total Environment. Vol. 715. Art. № 136834.
Concas A., Steriti A., Pisu M., Cao G. 2021. Experimental and theoretical investigation of the effects of iron on growth and lipid synthesis of microalgae in view of their use to produce biofuels. Journal of Environmental Chemical Engineering. Vol. 9. № 4. Art. № 105349.
Dao L. H., Beardall J. 2016. Effects of lead on two green microalgae Chlorella and Scenedesmus: photosystem II activity and heterogeneity. Algal Research. Vol. 16. P. 150-159.
Dobrikova A.G., Apostolova E.L. 2019. Damage and protection of the photosynthetic apparatus under cadmium stress. In Cadmium toxicity and tolerance in plants. Academic Press. P. 275-298.
Farrell H., Brett S., Ajani P., Murray S. 2013. Distribution of the genus Alexandrium (Halim) and paralytic shellfish toxins along the coastline of New South Wales, Australia. Marine Pollution Bulletin. Vol. 72. № 1. P. 133-145.
Gan T., Zhao N., Yin G. et al. 2019. Optimal chlorophyll fluorescence parameter selection for rapid and sensitive detection of lead toxicity to marine microalgae Nitzschia closterium based on chlorophyll fluorescence technology. Journal of Photochemistry and Photobiology Vol. 197. Art. № 111551.
Guallar C., Bacher C., Chapelle A. 2017. Global and local factors driving the phenology of Alexandrium minutum (Halim) blooms and its toxicity. Harmful Algae. Vol. 67. P. 44-60.
Guillard R.R.L., Ryther J.H. 1962. Studies of marine planktonic diatoms. 1. Cyclotella nana Hustedt and Detonula con fervacea (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. Vol. 8 № 2. P. 229-239.
Guo R., Lu D., Liu C. et al. 2022. Toxic effect of nickel on microalgae Phaeodactylum tricornutum
(Bacillariophyceae). Ecotoxicology. Vol. 31. P. 746-760.
He H., Chen F., Li H. et al. 2010. Effect of iron on growth, biochemical composition and paralytic shellfish poisoning toxins production of Alexandrium tamarense. Harmful Algae. Vol. 9. № 1. P. 98-104.
Herzi F., Jean N., Zhao H. et al. Copper and cadmium effects on growth and extracellular exudation of the marine toxic dinoflagellate Alexandrium cate-nella: 3D-fluorescence spectroscopy approach. Chemosphere. Vol. 93. № 6. P. 1230-1239.
Imai I., Inaba N., Yamamoto K. 2021. Harmful algal blooms and environmentally friendly control strategies in Japan. Fisheries Science. Vol. 87. № 4. P. 437-464.
Jeffrey S.T., Humphrey G.F. 1975. New spectrophotometry equations for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und physiologie der pflanzen. Vol. 167. № 2. P. 191-194.
Kayser H. 1977. Effect of zinc sulphate on the growth of mono- and multispecies cultures of some marine plankton algae. Helgolander wissenschaftliche Meeresuntersuchungen. Vol. 30. № 1. P. 682-696.
Kemer K., Mantiri D.M., Rompas R.M. et al. 2020. Transmission electron microscope analysis upon growth of lead acetate treated microalga, Dunaliella sp. Aquaculture, Aquarium, Conservation & Legislation. Vol. 13. № 2. P. 849-856.
Kremp A., Hansen P.J., Tillmann U. et al. 2019. Distributions of three Alexandrium species and their toxins across a salinity gradient suggest an increasing impact of GDA producing A. pseudo-gonyaulax in shallow brackish waters of Northern Europe. Harmful Algae. Vol. 87. Art. № 101622.
Kumar K.S., Dahms H.U., Won E. J. et al. 2015. Microalgae - a promising tool for heavy metal remediation. Ecotoxicology and Environmental Safety. Vol. 113. P. 329-352.
Laanaia N., Vaquer A., Fiandrino A. et al. 2013. Wind and temperature controls on Alexandrium blooms (2000-2007) in Thau lagoon (Western Mediterranean). Harmful Algae. Vol. 28. P. 31-36.
La Rocca N., Andreoli C., Giacometti G.A. et al. 2009. Responses of the Antarctic microalga Koliella antarctica (Trebouxiophyceae, Chloro-phyta) to cadmium contamination. Photo-synthetica. Vol. 47. № 3. P. 471-479.
Lee S., Chung J., Lee Y.W. 2018. Cu and Zn concentrations in seawater and marine sediments along Korean coasts from the perspective of an-tifouling agents. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. Vol. 101. № 2. P. 185-190.
MallickN., Mohn F.H. 2003. Use of chlorophyll fluorescence in metal-stress research: a case study with the green microalga Scenedesmus. Ecotoxicology and Environmental Safety. Vol. 55. № 1. P. 64-69.
Maltsev Y., Maltseva A., Maltseva S. 2021. Differential Zn and Mn sensitivity of microalgae species from genera Bracteacoccus and Lobo-sphaera. Environmental Science and Pollution Research. Vol. 28. № 40. P. 57412-57423.
Martin J.H., Coale K.H., Johnson K.S. 1994. Testing the iron hypothesis in ecosystems of the equatorial Pacific Ocean. Nature. Vol. 371. P. 123-129.
Martínez-Ruiz E.B., Martínez-Jerónimo F. 2015. Nickel has biochemical, physiological, and structural effects on the green microalga Ankistrodesmus falcatus: an integrative study. Aquatic Toxicology. Vol. 169. P. 27-36.
Masmoudi S., Nguyen-Deroche N., Caruso A. et al. 2013. Cadmium, copper, sodium and zinc effects on diatoms: from heaven to hell - a review. Cryptogamie, Algologie. Vol. 34. № 2. P. 185-225.
Montoya N.G., Carignan M.O., Carreto J.I. 2018. Alexandrium tamarense/catenella blooms in the Southwestern Atlantic: Paralytic shellfish toxin production and its trophic transference. In: Hoffmeyer, M., Sabatini, M., Brandini, F., Calliari, D., Santinelli, N. (eds). Plankton Ecology of the Southwestern Atlantic. P. 453-476.
Nagajyoti P.C., Lee K.D., Sreekanth T. V.M. 2010. Heavy metals, occurrence and toxicity for plants: a review. Environmental Chemistry Letters. Vol. 8. № 3. P. 199-216.
Penen F., Isaure M.P., Dobritzsch D. et al. 2017. Pools of cadmium in Chlamydomonas rein-hardtii revealed by chemical imaging and XAS spectroscopy. Metallomics. Vol. 9(7). P. 910-923.
RajabiIslami H., Assareh R. 2019. Effect of different iron concentrations on growth, lipid accumulation, and fatty acid profile for biodiesel production from Tetradesmus obliquus. Journal of Applied Physiology. Vol. 31. № 6. P. 3421-3432.
Rahman Z., Singh V.P. 2019. The relative impact of toxic heavy metals (THMs) (arsenic (As), cadmium (Cd), chromium (Cr)(VI), mercury (Hg), and lead (Pb)) on the total environment: an overview. Environmental Monitoring and Assessment. Vol. 191. № 7. P. 1-21.
Rana M.S., Prajapati S.K. 2021. Resolving the dilemma of iron bioavailability to microalgae for commercial sustenance. Algal Research. Vol. 59. Art. № 102458.
Singh M., Kumar J., Singh S. et al. 2015. Adaptation strategies of plants against heavy metal toxicity: a short review. Biochemistry and Pharmacology. Vol. 4. P. 2167-0501.
Soyer M. O., Prevot P. 1981. Ultrastructural damage by cadmium in a marine dinoflagellate, Prorocentrum micans. Journal of Protozoology. Vol. 28. № 3. P. 308-313.
Tato T., Beiras R. 2019. The use of the marine microalga Tisochrysis lutea (T-iso) in standard toxicity tests; comparative sensitivity with other test species. Frontiers in Marine Science. Vol. 6. DOI: 10.3389/fmars.2019.00488.
Turner J.T., Borkman D.G. 2005. Impact of zooplankton grazing on Alexandrium blooms in the offshore Gulf of Maine. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography. Vol. 52. № 19-21. P. 2801-2816.
USGS, 2021. Mineral commodity summaries 2021, U.S. Geological Survey. 200 p.
Vershinin A.O., Orlova T.Y. 2008. Toxic and harmful algae in the coastal waters of Russia. Oceanology. Vol. 48. № 4. P. 524-537.
Wan M., Jin X., Xia J., Rosenberg J. et al. 2014. The effect of iron on growth, lipid accumulation, and gene expression profile of the freshwater micro alga Chlorella sorokiniana. Applied Microbiology and Biotechnology. Vol. 98. № 22. P. 9473-9481.
Wei M., Yanwen Q., Zheng B., Zhang L. 2008. Heavy metal pollution in Tianjin Bohai bay, China. Journal of Environmental Sciences. Vol. 20. № 7. P. 814-819.
Weng H.X., Sun X.W., Weng J. K. et al. 2008. Crucial roles of iron in the growth of Prorocentrum-
micans Ehrenberg (Dinophyceae). Journal of Coastal Research. Vol. 24. P. 176-183.
Yang J., Cao J., Xing G., Yuan H. 2015. Lipid production combined with biosorption and bioaccumulation of cadmium, copper, manganese and zinc by oleaginous microalgae Chlorella minutissima UTEX2341. Bioresource Technology. Vol. 175. P. 537-544.
Yarimizu K., Mardones J.I., Paredes-Mella J. et al. 2022. The effect of iron on Chilean Alexandrium catenella growth and paralytic shellfish toxin production as related to algal blooms. BioMetals. Vol. 35. № 1. P. 39-51.
Zamani-Ahmadmahmoodi R., Malekabadi M.B., Rahimi R., Johari S.A. 2020. Aquatic pollution caused by mercury, lead, and cadmium affects cell growth and pigment content of marine microalga, Nannochloropsis oculata. Environmental Monitoring and Assessment. Vol. 192. № 6. P. 1-11.
Zhang L., Shi Z., Zhang J. et al. 2016. Toxic heavy metals in sediments, seawater, and mollusks in the eastern and western coastal waters of Guangdong Province, South China. Environmental Monitoring and Assessment. Vol. 188. № 5. P. 1-14.
Zhu Q.L., Guo S.N., Wen F. et al. 2019. Transcrip-tional and physiological responses of Dunaliella salina to cadmium reveals time-dependent turnover of ribosome, photosystem, and ROS-sca-venging pathways. Aquatic Toxicology. Vol. 207. P. 153-162.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Маркина Жанна Васильевна - Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского (ННЦМБ) ДВО РАН; 690041, Россия, Владивосток; кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории клеточных технологий; [email protected]. SPIN-код: 7056-0032, Author ID: 251096, Researcher ID: I-3693-2016, Scopus ID: 8982837500.
Markina Zhanna Vasilievna - A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, FEB RAS; 690041, Russia, Vladivostok; Candidate of Biological Sciences, Researcher of Cell Technologies Laboratory; [email protected]. SPIN-code: 7056-0032, Author ID: 251096, Researcher ID: I-3693-2016, Scopus ID: 8982837500.
Огнистая Альбина Васильевна - Дальневосточный федеральный университет: 690091, Россия, Владивосток; аспирант; Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского (ННЦМБ) ДВО РАН; 690041, Россия, Владивосток, младший научный сотрудник лаборатории морской микробиоты; [email protected]. SPIN-код: 4996-4219, Author ID: 1070727.
Ognistaya Albina Vasilievna - Far Eastern Federal University, 690091, Russia, Vladivostok; Postgraduate; A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, FEB RAS; 690041, Russia, Vladivostok; Junior Researcher of Marine Microbiota Laboratory; [email protected]. SPIN-code: 4996-4219, Author ID: 1070727.
Зинов Антон Андреевич - Дальневосточный федеральный университет; 690091, Россия, Владивосток; аспирант; Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского (ННЦМБ) ДВО РАН; 690041, Россия, Владивосток, младший научный сотрудник лаборатории морской микробиоты; [email protected]. SPIN-код: 6968-7920, Author ID: 1071767.
Zinov Anton Andreevich - Far Eastern Federal University; 690091, Russia, Vladivostok; Postgraduate; A.V. Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, FEB RAS; 690041, Russia, Vladivostok; Junior Researcher of Marine Microbiota Laboratory; [email protected]. SPIN-code: 6968-7920, Author ID: 1071767.
