CC BY
92
Биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (1), с. 130-134
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ЦИТОДЕФА НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТАТУС ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ, ПОДВЕРГНУТЫХ ДЕЙСТВИЮ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
© 2012 г. К.А. Сазанова, Д.И. Башмаков, А.С. Лукаткин
Мордовский госуниверситет им. Н.П. Огарева, Саранск
krissaz@rambler.ru
Поступила в редакцию 23.12.2011
Рассмотрено воздействие сублетальных (1 мМ) и субоптимальных (10 мкМ) концентраций тяжелых металлов (Си, Zn, РЬ и №) и регулятора роста с цитокининовым типом действия цитодеф на образование супероксидного анион-радикала (Ог"), интенсивность перекисного окисления липидов и активность каталазы в листьях молодых растений пшеницы (ТгШсит aestivum Ь., сорт Мироновская 808). Ряд тяжелых металлов, в первую очередь № и Си, индуцировали повышенные индексы, характеризующие интенсивность окислительного стресса. В большинстве опытов токсическое действие усиливалось с возрастанием концентрации металлов. Обработка семян регулятором роста цитодеф влияла на степень окислительных повреждений неоднозначно: на фоне ионов №2+ и Си2+ -увеличивала генерацию О2'_, интенсивность перекисного окисления липидов, активность каталазы, в то время как на фоне ионов Zn2+ и РЬ2+ эти показатели снижались.
Ключевые слова: ТгШсит aestivum Ь., тяжелые металлы, окислительный стресс, регуляторы роста, цитодеф, супероксидный анион-радикал, перекисное окисление липидов, каталаза.
Введение
Возрастающее поступление в окружающую среду тяжелых металлов (ТМ) приводит к загрязнению почв; оттуда ТМ поглощаются растениями, что вызывает серьезные нарушения на уровне клетки, ткани, организма, популяции [1]. Передаваясь по пищевым цепям, тяжелые металлы в конечном итоге влияют на здоровье человека.
Многочисленные исследования последних десятилетий показали, что независимо от природы воздействия, ответ растения на него развивается по некоторой общей схеме, что позволяет говорить о неспецифической стрессовой реакции на воздействие извне [2-4]. Таким универсальным звеном в реакции растительного организма на действие самых разнообразных факторов может быть некоторое стереотипное изменение внутренней среды клетки, на роль которого многие исследователи выдвигают окислительный стресс [4]. ТМ индуцируют повышенное образование активных форм кислорода (АФК) - супероксидного анион-радикала (О2' ), гидроксильного радикала (ОН ), синг-летного кислорода (:О2), перексида водорода (Н2О2) и др. [1, 5, 6]. Избыток ТМ, как следствие, может приводить к развитию окислительного стресса [7, 8]. Повышенный уровень АФК в растениях в присутствии ТМ может быть результатом их влияния на метаболические процессы, связанные с переносом электронов
(главным образом на фотосинтез) [9]. Кроме того, ТМ могут индуцировать снижение анти-оксидантной активности посредством ингибирования антиоксидантных ферментов и/или низкомолекулярных антиоксидантов [6, 9-13]. Увеличение первичных АФК и их метаболических продуктов приводит к активации перекис-ного окисления липидов (ПОЛ), протекающего в норме на определенном стационарном уровне [7, 14, 15].
Известно, что тяжесть стрессового воздействия на растения можно снизить посредством обработки синтетическими или природными регуляторами роста (РР) [16, 17]. Особого внимания заслуживают новые препараты, обладающие антистрессовыми и иммунопротекторными свойствами [18], одним из которых является цитодеф [ 1 -фенил-3 -(1,2,4-триазол-4-ил)мочевина], разработанный во ВНИИ химических средств защиты растений [19] и обладающий выраженной цитокининовой активностью [20]. Показаны положительные эффекты цитодефа при различных стрессирующих воздействиях на растения [18, 20, 21]. Однако до сих пор неизвестны их механизмы, особенно ТМ. Также не вполне ясно, всегда ли проявляется такое действие препарата, или существует некая избирательность в отношении растительных объектов или стрессирующих факторов.
Цель данного исследования - изучение возможности изменения препаратом цитодеф тяжести окислительного стресса, оцениваемого по
450
я 400
ц
g 350
I 2
g 5 зоо
Cl Cl
S X 250 О о
200
га >
2 о 150
0
1
а
5 юо
m
N1 і J к л
10 мкМ | 1 мМ 10 мкм| 1мм 10мкм| 1мМ 10мкм| 1 мМ
вода Ni РЬ Zn Си
Концентрация металла □ контроль Ицмтодеф
Рис. 1. Влияние тяжелых металлов и цитодефа на скорость генерации супероксидного анион-радикала в листьях пшеницы, % к водному контролю
генерации супероксидного анион-радикала, интенсивности перекисного окисления липидов и активности каталазы, в молодых растениях пшеницы, подвергаемых действию ионов Ni2+, Cu2+, Pb2+ и Zn2+ .
Экспериментальная часть
В работе исследовали влияние синтетического PP цитодеф (0.1 мкМ) на растения пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Мироновская 808 на фоне субоптимальных (10 мкМ) или сублеталь-ных (1 мМ) концентраций ТМ Cu2+, Zn2+, Pb2+ или Ni2+. Семена замачивали 8 ч в растворе РР (контрольные - в дистиллированной воде), после чего промывали дистиллированной водой и высаживали на растворы солей ТМ (CuSO4*5H2O, Pb(NO3)2, ZnSO4*7H2O, NiSO4*7H2O). Опыт проводили в водной культуре (22-24°С, 16/8 ч свет/темнота, плотность потока фотонов 80 мкМ>м-2-с-1). На 7-е сутки роста в листьях пшеницы спектрофотометрическими методами определяли скорость генерации супероксидного анион-радикала (в основе метода - способность этого радикала превращать адреналин в адрено-хром) [8], интенсивность ПОЛ (по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой) [15] и активность каталазы (по разложению пероксида водорода) [22].
Все опыты проводили в 3 отдельных повторностях. Каждый вариант включал 3 аналитические повторности. Результаты обрабатывали статистически по общепринятым биометрическим формулам с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Реакция растений на ТМ проявляется в виде различных эффектов, среди которых - торможение роста, изменение морфологии, структуры
растения, нарушения физиологических процессов, биохимические изменения [10, 23-25]. В наших опытах мы наблюдали, что ионы ТМ в субоптимальных концентрациях не оказывали токсического действия, иногда даже стимулировали рост осевых органов пшеницы (Си2), в то же время сублетальные концентрации изученных ТМ оказывали токсическое действие на растения: резко ингибировали ростовые параметры и снижали индекс толерантности молодых растений.
Для раскрытия механизмов токсического действия ТМ, связанных с возникновением окислительного стресса в проростках, мы исследовали скорость генерации О2" , интенсивность ПОЛ и активность каталазы в побегах пшеницы.
Одной из наиболее опасных для растительной клетки АФК является супероксидный анион-радикал, скорость образования которого возрастает при различных стрессах, в том числе при действии ТМ [6, 11, 25]. Поскольку О2" -очень нестабильный радикал, измеряли скорость генерации О2" в листьях пшеницы, особый упор делая на изменение скорости генерации при действии тяжелых металлов (РЬ2+, Си2+, Zn2+, №2+).
Показано, что выращивание растений пшеницы на растворах, содержащих ионы №2+, индуцировало максимальную величину генерации О2" в листьях (141 и 157% к контролю при концентрациях 10 мкМ и 1 мМ соответственно) (рис. 1). Ионы меди слегка повышали стационарный уровень О2" (на 8%), а сублетальная концентрация ионов РЬ2+ увеличивала генерацию О2" на 34%. В то же время на фоне 10 мкМ РЬ2+ и 1 мМ Zn2+ наблюдали снижение уровня О2" на 30 и 14% соответственно. Как правило, скорость генерации О2" имела тенденцию к повышению с увеличением концентрации металла в среде выращивания (напри-
0
1 СІ
< „ сЗ а.
700
600
500
400
^300
(О
О.
I-
I
Ф
=г
X
о
200 ■ 100 0
лЗЕ
вода
■ ■ I
10 1 мМ 10 1 мМ 10 1 мМ 10 1 мМ
мкМ мкМ мкМ мкМ
N1 РЬ гп Си
Концентрация металла
□ контроль ■ цитодеф
Рис. 2. Влияние тяжелых металлов и цитодефа на интенсивность ПОЛ в листьях пшеницы, % к водному контролю
мер, в опытах с ионами №2+ и РЬ2), хотя в ряде случаев эта тенденция была не выражена однозначно.
Предпосевная обработка цитодефом значительно повышала скорость генерации супероксида в варианте без тяжелых металлов (вода), т.е. препарат не обладал выраженным антиок-сидантным действием. Аналогичные эффекты цитодефа выявлены также при действии некоторых ТМ. Так, на фоне ионов №2+ показано резкое увеличение генерации супероксида (342 и 419% при 10 мкМ и 1 мМ). Субоптимальная и сублетальная концентрации Си2+ также индуцировали повышение уровня генерируемого О2" на 236 и 36% соответственно. По сравнению с необработанными препаратом растениями, скорость генерации супероксидного анион-радикала резко возрастала на фоне ионов №2+, Си2+ и 1 мМ Zn2+ (в 1.3—3.1 раза). В то же время регулятор роста цитодеф существенно снижал скорость генерации О2" на фоне 10 мкМ Zn2+ (на 42%) и проявлял тенденцию к уменьшению скорости генерации при 10 мкМ и 1 мМ РЬ2+.
Процесс перекисного окисления липидов является существенной причиной накопления клеточных дефектов [7]. Свободнорадикальные продукты ПОЛ и карбонильные соединения, например малоновый диальдегид (МДА), обладают сильным повреждающим действием [14]. Для оценки уровня ПОЛ у растений пшеницы определяли накопление продукта окисления липидов МДА после воздействия различных концентраций ТМ. Обнаружено, что интенсивность образования МДА в листьях пшеницы существенно и неоднозначно зависела от металла и его концентрации в среде (рис. 2). Так, максимальную концентрацию МДА в листьях пшеницы (285% к водному контролю) отмечали на фоне 1 мМ Си2+;
небольшое превышение контроля - при действии
■•2+
№ . Однако в опытах с выращиванием растений на фоне Zn2+ и 10 мкМ РЬ2+ уровень МДА был почти в 2 раза ниже водного контроля.
Цитодеф показал некоторое снижение интенсивности ПОЛ в водном контроле, однако на фоне ТМ концентрация МДА существенно снижалась в присутствии цитодефа только в опыте с ионами РЬ2+ (на 60 и 39% при концентрациях 1 мМ и 10 мкМ соответственно). В опыте с выращиванием пшеницы на растворах, содержащих Zn2+, препарат не повлиял на уровень МДА, а на фоне ионов №2+ и Си2+ цитодеф приводил к резкому увеличению интенсивности ПОЛ (в 1.2—4.1 раза).
Каталаза - один из ведущих ферментов, утилизирующих пероксид водорода в растительном организме. Активность этого фермента является хорошим показателем сопротивляемости растений окислительному стрессу. В ходе исследования регистрировали увеличение активности фермента на фоне металлов (рис. 3). Так, максимальное увеличение активности каталазы отмечали при 1 мМ №2+ (на 92% к водному контролю), минимальное - при 10 мкМ №2+ (на 8%). Поскольку каталаза - индуцибельный фермент, активность которого возрастает при увеличении уровня субстрата (Н2О2), то увеличение активности каталазы на фоне длительного действия ТМ можно расценивать как следствие повышенного содержания пероксида водорода в клетках листьев пшеницы [26].
Обработка цитодефом на фоне ТМ (но не в водном контроле) всегда проявляла повышенную активность каталазы (в 1.2-2 раза выше водного контроля), однако направленность изменений активности этого фермента при действии различных ТМ была неодинаковой. Так, цитодеф достоверно снижал активность катала-зы (по сравнению с вариантами без регулятора роста) на фоне сублетальной концентрации №2+ и Zn2+ (на 28 и 22% соответственно) и субопти-мальной концентрации РЬ2+ (на 17%), а в остальных вариантах опыта наблюдали отсутствие достоверных различий или повышение активности фермента.
250
x 200 -----------------------------—------------------------------------------------------------
10
мкМ
1 мМ
10
мкМ
1 мМ
10
мкМ
1 мМ
10
мкМ
1 мМ
вода
Ni
Pb
Zn
Cu
Концентрация металла
□ контроль ■ цитодеф
Рис. 3. Влияние тяжелых металлов и цитодефа на активность каталазы, % к водному контролю
Результаты исследований свидетельствуют о том, что наиболее выраженные неблагоприятные проявления окислительного стресса в растениях пшеницы вызывали ионы меди, несколько слабее - ионы никеля. Свинец по своему влиянию на физиологические показатели пшеницы характеризовался средним воздействием. Отрицательное воздействие ионов цинка проявлялось лишь при довольно высокой его концентрации в среде.
Заключение
Тяжелые металлы индуцировали повышение уровня супероксидного анион-радикала, возрастание интенсивности ПОЛ и активности катала-зы в листьях пшеницы в ряду Zn2+ < РЬ2+ < №2+ < Си2+. Цитодеф повышал скорость генерации супероксида на фоне ионов № и Си и, как следствие, повышал интенсивность ПОЛ, но существенно снижал активность каталазы по сравнению с водным контролем на фоне тех же ионов.
Таким образом, ионы тяжелых металлов индуцировали окислительный стресс в клетках растений пшеницы. Действие регулятора роста цитодефа на растения неоднозначно и зависело от исходного окислительного статуса. На фоне ионов свинца и 10 мкМ цинка, когда окислительные повреждения были минимальны, цито-деф снижал скорость генерации супероксидного аниона, интенсивность ПОЛ и активность ката-лазы, в то время как при действии ионов никеля и меди все изученные показатели повышались. Возможно, для проявления протекторного действия цитодефа на фоне ионов никеля и меди необходимо использовать другие концентрации данного регулятора роста. Механизмы столь различного действия цитодефа на фоне ТМ должны явиться предметом дальнейшего исследования.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы», проект 2.1.1/624).
Список литературы
1. Башмаков Д.И., Лукаткин А.С. Экологофизиологические аспекты аккумуляции и распределения тяжелых металлов у высших растений / Под общ. ред. проф. А.С. Лукаткина. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. 2009. 236 с.
2. Веселов А.П. Математическая модель возможного триггера обратимого включения режима стресса у растений // Физиология растений. 2001. Т. 48. № 1. С. 124-131.
3. Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология. 1995. Т. 37. Вып. 12. С. 66-87.
4. Mittler R. Oxidative Stress, Antioxidants and StressTtolerance // Trends in plant science. 2002. V. 7. Issue 9. N 1. P. 405-410.
5. Boominathan R., Doran P.M. Ni-induced oxidative stress in roots of the Ni hyperaccumulator, Alyssum ber-tolonii // New Phytol. 2002. V. 156. P. 205-215.
6. Gajewska E., Sklodowska M. Effect of nickel on ROS content and antioxidative enzyme activities in wheat leaves // BioMetals. 2007. V. 20. P. 27-36.
7. Курганова Л.Н., Балалаева И.В., Веселов А.П., Синицына Ю.В., Васильева Е.А., Цыганова М.И. Прооксидантно-антиоксидантный статус хлоропла-стов гороха при действии стрессирующих абиотических факторов среды: 1. Продукция активных форм кислорода и липопероксидация // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 2 (2). С. 544-549.
8. Лукаткин А.С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 1. Образование активированных форм кислорода при охлаждении растений // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 5. С. 697-702.
9. Vassilev A., Lidon F., Scotti P., Da Graca M., Ior-danov I. Cadmium-induced changes in chloroplast lipids and photosystem activites in barley plants // Biol. Plant. 2004. V. 48. N 1. P. 153-156.
10. Baccouch S., Chaoui A., Ferjani E.E. Nickel toxicity induces oxidative damage in Zea mays roots I II J. Plant Nutrition. 2001. V. 24. N 7. P. 1085-1097.
11. Choudhury S., Panda S.K. Role of salicylic acid in regulating cadmium induced oxidative stress in Oryza sativa L. roots II Bulg. J. Plant Physiol. 2004. V. 30. N 3-4. P. 95-110.
12. Wang Z., Zhang Y.X., Huang Z.B., Huang L. Antioxidative response of metal-accumulator and nonaccumulator plants under cadmium stress II Plant Soil. 2008. V. 310. P. 137-149.
13. Ли Т.К., Лу Л.Л., Жу Е., Гупта Д.К., Ислам Е., Янг Х.Е. Лнтиоксидантная система в корнях двух контрастных экотипов Sedum alfredii при повышенных концентрациях цинка II Физиология растений. 2008. Т. 55. № 6. C. 886-894.
14. Курганова ЛЛ., Веселов Л.П., Синицына Ю.В., Еликова Е.И Продукты перекисного окисления липидов как возможные посредники между воздействием повышенной температуры и развитием стресс-реакций у растений II Физиология растений. 1999. Т. 46. № 2. G. 276-282.
15. Лукаткин Л^., Голованова В^. Интенсивность перекисного окисления липидов в охлажденных листьях теплолюбивых растений II Физиология растений. 1988. Т. 35. Вып. 4. G. 773-779.
16. Лукаткин AG., Башмаков Д.И., Кипайкина НВ. Протекторная роль обработки тидиазуроном проростков огурца при действии тяжелых металлов и охлаждения II Физиология растений. 2003. Т. 50. G. 346-348.
17. Лукаткин Л^., Грачева КВ., Гришенкова H.H., Духовскис П.В., Бразайтите Л.Л. Цитокинин-подобные препараты ослабляют повреждения растений кукурузы ионами цинка и никеля II Физиология растений. 2007. Т. 54. G. 432-439.
18. Прусакова Л.Д., Малеванная Н.Н., Белопухов С.Л., Вакуленко В.В. Регуляторы роста с антистрессовыми и иммунопротекторными свойствами // Агрохимия. 2005. № 11. С. 76-86.
19. Шаповалов А.А., Зубкова Н.Ф. Отечественные регуляторы роста растений // Агрохимия. 2003. № 11. С. 33-47.
20. Зубкова Н.Ф., Шаповалов А.А. Цитодеф - новый регулятор роста растений // Защита и карантин растений. 2003. № 3. С. 27-28.
21. Лукаткин А.С., Овчинникова О.В. Влияние препарата цитодеф на рост и холодоустойчивость теплолюбивых растений // Агрохимия. 2009. № 12. С. 32-38.
22. Patterson B.D., Payne L.A., Chenl L.Y. and Graham D. An inhibitor of catalase induced by cold in chilling-sensitive plants // Plant Physiology. 1984. V. 76. P. 1014-1018.
23. Briat J.F., Lebrun M. Plant responses to metal toxicity // Plant Biology and Pathology. 1999. V. 322. N 1. P. 43-54.
24. Серегин И.В., Иванов В.Б. Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения // Физиология растений. 2001. Т. 48. № 4. С. 606-630.
25. Babar A.M., Hahn Eun-Joo, Paek Kee-Yoeup. Copper-induced changes in the growth, oxidative metabolism, and saponin production in suspension culture roots of Panax ginseng in bioreactors // Plant Cell Repts. 2006. V. 25. N 10. P. 1122-1132.
26. Hager J., Ezzeddine El.F. Effect of copper excess on superoxide dismutase, catalase, and peroxidase acti-vites in sunflower seedlings (Helianthus annuus L.) // Acta Physiologiae Plantarum. 2004. V. 26. N 1. P. 29-35. DOI: 10.1007/s11738-004-0041-8.
EFFECT OF CYTODEF ON OXIDATIVE STATUS IN WHEAT SEEDLINGS AFFECTED BY HEAVY METALS
K.A. Sazanova, D.I. Bashmakov, A. S. Lukatkin
The effect of sublethal (1 mM) and suboptimal (10 ^M) concentrations of heavy metals (HM) and Cytodef (a cy-tokinin-like plant growth regulator) has been studied on the formation of superoxide anion radical (02-*-), the intensity of lipid peroxidation (LPO) and catalase activity in young leaves of winter wheat (Triticum aestivum L. cv. Mi-ronovskaya 808) seedlings. Some heavy metals, especially Ni and Cu, induced the enhanced indexes of oxidative stress intensity. In most experiments, toxicity increased with the enhancement of HM concentration. Seed treatment with the growth regulator Cytodef influenced differently the degree of oxidative damage: in the case of Ni2+ h Cu2+, it increased the formation of (02-*-), LPO intensity and catalase activity, whereas in the case of Zn2+ and Pb2+, it reduced all these parameters.
Keywords: Triticum aestivum L., heavy metals, oxidative stress, growth regulators, Cytodef, superoxide anion radical, lipid peroxidation, catalase.
