CC BY
82
Вопросы общей патологии
УДК 616.831-005.4-008.9:615.21
ВЛИЯНИЕ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНЫХ СРЕДСТВ НА РАЗВИТИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС
Е. В. Ганцгорн*, Т. С. Колмакова, Ю. С. Макляков, Д. П.Хлопонин
ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, 344022, Россия, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, д. 29
РЕЗЮМЕ Посредством мониторинга показателей перекисного окисления липидов в крови на модели глобальной церебральной ишемии у крыс изучались эффекты церебропротекторных средств разного механизма действия. Установлено, что превентивное применение комбинации винпоцетина и мелаксена значительно уменьшает степень неблагоприятного воздействия циркуляторной ишемии на функциональное состояние головного мозга.
Ключевые слова: ишемия головного мозга, церебропротекторные средства, пероксидация липидов.
* Ответственный за переписку (corresponding author): e-mail: [email protected]
Ишемия головного мозга (ИГМ) - мультифактор-ный процесс, включающий, в том числе, снижение энергопродукции с нарушением активного трансмембранного транспорта ионов, функциональные нарушения в эксайтотоксических нейромедиатор-ных системах мозга. Наряду с этим на фоне развивающегося метаболического ацидоза происходит гиперпродукция свободных радикалов и активация реакций оксидантного стресса [1]. При недостаточности антиоксидантной системы процессы пе-роксидации усиливаются, происходит избыточное образование первичных продуктов свободноради-кального окисления (СРО) (свободных перекисных радикалов и гидроперекисей липидов), обеспечивающих аутокаталитический характер перекисного окисления липидов (ПОЛ), и конечных продуктов СРО (альдегидов и кетонов) [2]. Накопление в
нервной ткани продуктов ПОЛ и развитие эндоток-сикоза приводит к стимуляции монооксигеназной системы, изменениям липидного, гормонального, микроэлементного, нейромедиаторного статусов, истощению антиоксидантной системы [10]. Как следствие, образуются сшивки биополимеров, наблюдается набухание митохондрий и разобщение окислительного фосфорилирования, инактивация тиоловых ферментов, участвующих в дыхании и гликолизе, дальнейшее разрушение липидной основы мембран [4]. В совокупности эти процессы приводят к нарушениям деятельности головного мозга, коррекция которых требует длительного времени. В связи с этим поиск новых подходов к профилактике и терапии ИГМ является одной из актуальных проблем экспериментальной и клинической фармакологии.
OXIDATION STRESS DEVELOPMENT IN EXPERIMENTAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RATS: INFLUENCE OF CEREBROPROTECTIVE AGENTS
Gantsgorn E. V., Kolmakova T. S., Maklyakov Yu. S., Khloponin D. P.
ABSTRACT The effects of cerebroprotective agents of various action mechanisms were studied by monitoring of blood lipids peroxidation upon the model of global cerebral ischemia in rats. It was stated that the preventive administration of vinpocetin&melaxen combination diminished the degree of unfavorable effect of circulatory ischemia upon the brain functional status to the considerable extent.
Key words: cerebral ischemia, cerebroprotective agents, lipids peroxidation.
Необходимо отметить, что значительное влияние на СРО могут оказывать лекарственные средства различных групп, в том числе церебропротекто-ры, широко применяемые при ИГМ [3, 5, 7, 8]. Это делает необходимым изучение их потенциальных анти-и прооксидантных свойств.
Цель настоящего исследования - изучить показатели ПОЛ в крови крыс с экспериментальной ИГМ (ЭИГМ) при превентивном введении отдельно друг от друга и в комбинациях церебро-протекторных средств различного механизма действия: пирацетама («эталонного» ноотропа), мелаксена (химического аналога биогенного амина мелатонина, обладающего антиокси-дантными свойствами), винпоцетина (терапевтическая эффективность которого связана с сочетанием церебропротекторного, вазоактивного и антиоксидантного эффектов), а также проанализировать влияние изучаемых препаратов на СРО.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 56 половозрелых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г. Животные содержались в условиях вивария при естественном освещении, в пластиковых клетках размером 55 * 45 * 15 см, с подстилкой из древесных опилок, по шесть голов в клетке. Крысы потребляли гранулированный комбикорм и воду ad libitum в поилках объемом 200 мл. Для эксперимента животных забирали после семидневного карантина. Все манипуляции выполнены в соответствии с рекомендациями по гуманному обращению с лабораторными животными, утвержденными этическим комитетом РостГМУ.
В соответствии с протоколом исследования за 14 дней до ЭИГМ животные были разделены на 7 групп (2 контрольных и 5 опытных), по 8 крыс в каждой. Из двух контрольных одну группу составили ложнооперированные животные (группа ЛО) и одну - крысы, подвергшиеся ЭИГМ (группа ЭИ); обе группы получали в течение 14 дней физиологический раствор в дозе 0,2 мл/сут внутримышечно. Крысам опытных групп в течение 14 дней вводились изучаемые препараты: пирацетам в дозе 300 мг/кг/сут внутримышечно (группа 1); мелаксен в дозе 0,25 мг/кг/сут per os (группа 2); винпоцетин в дозе 5 мг/кг/сут внутрибрюшинно (группа 3); пирацетам в сочетании с мелаксеном в вышеуказанных дозах (группа 4) и винпоцетин в комбинации с мелаксеном (группа 5), а затем производилась ЭИГМ.
ЭИГМ моделировалась путем одновременной перевязки левой и правой сонных артерий. Все хирургические процедуры проводили в сте-
рильных условиях под тиопенталовым (120 мг/ кг внутрибрюшинно) наркозом. Затем операционную рану обрабатывали 5%-ным спиртовым раствором йода и послойно ушивали, а через 24 ч фиксировали количество выживших крыс во всех группах и после декапитации животных под эфирным наркозом производили забор крови.
Получение хлороформных липидных экстрактов осуществляли по методу Е. Блая и У. Дайера [9]. Концентрацию первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) - определяли в хлороформных экстрактах плазмы крови спектрофото-метрическим методом на приборе DU-800 фирмы «Beckman Coulter» (США) и выражали в нмоль/мл.
Содержание вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) - устанавливали на том же спектрофотометре методом И. Д. Стальной и Т. Г. Гаришвили [6] и выражали в нмоль/мл.
Уровень конечных продуктов ПОЛ - шиффовых оснований (ШО) - определяли спектрофлуоро-метрически на приборе «Shimadzu» RF-5301PC (Япония) и выражали в отн. ед./мл.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием общепринятых методов параметрической статистики (t-критерия Стьюдента) при помощи пакета программ «Statists 6.0». Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ выживаемости крыс показал, что в группе ЛО 24-часовую окклюзию сонных артерий переживали 100% крыс. Показатели летальности в остальных группах представлены в табл. 1.
Наибольшей летальность была в группе ЭИ -65,2%. Введение изучаемых препаратов повышало выживаемость животных, причем наиболее эффективной оказалась комбинация винпоцети-на и мелаксена: в группе 5 летальность была почти в 2 раза ниже, чем у животных группы ЭИ, не получавших препаратов.
Результаты анализа показателей ПОЛ в крови крыс всех групп приведены в табл. 2.
Через сутки после лигирования сонных артерий в крови крыс группы ЭИ, по сравнению с контрольными показателями в группе ЛО, был статистически значимо выше уровень МДА (9,14 и 7,07 нмоль/мл соответственно) и ШО (2,20 и 1,38 отн. ед./мл соответственно). Это указывает на распространение цепных реакций СРО за счет липидных субстратов при эндогенной индукции процесса и на развитие окислительного стресса при ИГМ.
12
Церебропротекторные средства при ишемии головного мозга
Таблица 1. Влияние изучаемых препаратов на показатели выживаемости крыс при экспериментальной ишемии головного мозга
Группы Количество прооперированных животных Количество животных, переживших 24-часовую окклюзию сонных артерий Летальность, %
ЭИ 23 8 65,2
1 (пирацетам) 18 8 55,5
2 (мелаксен) 16 8 50,0
3 (винпоцетин) 15 8 46,6
4 (пирацетам и мелаксен) 14 8 42,8
5 (винпоцетин и мелаксен) 12 8 33,3
Таблица 2. Влияние изучаемых препаратов на показатели перекисного окисления липидов в крови при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс, М ± т
Группы ДК, нмоль/мл МДА, нмоль/мл ШО, отн. ед./мл
ЛО 1,55 ± 0,04 7,07 ± 0,35 1,38 ± 0,01
ЭИ 1,66 ± 0,04* 9,14 ± 0,38* 2,20 ± 0,13*
1 (пирацетам) 1,61 ± 0,03** 9,76 ± 0,467* 1,72 ± 0,18*, **
2 (мелаксен) 2,172 ± 0,25*, ** 8,047 ± 0,43*, ** 1,57 ± 0,12*, **
3 (винпоцетин) 1,69 ± 0,04* 6,69 ± 0,35** 1,52 ± 0,15**
4 (пирацетам и мелаксен) 1,83 ± 0,08* 9,70 ± 0,31* 1,51 ± 0,16**
5 (винпоцетин и мелаксен) 2,20 ± 0,07*, ** 7,04 ± 0,21** 1,42 ± 0,07**
Примечание. Статистическая значимость различий: * - по сравнению с группой ЛО (р < 0,05); ** - по сравнению с группой ЭИ (р < 0,05).
На основании полученных данных вызвало интерес влияние препаратов с разным механизмом действия на активность СРО и кумуляцию его продуктов при ЭИГМ.
Изучение действия пирацетама показало, что данный препарат не влияет на активность инициальных процессов ПОЛ. В крови крыс группы 1 содержание как ДК, так и МДА статистически значимо не отличалось от показателей животных группы ЭИ. Эти факты свидетельствует о том, что ингибирующий контроль за разветвлением цепей окисления, который ограничивал бы образование вторичных продуктов ПОЛ (МДА), пирацетам осуществить не может.
Несколько неожиданными оказались результаты исследования эффекта мелаксена. Его профилактическое введение крысам с дальнейшей ЭИГМ показало, что этот препарат не влияет на инициальные процессы ПОЛ: содержание ДК в крови крыс группы 2 становилось даже больше, чем у животных как группы ЛО, так и группы ЭИ (на 40 и 30,8% соответственно). В то же время содержание МДА в крови крыс группы 2 заметно (на 13,5%) снизилось по сравнению с таковым у животных группы ЭИ и достоверно не отличалось от такового у животных группы ЛО. Что касается
концентрации ШО, то она была ниже таковой в группе ЭИ на 40,1%, однако следует отметить, что снижения содержания ШО до контрольных значений не происходило: их уровень в крови животных группы 2 превышал таковой в группе ЛО на 13,7%. Таким образом, данные о содержании в крови крыс группы 2 вторичных (МДА) и конечных (ШО) продуктов окисления липидов позволяют предположить, что введение мелаксена приводит к некоторому ограничению распространения ПОЛ и способствует обрыву цепей перок-сидации.
Винпоцетин, по аналогии с мелаксеном, проявил способность ограничивать накопление продуктов ПОЛ у экспериментальных животных. Самые значимые изменения происходили в содержании ШО: их уровень в крови животных группы 3 снизился по сравнению с таковым в группе ЭИ на 44,7% и почти достиг контрольных значений группы ЛО.
Использование пирацетама и мелаксена у животных с ЭИГМ ограничивало проявление антиокси-дантных свойств мелаксена. На это указывало накопление в крови крыс группы 4 МДА, содержание которого было столь же высоким, как у крыс группы ЭИ: 9,7 и 9,13 нмоль/мл соответственно.
Кроме того, у крыс группы 4 статистически значимо повышался уровень ДК, относительно показателей как группы ЛО, так и группы ЭИ. И только содержание ШО в крови животных этой группы стало достоверно ниже относительно показателей группы ЭИ. Возможно, пирацетам, повышая метаболическую активность клеток поврежденного головного мозга, стимулирует дополнительную продукцию в клетке веществ, обладающих про-оксидантными свойствами. Вследствие этого как антиоксидантной емкости клеток, так и антиокси-дантного потенциала мелаксена недостаточно для восстановления функционального баланса в системе СРО, что способствует распространению цепей ПОЛ.
Несколько иная картина наблюдалась при введении винпоцетина в комбинации с мелаксеном. В крови крыс группы 5 концентрация ДК была на 32% выше, чем у животных группы ЭИ, тогда как содержание МДА снижалось на 29,7%; был достоверно ниже и уровень ШО (1,42 и 2,20 отн. ед./мл соответственно). Таким образом, введение вин-поцетина и мелаксена приводило к синергичному ограничению распространения цепей ПОЛ у крыс с ЭИГМ. По всей видимости, при совместном применении данные препараты способны усиливать эффекты друг друга, восстанавливая не только окислительный баланс клетки, но и клеточный го-меостаз в целом.
ВЫВОДЫ
Превентивное ведение изучаемых церебропро-текторных препаратов снижало летальность животных при ЭИГМ, и наиболее эффективной среди них была комбинация винпоцетина и ме-лаксена.
Церебропротекторные препараты с разным механизмом действия обладают способностью в той или иной мере ограничивать развитие СРО при ЭИГМ у крыс.
В условиях поставленного эксперимента пираце-там в меньшей степени, чем другие изучаемые препараты, ограничивал ПОЛ.
Наибольшую эффективность в ограничении ПОЛ на модели ЭИГМ у крыс проявила комбинация винпоцетина и мелаксена. Следовательно, применяя при ИГМ эти препараты совместно, можно ожидать лучший фармакодинамический эффект в виде повышения устойчивости головного мозга к гипоксии, чем при отдельном их использовании.
Полученные результаты могут быть использованы при рассмотрении вопроса о возможности и целесообразности включения лекарственных препаратов нейрогормона мелатонина в клиническую фармакотерапию и фармакопрофилактику ИГМ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гусев, Е. И. Ишемия головного мозга / Е. И. Гусев,
B. И. Скворцова. - М. : Медицина, 2001. - 328 с.
2. Зозуля, Ю. А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга / Ю. А. Зозуля, В. А. Барабой, Д. А. Сутковой. - М. : Знание, 2000. - 100 с.
3. Костычев, Н. А. Влияние производных 3-гидрок-сипиридина на течение ишемического инсульта у белых крыс / Н. А. Костычев, А. Б. Коршунова // Неврологический вестник. - 2010. - Т. 42, Вып. 2. -
C. 19-22.
4. Механизмы повреждения ткани мозга на фоне острой фокальной ишемии / Е. И. Гусев [и др.] // Журн. неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. - 1999. - № 2. - С. 65-70.
5. Нейропротекторные эффекты кортексина у крыс с различной устойчивостью к гипоксии при хронической ишемии головного мозга / Т. В. Павлова [и др.] // Психофармакол. биол. наркол. - 2008. - Т. 8, № 1-2 (Ч. 1). - С. 2248-2254.
6. Стальная, И. Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И. Д. Стальная, Т. Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии / под ред. В. Н. Ореховича. -М. : Медицина, 1977. - С. 66-68.
7. Султанов, В. С. Церебропротекторные и энергоста-билизирующие эффекты полипренольного препарата ропрена при ишемии головного мозга у крыс / В. С. Султанов, И. В. Зарубина, П. Д. Шабанов // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2010. - Т. 8, № 3. - С. 31-47.
8. Эффективность препарата «мексидол» при экспериментальной ишемии головного мозга / Н. И. Не-чипуренко [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2006. - Прил. 1. - С. 224-229.
9. Bligh, E. Rapid method of lipids extraction and purification / E. Bligh, W. Dyer // Can. J. Biochem. Physiol. - 1959. - Vol. 37, № 8. - P. 203-209.
10. Intraluminal increase of superoxide anion follow transient focal cerebral ischemia in rats / T. Mori [et al.] // Brain Res. - 1999. - Vol. 8. - № 2. - P. 350-357.
