CC BY
36
ВЛИЯНИЕ ТРАНСДУКЦИИ ЗВЕЗДЧАТЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ АДЕНОВИРУСНЫМ ВЕКТОРОМ Ad5-optHGF-optFGF-4-RFP НА ИХ ФЕНОТИП IN VITRO И IN VIVO
Э.И. Шарипова 12, А.А. Титова 1, А.К. Шафигуллина 1, А.Р. Галявиева 21, Е.Е. Гаранина 1, М.О. Мавликеев 1, Г.О. Певнев 1, Г.Р. Бурганова 1, М.А. Титова 1, А.А. Ризванов 1, А.А. Гумерова 1, А.П. Киясов 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
Influence of hepatic stellate cells transduction by adenoviral vector Ad5-optHGF-optFGF-4-RFP on their phenotype in vitro and in vivo
E.I. Sharipova 12, AA. Titova 1, A.K. Shafigullina 1, A.R. Galyavieva 2 1, E.E. Garanina 1, MO. Mavlikeev 1, G.O. Pevnev1, G.R. Burganova 1, M.A. Titova 1, АА. Gumerova 1, A.P. Kiyasov1
1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
В настоящее время активно разрабатываются методы генной и клеточной терапии для лечения заболеваний печени . Новым подходом, потенциально способным повысить терапевтический потенциал трансплантируемых клеток, может стать их генетическая модификация . Предполагается, что генные манипуляции с клетками, а именно получение и использование клеток, экспрессирующих и гиперэкспрес-сирующих лечебные факторы, позволит уменьшить необходимую для трансплантации терапевтическую дозу клеток и значительно повысить их терапевтический эффект . Однако неясным остается ответ на вопрос о том, как генетические модификации отражаются на фенотипе самих клеток, в частности, звёздчатых клеток печени, и какой терапевтический эффект будут оказывать такие клетки при их введении в организм . Целью нашей работы стало изучение фенотипа звёздчатых клеток печени после их генетической модификации аденовирусным вектором Ad5-optHGF-optFGF-4-RFP in vitro и in vivo после трансплантации крысам, перенёсшим операцию частичной гепатэктомии . В результате были получены данные, подтверждающие, что трансплантация звёздчатых клеток печени, трансдуцированных терапевтическими генами, оказывает положительное влияние на процесс регенерации печени, при этом морфология и фенотип клеток остаются неизменными, что позволяет сделать вывод о безопасности их применения в регенеративной медицине
Ключевые слова: звёздчатые клетки печени, частичная гепатэктомия, трансдукция, аденовирусный вектор, факторы роста
Nowadays gene and cell therapy methods for liver diseases treatment are being actively developed . Genetic modification of cells could be an approach that considerably increases the therapeutic potential of transplanted cells . It is assumed that the genetic manipulation, particularly obtaining and application of cells, that express and overexpress therapeutic factors, could reduce the therapeutic dose of transplanted cells and noticeably enhance therapeutic effects of these cells . However, it remains unclear, how genetic modification influences on cellular phenotype, in this case hepatic stellate cells, and what kind of therapeutic effect will give these cells after transplantation into the organism
The aim of our work was to study the phenotype of hepatic stellate cells after genetic modification by the adenoviral vector Ad5-optHGF-optFGF-4-RFP in vitro and in vivo and after subsequent transplantation into the rats with partial hepatectomy As a result, it was confirmed that transplantation of hepatic stellate cells, transduced with therapeutic genes, has a positive influence on the process of liver regeneration while the morphology and phenotype of cells remain unchanged . So, we can make a conclusion of safety of this method for use in regenerative medicine
Keywords: hepatic stellate cells, partial hepatectomy, transduction, adenoviral vector, growth factors .
Введение
Звёздчатые клетки печени (ЗКП) — один из самых малоизученных видов клеток печени . На протяжении 130 лет были исследованы и описаны различные свойства и функции этих клеток, что нашло отражение в многочисленных названиях этой популяции непаренхиматозных клеток печени: липоциты печени, жиронакапливающие клетки печени, перисинусои-дальные клетки печени, витамин-А-накапливающие клетки, клетки Ито . Несмотря на большую историю изучения, вопросов, касающихся фенотипа и значения этих клеток в развитии и регенерации печени, намного больше, чем ответов [1].
Известно, что ЗКП продуцируют различные факторы роста, которые являются митогенами для клеток печени, а также индуцируют гепатоцитарную диффе-ренцировку прогениторных клеток [2]. В настоящее время среди большого спектра синтезируемых ЗКП факторов большое внимание привлекают фактор роста гепатоцитов (Hepatocyte growth factor, HGF)
e-mail: Elwishdoc@gmail . com
[3—6] и фактор роста фибробластов-4 (Fibroblast growth factor-4, FGF-4) [7—10]. Вышеперечисленные факторы играют важную роль в пренатальном онтогенезе печени, а также в ходе печеночного этапа гемопоэза для дифференцировки клеток крови [11]. Фактор роста гепатоцитов активирует синтез ДНК при повреждении гепатоцитов [12—14], также он необходим для нормального развития эпителиальных клеток печени, их выживания, пролиферации и миграции [12, 15, 16]. В свою очередь FGF-4 является одним из ключевых факторов роста для дифферен-цировки клеток-предшественниц в эпителиальные клетки печени — гепатоциты и холангиоциты, в ходе ее пренатального гистогенеза [2].
В настоящее время активно разрабатываются методы генной и клеточной терапии для лечения заболеваний печени. Ранее нами была показана способность ЗКП после их трансплантации крысам с частичной гепатэктомией встраиваться в поврежденный орган и оказывать положительное влияние
на регенерацию печени реципиента [17]. Одной из возможных стратегий повышения терапевтического потенциала трансплантируемых клеток является их генетическая модификация с целью гипер-продукции ими различных факторов роста . Предполагается, что генные манипуляции с клетками, а именно получение и использование клеток, экспрессирующих и ги-перэкспрессирующих лечебные факторы, позволят уменьшить необходимую для трансплантации терапевтическую дозу клеток и значительно повысить их терапевтический эффект . Наиболее эффективным на сегодняшний день способом доставки генетического материала в клетки является вирусная транс-дукция клеток . Перенос генов с помощью аутогенных прогениторных клеток не вызывает такого сильного иммунного ответа организма, как при использовании прямого введения вирусных векторов in vivo. Однако неясным остается вопрос, как генетические модификации отражаются на фенотипе трансдуцируемых клеток, в данном случае ЗКП, и какой терапевтический эффект будут оказывать такие клетки после их введения в организм
Целью нашего исследования стало изучение фенотипа ЗКП после их генетической модификации аденовирусным вектором Ad5-optHGF-optFGF-4-RFP, содержащим HGF, FGF-4 и красный флуоресцентный белок (Red Fluorescent Protein, RFP) в качестве трейсерного гена in vitro и in vivo после их трансплантации крысам, перенесшим операцию частичной гепатэктомии .
Материал и методы
Исследование проведено на белых беспородных крысах-самцах массой 250—300 г, которые находились на стандартном рационе питания и имели постоянный свободный доступ к питьевой воде Выделение ЗКП проводили методом коллагеназно-проназной перфузии с последующим разделением в градиенте плотности гистоденза [18]. После этого производили подсчет клеток в камере Горяе-ва . Жизнеспособность клеток составляла 90% при окрашивании трипановым синим . Выделенные ЗКП культивировали в стандартных условиях в питательной среде ДМЕМ (Sigma, США) с содержанием 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Sigma, США), 146 мг/мл L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США) .
Для проведения генетической модификации ЗКП был создан рекомбинантный аденовирус, одновременно кодирующий кодон-оптимизированные последовательности HGF, FGF-4 и RFP . Клонирование осуществляли по технологии Gateway, базирующейся на сайт-специфической рекомбинации между сайтами att плазмиды-донора (pUCcoHGF-P2A-coFGF4-T2A-RFP) и вектора-назначения (pAd/CMV/V5-Dest). Трансфекция клеточной линии HEK293A рекомби-натной плазмидой pAd-coHGF-P2A-coFGF4-T2A-RFP привела к эффективной экспрессии рекомбинантных генов, что подтверждено иммунофлуоресцентным анализом с применением специфичных антител и получением высокого титра вирусных частиц [19].
Для трансдукции ЗКП аденовирусным вектором Ad5-optHGF-optFGF-4-RFP их инкубировали в течение часа в инкубаторе при 37°C и 5 % содержании СО2 во влажной атмосфере Генетически модифицированные ЗКП, содержащие в себе факторы роста HGF, FGF-4 и RFP вводили интраоперационно в воротную вену кры-
сам после частичной гепатэктомии (ЧГ), выполненной по методике Хиггенса и Андерсона под эфирным наркозом (во время которой удаляется 65—70% массы печени) . Контрольную группу составили интактные животные, которым в воротную вену вводили те же генетически модифицированные ЗКП . Животных выводили из эксперимента через 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 сут . после трансплантации клеток . Кусочки печени фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч и заливали в парафин по стандартной методике . Полученные срезы окрашивали антителами к RFP (GenScript, США), десмину (DAKO, США) -маркёру ЗКП, а-гладкомышечному актину (а-ГМА, DAKO, США) — маркёру миофибробластов .
Для оценки влияния аденовирусной трансдукции ЗКП на их фенотип in vitro проводили иммуноцито-химическое окрашивание культуры клеток через 1, 3, 7, 14 и 21 сут . культивирования с антителами к: десмину — маркёру ЗКП, а-ГМА — маркёру миофибробластов, C-kit (Novocastra, Великобритания) — маркёру рецептора фактора стволовых клеток, а также к цитокератину 18 (ЦК18, DAKO, США) — белку промежуточных филаментов цитоскелета гепатоци-тов, холангиоцитов, цитокератину 19 (ЦК19, Santa Crus, США) — белку промежуточных филаментов цитоскелета холангиоцитов, гепатобластов, PCNA (DAKO, США) — ядерному антигену пролиферирую-щих клеток, а-фетопротеину (а-ФП, Abcam, Великобритания) — секреторному протеину гепатобластов
Результаты и обсуждение
Свежевыделенные ЗКП in vitro имели округлую форму, на 2—3 сут культивирования они приобретали характерную для ЗКП звёздчатую форму с отростками . На 7 день культивирования, когда большинство клеток сформировало колонии, к культуре был добавлен аденовирусный вектор Ad5-optHGF-optFGF-4-RFP . Эффективность трансдукции оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии (рис . 1А), на 2 сут . она составляла около 70—80% .
Начиная с первого дня и на протяжении всех сроков эксперимента жизнеспособность ЗКП в обеих группах (в культуре с добавлением вируса и без него) оставалась стабильно высокой. Различий в морфологии ЗКП обеих групп также не обнаружено, на всех сроках выявлено позитивное окрашивание культивируемых клеток на десмин (рис . 1Б), что подтверждает принадлежность выделенных клеток к ЗКП .
Экспрессия C-kit была стабильной и выявлена на всех сроках культивирования и во всех клетках обеих групп, что косвенно указывает на их принадлежность к популяции прогениторных клеток (рис . 1В) . Как только клетки приобретали отростчатую форму (к 7 сут культивирования), они в обеих группах начинали экспрессировать а-ГМА (рис . 1Г). Различий между группами в экспрессии других белков (ЦК18 и 19, PCNA и а-ФП) также не выявлено .
Полученные данные показали отсутствие различий в морфологии и фенотипе ЗКП, которые культивировались в обычных условиях без добавления аденовирусного вектора, и генетически модифицированными ЗКП . Следовательно, закономерен вывод о том, что трансдукция ЗКП аденовирусным вектором, несущим гены факторов роста HGF и FGF-4, не влияет на жизнеспособность клеток и не изменяет существенно их морфологию и фенотип в условиях in vitro
Рис. 1.
Культура звездчатых клеток печени после трансдукции аденовирусным
вектором Ad5-optHGF-optFGF-4-RFP:
А — результат трансдукции, 2 сут.;
Б — реакция с антителами к десмину, 7 сут.;
В — реакция с антителами к С-кШ, 1 сут.;
Г — реакция с антителами к а-ГМА, 3 сут.
Продукт иммуноцитохимических реакций коричневого цвета;
докраска ядер — гематоксилин.
Ув.х200
При изучении морфологии трансдуцированных клеток in vivo на срезах печени крыс контрольной и экспериментальной групп на разных сроках после трансплантации обнаружены введенные ЗКП, экс-прессирующие трейсерный ген RFP Интересно, что RFP+ клетки имели различную морфологию: так, встречались клетки, имеющие форму и размеры гепатоцитов, мелкие округлые клетки с небольшим ободком цитоплазмы и клетки звёздчатой формы с отростками (рис . 2А, Б) . В контрольной группе в первые двое суток обнаруживались RFP+ мелкие округлые клетки, локализованные преимущественно в области портальных трактов, в среднем 8—10 кл ./ портальный тракт В печени животных, перенесших ЧГ, такие клетки были также расположены перипор-тально, единичные клетки встречались в паренхиме Вероятно, это — трансплантированные клетки, кото-
рые не вступают в дифференцировку, но сохраняют свою жизнеспособность и при необходимости могут участвовать в репопуляции клеток печени .
RFP+ клетки с морфологией гепатоцитов в экспериментальной группе появлялись с первых суток эксперимента, они были расположены по одной или группами по 2—3 клетки перипортально, а также тяжами вдоль оси ацинуса (рис . 2В) . Количество RFP+ клеток значительно возрастало ко 2 сут эксперимента, достигая уровня 20—25 клеток в поле зрения . В контрольной группе RFP+ гепатоциты появлялись в меньшем количестве через 3 сут . вокруг портальных трактов и в паренхиме . К 5 сут . число RFP+ ге-патоцитов было максимальным в обеих группах, но в экспериментальной группе таких клеток было существенно больше (рис . 2Г), далее количество RFP+ гепатоцитоподобных клеток постепенно снижалось
Рис. 2.
Печень крысы после ЧГ и трансплантации генетически модифицированных звездчатых клеток печени: А — реакция с антителами к RFP, 2 сут.; Б — реакция с антителами к RFP, 7 сут.; В — реакция с антителами к RFP, 1 сут.; Г — реакция с антителами к RFP, 5 сут.
Продукт иммуногистохимических реакций коричневого цвета; докраска ядер — гематоксилин. Ув.: А, В х200, Б, Г х400
Тот факт, что и в контрольной группе появляются гепатоцитоподобные RFP+ клетки, свидетельствует о том, что процесс регенерации и обновление популяции гепатоцитов происходит непрерывно, и поэтому трансплантированные клетки могут встраиваться даже в неповрежденную печень, приобретая морфологию гепатоцитов . Однако в экспериментальной группе интенсивность репопуляции печени трансплантированными клетками и скорость их диффе-ренцировки в гепатоцитоподобные клетки оказалась выше по сравнению с контролем, что подтверждает ранее высказанное предположение о том, что основным стимулом, усиливающим репопуляцию гепатоцитов за счет стволовых или прогениторных клеток, служит дефицит паренхиматозных клеток, вызванный повреждением [20]. Сравнение полученных данных с результатами трансплантации ЗКП, трансдуцированных только трейсерным геном зелёного флуоресцентного белка [21], свидетельствует о более выраженной репопуляции гепатоцитов после трансплантации ЗКП, трансдуцированных генами HGF и FGF-4, что подтверждает перспективность использования этих генов для трансдукции клеток, используемых при разработке методов генно-кле-точной терапии заболеваний печени
количество десмин-позитивных клеток в печени крыс, перенесших ЧГ, возрастало со 2 сут . и в целом было выше, чем в контрольной группе, где рост числа таких клеток наблюдали, начиная с 3 сут . Можно предположить, что увеличение числа дес-мин+ ЗКП в печени реципиента происходит не только вследствие активации собственных ЗКП, но также и за счет трансплантированных клеток . Ни на одном из сроков ни в одной из групп не было обнаружено а-ГМА-позитивных миофибробластов, что указывает на отсутствие трансдифференцировки ЗКП (как
ЛИТЕРАТУРА:
I. Гумерова А .А ., Киясов А . П . Могут ли перисинусоидальные клетки быть региональными стволовыми (прогениторными) клетками печени? Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; 1(5): 33-40 .
2 . Шафигуллина А . К . Влияние звёздчатых клеток печени на фенотип мезенхимных стволовых клеток крысы in vitro [диссертация]. Казань: Казанский ГМУ; 2013 .
3 . Schirmacher P ., Geerts A, Pietrangelo A et al . Hepatocyte growth factor/hepatopoietin A is expressed in fat-storing cells from rat liver but not myofibroblast-like cells derived from fat-storing cells . Hepatology 1992; 15(1): 5-11.
4 . Maher J .J . Cell-specific expression of hepatocyte growth factor in liver . Upregulation in sinusoidal endothelial cells after carbon tetrachloride . J . Clin . Invest . 1993; 91(5): 2244-52 .
5 . Ramadori G ., Neubauer К ., Odenthal M . et al . The gene of hepatocyte growth factor is expressed in fat-storing cell of rat liver and is downregulated during cell growth and by transforming growth factor-p . Biochem . Biophys . Res . Commun . 1992; 183(2): 739-42 .
6 . Lee C . S ., Friedman J . R ., Fulmer J .T. et al . The initiation of liver development is dependent on Foxa transcription factors . Nature 2005; 435: 944-47 .
7 . Marsden E . R ., Hu Z ., Fujio К . et al . Expression of acidic fibroblast growth factor in regenerating liver and during hepatic differentiation Lab . Invest . 1992; 67(4): 427-33 .
8 . Rosenbaum J ., Blazejewski S ., Préaux A.M . et al . Fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor beta 1 interactions in human liver myofibroblasts . Gastroenterology 1995; 109(6): 1986-96 .
9 . Pinzani M ., Knauss T . C ., Pierce G . F . et al . Mitogenic signals for platelet-derived growth factor isoforms in liver fat-storing cells Am J . Physiol . 1991; 260(3): 485-91.
10 Rosenbaum J , Blazejewski S Regulation of Ito cell proliferation by soluble factors . J . Hepatol . 1995; 22(2): 65-70 .
II. Gumerova A ., Kiassov A ., Abdulkhakov S . et al . Cell sources of liver development and regeneration In search of hepatic stem cells LAP Lambert Academic Publishing, 2012: 128 .
12 . Weidner К . M ., Arakaki N ., Hartmann G . et al . Evidence for the identity of human scatter factor and human hepatocyte growth factor Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 1991;88: 7001-5 .
реципиента, так и донора) в миофибробласты, которые являются основным источником соединительной ткани в печени. Следовательно, трансплантация генно-модифицированных ЗКП не несет риска развития фиброза печени
Таким образом, трансдукция клеточной культуры ЗКП крысы аденовирусным вектором не влияет на жизнеспособность клеток и не изменяет существенно их фенотип . Более того, генетически модифицированные ЗКП, трансдуцированные генами HGF, FGF-4 и RFP, при трансплантации животным-реципиентам контрольной группы и животным, перенесшим операцию ЧГ, сохраняют жизнеспособность, мигрируют в печень и встраиваются в её паренхиму Часть клеток приобретает фенотип гепатоцитов, другая, по-видимому, остается в виде резерва, сохраняя округлую форму или встраиваясь в синусоиды печени и приобретая морфологию ЗКП .
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 12-04-97088-р_поволжье_а «Изучение фундаментальных механизмов пластичности и направленной дифференцировки звёздчатых клеток печени для разработки клеточной биомедицинской технологии восстановления гепатоцитов».
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности.
13 . Gohda E ., Tsubouchi H ., Nakayama H . et al . Human hepatocyte growth factor in plasma from patients with fulminant hepatic failure . Exp . Cell Res . 1986; 166: 139-50 .
14 . Gohda E . , Tsubouchi H ., Nakayama H . et al . Purification and partial characterization of hepatocyte growth factor from plasma of a patient with fulminant hepatic failure . J . Clin . Invest . 1988; 81: 414-9
15 . C . Birchmeier C ., Gherardi E . Developmental roles of HGF/SF and its receptor, the c-Met tyrosine kinase . Trends Cell Biol . 1998; 8: 404-10 .
16 . Nakanuma Y . , Hoso M . , Sanzen T . et al . Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply . Microsc . Res . Tech . 1997; 38: 552-70 .
17 . Титова А .А ., Бурганова Г . Р ., Шарипова Э . И . и др . Звёздчатые клетки печени стимулируют регенерацию печени крыс после частичной гепатэктомии на фоне подавления пролиферации гепатоцитов . Гены и Клетки 2014; 9(3): 131-5 .
18 . Шафигуллина А . К ., Трондин А . А ., Бурганова Г . Р . и соавт . Сравнение различных методов выделения, мечения и трансплантации звёздчатых клеток печени крысы . Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2013; 8(3): 147-51.
19 . Черенкова Е . Е ., Шарипова Э . И ., Ризванов А .А ., Киясов А . П . Создание рекомбинантного аденовируса, одновременно кодирующего кодон-оптимизированные последовательности фактора роста гепатоцитов и фактора роста фибробластов . Материалы IV международной научно-практической конференции Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине 2014, 29 октября — 1 ноября; Казань, Россия .
20 . Theise N . D ., Nimmakayalu M ., Gardner R . et al . Liver from bone marrow in humans . Hepatology 2000; 32(1): 11-6 .
21. Шафигуллина А . К ., Гумерова А .А ., Трондин А .А . и соавт. Трансплантированные звёздчатые клетки печени участвуют в регенерации органа после частичной гепатэктомии без риска развития фиброза печени Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2012; 7(3): 169-72 .
Поступила: 09.11.2015
