CC BY
56
й01: 10.24411/0235-2451-2019-10915
УДК 663.885
Влияние толщины защитного слоя микрокапсулированного фермента на его активность и стабильность
И. Н. ТРЕТЬЯКОВА1, С. Л. ТИХОНОВ1, Н. В. ТИХОНОВА1, Л. С. КУДРЯШОВ2
1Уральский государственный экономический университет, ул. 8 марта, 62, Екатеринбург, 620144, Российская Федерация Федеральный научный центр пищевых систем им. В. М. Горбатова, ул. Талалихина, 26, Москва, 109316, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью оценки эффективности микрокапсулированния фермента пепсина в псевдожи-женном слое для последующего использования при производстве цельнокусковых мясных (ветчинных) продуктов. В качестве материала для исследований был взят животный фермент пепсин. Для защитного покрытия применяли 10 %-ный водный раствор мальтодекстрина. Предварительно изучали влияние на активность пепсина толщины слоя мальтодекстрина и продолжительности ферментации. Для этого брали микрокапсулированный фермент с толщиной защитного слоя 3, 6, 9 мкм и 0,15 %-ный раствор чистого пепсина. В качестве субстрата использовали казеин, денатурированный в растворе трихлоруксусной кислоты. Ферментативную активность определяли по количеству тирозина, образующегося в результате гидролиза казеина, на спрек-трофотометре при длине волны 280 нм. Для оценки эффективности микрокапсулированния пепсина была выработана ветчина, которую шприцевали рассолом, содержащим вместе с посолочными ингредиентами 0,15 % микрокапсулированного фермента. Влияние длительности хранения (при 0...+2 оС) на протеолитическую активность микрокапсулированного и некапсулированного (чистого) пепсина определяли путем измерения величины напряжения среза ветчины. При обработке фермента раствором мальтодекстрина образуются микрокапсулы овальной и округлой формы. Согласно результатам сканирующей электронной микроскопии покрытие защитным слоем неравномерно и составляет при микрокапсулировании в течение 3...10 мин. от 4 до 8 мкм. Через 2 мин. обработки на грануле пепсина образуется более 25 % толщины защитного слоя от его среднего значения в конце процесса, после 6 мин. - 70 %. Активность микрокапсулированного пепсина на всем протяжении эксперимента (40 мин. ) была выше, чем у чистого фермента, на 12.33 %. Наибольшая активность фермента в ветчине, которая сохранялась до 9 мес., отмечена при толщине защитного покрытия 9 мкм.
Ключевые слова: микрокапсулирование, мальтодексрин, фермент, пепсин, ветчина.
Сведения об авторах: И. Н. Третьякова, аспирант; С. Л. Тихонов, доктор технических наук, профессор (е-таИ: иьюпоу75@ bk.ru); Н. В. Тихонова, доктор технических наук, доцент; Л. С. Кудряшов, доктор технических наук, профессор. Для цитирования: Влияние толщины защитного слоя микрокапсулированного фермента на его активность и стабильность / И. Н. Третьякова, С. Л. Тихонов, Н. В. Тихонова и др. // Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 9. С. 70-73. DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10915.
ПЕРЕРАБОТКА
The Effect of the Thickness of the Protective Layer of a Microencapsulated Enzyme on its Activity and Stability
I. N. Tret'yakova1, S. L. Tikhonov1, N. V. Tikhonova1, L. S. Kudryashov2
Ural State Economic University, ul. 8 Marta, 62, Ekaterinburg, 620144, Russian Federation
2V. M. Gorbatov Federal Science Center of Food Systems, ul. Talalikhina, 26, Moskva, 109316, Russian Federation
Abstract. The studies were performed to evaluate the effectiveness of microencapsulation of pepsin in the semifluidized bed for its subsequent use in the production of whole-piece meat (ham) products. The animal pepsin was taken as a material for the research. A 10% aqueous maltodextrin solution was used for the protective coating. We also conducted foresight studies on the effect of malto-dextrin layer thickness and fermentation duration on the pepsin activity. For this, a microencapsulated enzyme with a protective layer thickness of 3 um, 6 um, 9 um and a 0.15% solution of pure pepsin were used. Casein denatured in a trichloroacetic acid solution was used as a substrate. Enzymatic activity was determined by the amount of tyrosine formed as a result of casein hydrolysis on a spectrophotometer at a wavelength of 280 nm. To evaluate the effectiveness of pepsin microencapsulation, the produced ham was extruded with brine containing 0.15% of microencapsulated enzyme and salting ingredients. The effect of the storage time (at the temperature from 0 C to +2 C) on the proteolytic activity of microencapsulated and non-encapsulated (pure) pepsin was determined by measuring the value of the shear stress of the ham. Processing of the enzyme with a solution of maltodextrin led to the formation of oval and rounded microcapsules. According to the results of scanning electron microscopy, the coating with the protective layer was uneven and during microencapsulation for 3-10 min made up from 4 um to 8 um. After 2 minutes of processing, on the pepsin granule more than 25% of the protective layer thickness of its average value at the end of the process formed; after 6 minutes 70% of the thickness formed. The activity of microencapsulated pepsin throughout the experiment (40 min) was higher than that of a pure enzyme by 12-33%. The highest enzyme activity in ham lasted up to 9 months. It was registered at a protective coating thickness of 9 um. Keywords: microencapsulation; maltodexrin; enzyme; pepsin; ham.
Author Details: I. N. Tret'yakova, post graduate student; S. L. Tikhonov, D. Sc. (Tech.), prof. (e-mail: [email protected]); N. V. Tikhonova, D. Sc. (Tech.), assoc. prof.; L. S. Kudryashov, D. Sc. (Tech.), prof.
For citation: Tret'yakova I. N., Tikhonov S. L., Tikhonova N. V., Kudryashov L. S. The Effect of the Thickness of the Protective Layer of a Microencapsulated Enzyme on its Activity and Stability. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2019. Vol. 33. No 9. Pp. 70-73 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10915.
Йля сохранения активности биологически активных веществ (антиоксиданты ликопин и каротин, витамины, стеролы, пробиотики, льные ароматизаторы и красители), введенных в рецептуру пищевых продуктов, нередко используют такие способы микрокапсулирования, как комплексная коацервация, ионотропное (внешнее или внутреннее) гелеобразование, молекулярное включение, экструзия, сублимационная сушка, рас-
пылительная тепловая сушка, распылительное охлаждение (мелкодисперсное распыление раствора, содержащего защитный компонент) и др. [1, 2]. Один из наиболее доступных способов микрокапсулирования - распылительная сушка, при которой вещество предварительно растворяют в подходящем растворителе и гомогенизируют, затем подают такую смесь в распылительную сушилку и распыляют с помощью форсунок, при этом вода испаряется, а высушен— Достижения науки и техники АПК. 2019. Т 33. № 8
ные микрокапсулы опускаются на дно резервуара. Метод распылительной сушки представляет собой один из старейших и наиболее широко используемых для инкапсуляции в пищевой промышленности. Вначале этот процесс применяли при производстве ароматизаторов, чтобы защитить их от деградации (окисления), а также сухих твердых суспензий. Сегодня его применяют к биоактивным молекулам и пробиотикам. Преимущество распылительной сушки заключается в том, что ее можно применять в промышленных масштабах для инкапсуляции различных биокомпонентов, при этом микрокапсулы легко диспергируются в воде. При микрокапсулировании пищевых ингредиентов таким методом необходимо контролировать способ распыления, температуру и продолжительность сушки. При распылительной сушке происходит потеря значительного количества вещества в результате прилипания капсул к сушильной камере и уменьшение активности биологически активных веществ из-за высокой температуры сушки. [3]. Следует отметить, что при использовании обсуждаемого метода важно правильно подобрать защитное вещество (камедь, мальтодекстрины, целлюлоза, желатин, липиды и белки) [4].
Еще один из часто используемых методов микро-капсулирования лабильных пищевых веществ - сублимационная сушка или лиофилизация. Ее применяют для сохранения активности термолабильных биологически активных веществ в водных растворах [5]. Однако затраты на сублимационную сушку значительно выше, чем на распылительную [6].
Микрокапсулирование путем коацервации представляет собой фазовое отделение одного или нескольких гидроколлоидов от исходного раствора под действием изменения рН или температуры, добавление нерастворителя или электролитного соединения и последующее осаждение образованной коацерватной фазы вокруг активного ингредиента, суспендированного или эмульгированного в тех же реакционных средах. Выделяют три основных этапа коацервации:
в растворе присутствуют три несмешивающиеся фазы (основной материал (активный ингредиент), материал покрытия и растворитель);
адсорбция коацервата вокруг материала сердцевины и жидкого покрытия поглощает материал сердцевины путем смешивания фазы покрытия с фазой растворителя;
защитное покрытие затвердевает или застывает термически или путем десольватации [8].
Эмульгирование (экструзия) - наиболее простой метод, применяемый для создания микросфер, загруженных пищевыми ингредиентами. Принцип его заключается во внешнем гелеобразовании гидроколлоидов с использованием различных агентов (раствор хлорида кальция для альгината, хлорид калия для каррагинана и триполифосфат для хитозана, трансглутаминаза для казеината). Суспензия биоактивного соединения и гидроколлоидного раствора экструдируется через иглу для получения капель, которые собираются в ванне, где происходит ионо-тропное или термическое гелеобразование. Методом экструзии получают сферические полимерные шарики диаметром от 2 до 3 мм.
Экструзионные технологии представляют собой адекватный метод инкапсуляции живых клеток, поскольку они не содержат вредных растворителей и
могут быть выполнены как в аэробных, так и в анаэробных условиях [1].
Эмульгирование и внутреннее ионное гелеобразование используют для инкапсуляции пищевых компонентов в микросферы размером менее 100 мкм. Принцип этого метода основан на эмульгировании водной суспензии гидроколлоида (альгината), карбоната кальция и пробиотических клеток в минеральное или растительное масло в присутствии липофильного поверхностно-активного вещества (Span 80). Для достижения внутреннего гелеобра-зования в образовавшуюся эмульсию добавляют уксусную кислоту (100 мкл/100 мл, разведенную в небольшом количестве масла). Эмульсия вода-в-масле разрушается раствором CaCl2 (0,05 М) и пробиотические альгинатные шарики остаются внутри водной фазы. Затем их отделяют от масла и промывают [1].
Один из перспективных методов инкапсуляции - покрытие биологически активного вещества псевдоожиженным слоем. Сегодня его используют в фармацевтической промышленности для увеличения сохраняемости препаратов в агрессивных средах и обеспечения направленного фармакологического действия в органах человека. Твердые частицы, подлежащие инкапсуляции, суспендируют в струе воздуха и затем покрывают распылением жидкого материала - покрытия. После этого капсулы перемещают в область, где их оболочки затвердевают при охлаждении или испарении растворителя. Суспен-дирование, распыление и охлаждение повторяют до тех пор, пока стенки капсул не достигнут желаемой толщины. Этот процесс известен как процесс Wurster, когда форсунка находится в нижней части псевдоо-жиженного слоя частиц. На наш взгляд, такой метод микрокапсулирования может быть перспективен в пищевой промышленности, в частности, для капсули-рования пепсина и его использования в производстве цельнокусковых мясных продуктов.
На основании изложенного цель наших исследований - оценка эффективности микрокапсулиро-ванния фермента пепсина в псевдоожиженном слое для последующего использования при производстве цельнокусковых мясных (ветчинных) продуктов.
Условия, материалы и методы. В качестве материала для исследований был взят животный фермент пепсин. Для защитного покрытия применяли 10 %-ный водный раствор мальтодекстрина.
Для микрокапсулирования фермента использовали устройство (аппарат), состоящее из стеклянного резервуара конической формы, к которому подведен патрубок для подачи частиц фермента потоком воздуха с помощью сопла. На входе патрубка в резервуар установлены мембраны, позволяющие регулировать размер подаваемых частиц от 5 мкм до 0,5 мм. Для ввода в аппарат капель мальтодекстрина использовали струйное диспергирующее устройство. Подачу фермента и защитного покрытия из специальных изолированных один от другого резервуаров осуществляли компрессором.
Устройство работает следующим образом. К патрубку герметично подсоединяют резервуар с ферментом, затем подают воздух от компрессора, который, проходя через сменные сопла различных диаметров захватывает частицы из резервуара. Далее они в турбулентном потоке подсушиваются и поступают в аппарат в виде фонтанирующих пото-
Рис. 1. Зависимость толщины поверхностного слоя мальтодекстрина от продолжительности его нанесения на частицы пепсина.
ков. Правильный подбор скоростей этих потоков (в зависимости от свойств частиц фермента) обеспечивает установка сменных мембран с необходимыми диаметрами отверстий. После предварительной под-
Рис. 2. Активность некапсулированного и микрокапсулированного пепсина при разной продолжительности ферментации (10...40 мин.) от первоначального значения (100 %), %: = - чистый фермент; - микрокапсулированный фермент с толщиной защитного слоя 3 мкм; ^^ - микрокапсулированный фермент с толщиной защитного слоя 6 мкм; = -микрокапсулированный фермент с толщиной защитного слоя 9 мкм.
сушки частиц в патрубке и фонтанирующих потоках аппарата (удаляется влага с частиц и устраняется их слипание) в диспергатор подают воздух с раствором мальтодекстрина. Диспергатор также снабжен сменными соплами различных диаметров. Выбор одного из них обеспечивает диспергирование капель необходимого диапазона размеров, которые в виде тумана подают в фонтанирующие потоки фермента. При этом размер капель мальтодекстрина должен быть больше размера твердых частиц фермента в фонтанирующих потоках аппарата. Процесс покрытия фермента каплями интенсивен и скоротечен. Кроме того, он сопровождается началом сушки прилипших капель под влиянием фонтанирующих потоков, омывающих частицы со всех сторон. Для исследования эффективности микрокапсулированного фермента использовали пепсин с толщиной защитного слоя 3, 6 и 9 мкм, так как покрытие фермента мальтодек-стрином неравномерно и полная микрокапсуляция отмечается при толщине защитного слоя не менее 3 мкм.
Микроструктуру каспсулированного фермента определяли с помощью электронного микроскопа JeolJSM 6490LV в лаборатории УрФУ им. Первого Президента РФ Б. Н. Ельцина. Для эксперимента образцы капсул фермента срезали и шлифовали, а затем исследовали на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 0,2...30 кВ (20 кВ), источником электронов служил катод (LaB6); детекторами топографический контраст, композиционный (химический) контраст. В качестве приставки использовали приставку для микрорентгеноспектрального энергодисперсионного анализаIncaDryCoolи приставку для микрорентгеноспектрального волнового анализа IncaWave. Микроструктуру капсул ферментов определяли с использованием программного обеспечения IncaFeature.
Для исследования влияния толщины слоя мальтодекстрина и продолжительности ферментации (от 10 до 40 мин.) на активность пепсина брали микрокапсулированный пепсин с защитным слоем 3, 6, 9 мкм и 0,15 %-ный раствор чистого фермента. В качестве субстрата использовали казеин, денатурированный в растворе трихлоруксусной кислоты. Ферментативную активность определяли по количеству образующегося тирозина в результате гидролиза казеина на спректрофотометре при длине волны 280 нм и
выражали ее в микромолях тирозина на 1 г субстрата за 1 мин. Исследования проводили в универсальном буферном растворе при рН от 2,5 ед.
Для эксперимента по оценке эффективности микрокапсулирования пепсина была выработана ветчина (из заднего окорока свинины), которую шприцевали рассолом, содержащим вместе с посолочными ингредиентами 0,15 % микрокапсу-лированного фермента. Влияние длительности хранения при 0...+2 оС на протеолитическую активность микрокапсулированного и некапсулированного (чистого) пепсина определяли путем измерения величины напряжения среза ветчины.
Результаты и обсуждение. Толщина защитного слоя из мальтодекстрина зависела от продолжительности его обработки (рис. 1). Результаты сканирующей электронной микроскопии показали, что микрокапсулы имеют овальную и округлую форму. При этом покрытие частиц фермента защитным слоем неравномерно и составляет при микрокап-сулировании в течение 3.10 мин. от 4 до 8 мкм. Следовательно, его толщину можно регулировать продолжительностью нанесения.
Через 2 мин. обработки раствором мальтодек-стрина на грануле пепсина образуется более 25 % толщины защитного слоя от его среднего значения в конце процесса обработки, а после 6 мин. - 70 %. При этом расчетная скорость воздушного потока с раствором мальтодекстрина в узком сечении конуса рабочей камеры была равна критической скорости витания крупных частиц пепсина и составляла 0,17 м/с.
о
о 9
s 9
«" 8
Ее 7 о
то 6
& 5
5 3 5 2
И1
о 0
ч
о
8
6,4
125 120 115 110 105 100
Напряжение среза, кПа
95
90
Рис. 3. Влияние некапсулированного и микрокапсулированного пепсина на структурно-механические свойства ветчины в зависимости от срока хранения: == - чистый фермент; — - микрокапсулированный фермент с толщиной защитного слоя 3 мкм; - микро-капсулированный фермент с толщиной защитного слоя 6 мкм; = - микрокапсулированный фермент с толщиной защитного слоя 9 мкм.
Активность микрокапсулированного фермента на всем протяжении эксперимента (40 мин.) была выше, чем у пепсина в чистом виде, что связано со способностью мелкодисперсного раствора маль-тодекстрина защищать активный центр фермента от ингибирующих его активность факторов, на 12...33 %. Наибольшей она была при толщине защитного покрытия 9 мкм и составляла при ферментации 10 мин. - 92 %, 20 мин. - 88 %, 30 мин. - 80 % и 40 мин. - 76 %. При толщине покрытия 3 мкм величина этого показателя находилась на уровне 85, 81, 74 и 58 % соответственно.
Как видно из результатов эксперимента с ветчиной (рис. 3) иммобилизованный пепсин проявлял более высокую протеолитическую активность, по сравнению с ферментом в чистом виде. Напряжение среза ветчины, обработанной микрокапсулирован-ным ферментом, при продолжительности хранения 8 мес. и толщине защитного слоя 6 и 9 мкм составило 90 кПа, тогда как при обработке продукта ферментом с толщиной защитного слоя мальтодекстрина 3
мкм и некапсулированным аналогичную величину этого показателя отмечали только при хранении в течение 6 и 4 мес., соответственно. Следует отметить, что с увеличением продолжительности хранения как некапсулиро-ванного, так и капсулиро-ванного пепсина его про-теолитическое действие постепенно снижалось, о чем свидетельствует уменьшение напряжения среза ветчины.
Выводы. На основании результатов исследований установлено, что толщина защитного слоя при обработке фермента в устройстве в течение 3.10 мин. может варьировать от 4 до 8 мкм. При этом ее можно регулировать продолжительностью микрокапсилирования. По мере увеличения размеров защитного слоя мальтодекстрина возрастает хранимоспособность и активность фермента. Так, активность микрокапсулированного пепсина при продолжительности ферментации 40 мин. и толщине защитного слоя 9 мм составила 76 % от исходного уровня, 6 мм - 71 %, 3 мм - 58 %, а у чистого некапсулированного - 43 % от исходного значения. Наибольшая активность фермента в ветчине, которая сохранялась до 9 мес., отмечена при толщине защитного покрытия 9 мкм. Учитывая результаты проведенных исследований, можно рекомендовать микрокапсулирование протеолитического фермента пепсина с использованием мальтодекстрина, что позволит расширить возможности применения иммобилизованных ферментов при производстве мясных продуктов.
Литература.
1. Alexe P. Dima C. Microencapsulation in Food Products //AgroLife Scientific Journal. 2014. Vol. 3, No. 1. Pp. 9-14.
2. Encapsulation in the food industry: a review/ B. Gibbs, S. Kermasha, I. Alli, etc. // International Journal of Food Sciences and Nutrition. 1999. Vol. 50. No. 3. Pp. 213-224.
3. Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications / J. Burgain, C. Gaiani, M. Linder, etc. // Journal of Food Engineering. Vol. 104. No. 4. Pp. 467-483.
4. Vegetable proteins in microencapsulation: A review of recent interventions and their effectiveness/A. Nesterenko, I. Alric, F. Silvestre, etc. // Industrial Crops and Products. 2013. No. 42. Pp. 469-479.
5. Desai K., Park H. Recent developments in microencapsulation of food ingredients // Drying Techology. 2005. Vol. 7. No. 23. Pp. 1361-1394.
6. Applications of spray-drying in microencapsulation of food ingredients: a review/A. Gharsallaoui, G. Roudant, O. Chambin, etc. // Food Research International. 2007. Vol. 40. No. 9. Pp. 1107-1121.
7. Jacquot M., Pernetti M. Pernetti Spray coating and drying processes. In Cell Immobilization Biotechnology. Netherlands: Kluwer Academic Publisher, 2003. Pp. 343-356.
8. Gouin S . Microencapsulation: industrial appraisal of existing technologies and trends // Trends of Food Science and Technology. 2004. No. 15 (7-8). Pp. 330-347.
References
1. Alexe P, Dima C. Microencapsulation in food products. AgroLife Scientific Journal. 2014;3(1):9-14.
2. Gibbs B, Kermasha S, Alli I, et al. Encapsulation in the food industry: a review. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 1999;50(3):213-24.
3. Burgain J, Gaiani C, Linder M, et al. Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications. Journal of Food Engineering. 2011:104(4):467-83.
4. Nesterenko A, Alric I, Silvestre F, et al. Vegetable proteins in microencapsulation: A review of recent interventions and their effectiveness. Industrial Crops and Products. 2013;42:469-79.
5. Desai K, Park H. Recent developments in microencapsulation of food ingredients. Drying Techology. 2005;7(23):1361-
94.
6. Gharsallaoui A, Roudant G, Chambin O, et al. Applications of spray-drying in microencapsulation of food ingredients: a review. Food Research International. 2007;40(9):1107-21.
7. Jacquot M, Pernetti M. Pernetti spray coating and drying processes. In: Cell immobilization biotechnology. Netherlands: Kluwer Academic Publisher; 2003. p. 343-56.
8. Gouin S. Microencapsulation: industrial appraisal of existing technologies and trends. Trends of Food Science and Technology. 2004;15(7-8):330-47.
4
