CC BY
66
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК 612.398.192+612.173.3+612.398.12
К. Н. Коротаева, А. Д. Ноздрачёв, В. А. Вязников, В. И. Циркин
ВЛИЯНИЕ ТИРОЗИНА, ГИСТИДИНА, ТРИПТОФАНА,
МИЛДРОНАТА И СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА АМПЛИТУДУ ВЫЗВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ КАРДИОМИОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ИНОТРОПНЫЙ ЭФФЕКТ АДРЕНАЛИНА
Введение
Ранее было показано, что различные разведения сыворотки крови человека способны повышать эффективность активации бета-адренорецепторов (АР) гладких мышц матки крысы [1], трахеи коровы [2], коронарной артерии свиньи [3], миокарда лягушки [4, 5] и крысы [4], т. е. проявлять бета-адреносенсибилизирующую активность. В опытах с изолированным миокардом лягушки было показано [4], что 50- и 10-кратные разведения сыворотки крови человека снижают положительный инотропный эффект адреналина, а 500-кратные разведения — увеличивают его. Аналогично, в опытах с миокардом крысы было установлено [4], что 10-кратное разведение сыворотки крови снижает положительный инотропный эффект адреналина, а 500-кратное увеличивает его. В этих опытах было также установлено, что 1000- и 500-кратные разведения сыворотки крови восстанавливают бета-адренореактивность миокарда, сниженную лизофосфатидилхолином (ЛФХ). Все эти данные подтверждают наличие в крови эндогенного сенсибилизатора бета-адре-норецепторов (ЭСБАР) и эндогенного блокатора бета-адренорецепторов (ЭББАР). Вопрос о том, могут ли эти факторы изменять эффективность активации бета-АР миокарда человека — до настоящего времени не исследовался. До настоящего времени не удалось выделить в чистом виде ЭСБАР и ЭББАР, хотя показано, что для ЭСБАР молекулярная масса не превышает 1000 Д [6]. В литературе отмечено, что активность, подобную ЭСБАР, проявляют естественные компоненты сыворотки крови — Ь-гистидин, Ь-триптофан и Ь-тирозин [4, 7, 8] и ряд лекарственных препаратов, в том числе милдронат [4, 9] и пре-дуктал, или триметазидин [6, 10]. Так, было показано, что гистидин на полосках миокарда сердца лягушки достоверно повышает способность адреналина оказывать положительный инотропный эффект [11]. В опытах с изолированным сердцем лягушки триптофан, гистидин и предуктал повышали положительный инотропный эффект адреналина, а тирозин и милдронат снижали его [4]. Хотя в опытах с интактным изолированным миокардом правого желудочка крысы триптофан, гистидин, тирозин и милдронат не влияли на проявление положительного инотропного эффекта адреналина, но восста-
© К. Н. Коротаева, А. Д. Ноздрачёв, В. А. Вязников, В. И. Циркин, 2011
навливали его в том случае, если он был снижен под влиянием лизофосфатидилхолина [4]. Вопрос о влиянии аналогов ЭСБАР на эффективность активации бета-АР миокарда человека не изучался. Учитывая теоретический и клинический интерес к вопросу о влиянии эндогенных и экзогенных модуляторов на эффективность активации бета-АР кар-диомиоцитов человека, в работе была поставлена цель — исследовать влияние тирозина, гистидина, триптофана, милдроната и сыворотки крови на сократимость и бета-адрено-реактивность изолированного миокарда человека.
Методика исследования
Всего было исследовано 54 полоски миокарда правого ушка сердца 54 пациентов кардиохирургического отделения Кировской областной клинической больницы. Их возраст варьировал от 13 до 71 года и в среднем составил 55 ± 1 лет. Биоптаты ушка иссекались при постановке венозной канюли во время подключения аппарата искусственного кровообращения при аортокоронарном шунтировании [12]. Шунтирование проводилось у 46 пациентов с ишемической болезнью сердца (стенокардия II и III функционального класса по классификации NYHA) или при протезировании клапанов сердца (8 пациентов с пороками сердца различной этиологии). О состоянии сократительной функции сердца у пациентов до операции судили на основании данных ультразвуковой диагностики, в том числе по величине фракции выброса левого желудочка по Тейхольцу [13].
Исследования сократительной активности полосок миокарда человека начинали через 30-40 мин после забора материала. Регистрацию вызванных сокращений миокарда проводили по методике В. И. Циркина [14] и Ю. А. Пенкиной [4] при 37оС. Для этого в рабочую камеру «Миоцитографа» (производство фирмы «Норис», Россия), объемом 1 мл, помещали полоску миокарда длиной 5-8 мм, шириной 3-4 мм (сырая масса их составила 44 ± 10 мг). Ее соединяли с изометрическим датчиком силы (Honeywell, USA), сигнал с которого подавался на компьютер через аналого-цифровой преобразователь ЛА-70. Полоску растягивали микроманипулятором до длины, при которой сила сокращений была максимальной, и непрерывно перфузировали со скоростью 2,0 мл/мин оксигенированным раствором Кребса с помощью шприцевого дозатора. Сокращения полоски на протяжении всех этапов эксперимента вызывали непрерывной стимуляцией от электростимулятора ИСЭ-01 с частотой 1 Гц при длительности импульсов 5 мс и амплитуде 25-30 В через стальные электроды, погруженные в рабочую камеру. Амплитуду (силу) сокращений выражали в миллиньютонах, а также в процентах к амплитуде сокращений, наблюдаемых до воздействия веществ (т. е. к фоновому уровню) или при первом тестировании полоски адреналином.
Было проведено пять серий опытов. В них изучали влияние на амплитуду сокращений и положительный инотропный эффект адреналина (5,5 • 10-8М) одной из трех аминокислот (тирозина, гистидина, триптофана), милдроната и 6 разведений сыворотки крови (1:10, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:10000) небеременных женщин. Все опыты проводили по схеме: раствор Кребса (РК) -> адреналин 5 • 10-8М (Ад8) -> РК -> исследуемый фактор (вещество или разведение сыворотки) -> исследуемый фактор + Ад8 -> РК -> Ад8 -> РК.
Кровь получали от 58 доноров крови — женщин репродуктивного возраста (30 ± 1 лет). Забор крови (в объеме 7-8 мл) из локтевой вены осуществлялся на станции переливания крови в 8-9 ч утра. Сыворотку получали путем 15-минутного центрифугирования (при 1000 об/мин) полностью свернувшейся крови. Перед опытом ее разводили
раствором Кребса в 10 000, 1000, 500, 100, 50 и 10 раз. Аминокислоты, милдронат и адреналин также разводили раствором Кребса. Он содержал (мМ) — №С1-136; КС1 — 4,7; СаС12 — 2,52; MgCl2 — 1,2; КН2Р04 — 0,6; №НС03 — 4,7; С6Н1206 — 11 (pH 7,4). В работе использовали адреналина гидрохлорид (Московский эндокринный завод), гистидин (SIGMA-ALDRICH, Япония), тирозин, триптофан (ACROS ORGANICS, Бельгия) и милдронат ^п^ех, Латвия).
Результаты исследования подвергнуты статистической обработке (в тексте они даются в виде М ± т). Различия оценивали по критерию Уилкоксона и считали их достоверными при р < 0,05 [15], что в тексте и на рисунках отмечено знаком #.
Результаты исследования
Сила вызванных сокращений миокарда. Установлено, что во всех пяти сериях полоски миокарда отвечали на каждый электростимул сокращением (рис. 1). Амплитуда (или сила, А) сокращений при перфузии полосок оксигенированным раствором Кребса была относительно постоянной для каждого опыта, но в среднем варьировала от
РК Ад 8 РК Гис 5 Гис 5 + Ад 8 РК
_______________I_________________________I_________________________I_________________________I_________________________I________________________
РК Ад 8 РК Трф 4 Трф 4 + Ад 8 РК
РК Ад 8 РК Сыв 1:500 Сыв500 + Ад8 РК
Рис. 1. Механограмма изолированного миокарда человека, демонстрирующая повышение амплитуды вызванных сокращений под влиянием тирозина (5,5 • 10-5 М, тир 5; панель а), гистидина (6,5 • 10-5 М; гис 5, панель б) и триптофана (4,9 • 10-4 М, трф 4, панель в)
Показано наличие в сыворотке крови разведения 1:500 (сыв 1:500; панель г) сенсибилизатора бета-адренорецепторов. Горизонтальные линии под механограммой отражают момент воздействия раствора Кребса (РК), адреналина (5,5 • 10-8 М; Ад8) и соответствующей аминокислоты. Калибровка — 1,5 мН,
1 мин.
1,04 ± 0,09 мН до 2,40 ± 0,32 мН. Она коррелировала с величиной фракции выброса левого желудочка (мл), рассчитанной по Тейхольцу ФВЛЖТ, — коэффициент корреляции составил 0,37, р = 0,0048, а уравнение линейной регрессии имело вид А = 0,06ФВЛЖТ — 1,75, это означает, что амплитуда (сила) сокращений кардиомиоцитов биоптата тем ниже, чем
ниже систолический объем крови. Косвенно это свидетельствует о том, что изолированный миокард ушка правого предсердия отражает сократимость миокарда левого желудочка в условиях организма.
Ответ полосок миокарда на адреналин. В опытах с тирозином (серия 1) исходно, т. е. при 1-м тестировании, адреналин в относительно невысокой концентрации (5,5 • 10-8 М) достоверно повышал амплитуду вызванных сокращений миокарда (рис. 1, а). Так, в опытах с тирозином в концентрации 5,5 • 10-4 М он повышал ее с 1,63 ± 0,15 мН до 2,13 ± 0,17 мН, т. е. до 137,6 ± 15% от фона (рис. 2). Такой же положительный инотропный эффект адреналин при 1-м тестировании оказывал и в опытах с гистидином (серия 2, рис. 1, б). Так, в опытах с гистидином в концентрации 6,5 • 10-4 М адреналин повышал амплитуду сокращений с 1,42 ± 0,15 мН до 1,65 ± 0,16 мН, т. е. до 122,1 ± 13% от фона (см. рис. 2). Однако в опытах с триптофаном (серия 3, рис. 1, в; см. рис. 2) рост амплитуды сокращений при 1-м тестировании адреналина (до 112,3 ± 7,4% — 113,7 ± 7,2%) носил недостоверный характер. При исследовании шести разведений сыворотки крови человека
Рис. 2. Амплитуда вызванных сокращений миокарда человека в опытах с тирозином 5,5 • 10-5 М (тир 5) и 5,5 • 10-4 М (тир 4), гистидином
6.5 • 10-5 М (гис 5) и 6,5 • 10-4 М (гис 4), триптофаном 4,9 • 10-5 М (трф 5) и
4,9 • 10-4 М (трф 4), сывороткой разведения 1:10 (сыв 10):
1 — на фоне раствора Кребса (принято за 100%); 2 — на фоне адреналина
5.5 • 10-8 М; 3 — на фоне тестируемого вещества, указанного над столбцами;
* — отличие от исходной амплитуды сокращений достоверно по критерию
Уилкоксона (р < 0,05).
(серия 5) адреналин проявлял достоверно положительный инотропный эффект лишь в опытах с 50-кратным разведением (амплитуда сокращений возрастала с 1,14 ± 0,10 мН до 1,32 ± 0,10 мН, т. е. до 116,1 ± 7,5% от фона). Все это косвенно говорит о том, что бета-адренореактивность кардиомиоцитов зависит, вероятно, от состояния пациента, в том числе от степени сердечной недостаточности. Однако анализ этого явления не позволил нам (вероятно, вследствие малочисленности наблюдений) выявить достоверную разницу по величине ФВЛЖТ между пациентами, биоптаты которых имели разную бета-адре-нореактивность. Так, в серии 1 (опыты с тирозином) и в серии 2 (опыты с гистидином), в которых бета-адренореактивность была относительно высокой, ФВЛЖТ составила соответственно 61,3 ± 1,4 и 59,7 ± 3,3 мл, а в серии 3 (опыты с триптофаном) и в серии 5
(опыты с сывороткой крови), в которых адренореактивность была более низкой, ФВЛЖТ составила соответственно 56,8 ± 3,6 и 58,4 ± 5,5 мл; при этом различия с сериями 1 и 2 носили недостоверный характер (р > 0,1).
В опытах с милдронатом (серия 4) мы оценивали эффект адреналина в более высокой концентрации (5,5 • 10-6 М). В этом случае адреналин вызывал более выраженный рост амплитуды вызванных сокращений (с 1,08 ± 0,1 мН до 2,21 ± 0,3 мН, т. е. до 211,8 ± 34,7% . от фонового уровня), чем в сериях, в которых он применялся в более низкой концентрации, т. е. 5,5 • 10-8 М.
В целом все эти данные позволяют сделать заключение, что миокард пациентов с сердечной недостаточностью отвечает на воздействие адреналина повышением силы сокращений, степень которого зависит от концентрации адреналина в среде.
Влияние тирозина, гистидина, триптофана, милдроната и сыворотки крови на сократимость миокарда сердца человека. При проведении первых трех серий установлено (см. рис. 2), что тирозин (5,5 • 10-5 и 5,5 • 10-4 М), гистидин (6,5 • 10-5 М) и триптофан (4,9 • 10-4 М) достоверно проявляют положительный инотропный эффект. Этот эффект сравним с инотропным эффектом адреналина при его использовании в концентрации 5,5 • 10-8 М. Так, тирозин в концентрации 5,5 • 10-5 М достоверно повышал амплитуду вызванных сокращений до 148,4 ± 13,8% от фонового уровня (адреналин — до 147,9 ± 13,8%), а в концентрации 5,5 • 10-4 М — до 150,9 ± 12,6% (адреналин в этих опытах повышал амплитуду сокращений до 137,6 ± 15,0%). Гистидин в концентрации 6,5 • 10-5 М повышал амплитуду сокращений до 133,1 ± 14,3% (адреналин — до
118,2 ± 6,6% ); повышение амплитуды сокращений под влиянием гистидина в концентрации 6,5 • 10-4 М (до 119,0 ± 11,0%) носило недостоверный характер (адреналин в этих опытах повышал ее до 122,0 ± 13,0% ). Триптофан в концентрации 4,9 • 10-4 М повышал амплитуду сокращений до 116,8 ± 6,9% (адреналин — до 112,3 ± 7,4%); повышение амплитуды сокращений под влиянием триптофана в концентрации 4,9 • 10-5 М (до 115,8 ± 8,5%) носило недостоверный характер (адреналин в этих опытах повышал ее до 113,7 ± 7,2%). Милдронат, как показано в серии 4, не изменял амплитуду сокращений, а сыворотка крови (серия 5) повышала ее (до 133,0 ± 12,4% ), но лишь в разведениях 1:10 (в этих опытах адреналин при 1-м тестировании повышал ее до 105,5 ± 3,8% от фона). В дополнительных экспериментах нами было исследовано пятикратное разведение сыворотки и показано, что оно повышает силу сокращений до 143,3 ± 8,9% (адреналин в высокой концентрации, равной 5,5 • 10-6 М, в этих опытах повышал силу сокращений до 229,6 ± 43,8% от фона).
Таким образом, тирозин, гистидин и триптофан, а также небольшие разведения (1:10 и 1:5) сыворотки крови небеременных женщин оказывают положительное ино-тропное влияние на изолированный миокард пациентов с сердечной недостаточностью. Милдронат в используемой концентрации подобного влияния не проявляет.
Влияние тирозина, гистидина, триптофана и сыворотки крови небеременных женщин на бета-адренореактивность миокарда человека. В сериях 1-3 не удалось выявить способность аминокислот повышать положительный инотропный эффект адреналина. Более того, показано, что тирозин (5,5 • 10-5 и 5,5 • 10-4 М) и триптофан (4,9 • 10-4 М) могут даже снижать этот эффект (рис. 3). Так, в опытах с триптофаном в концентрации 4,9 • 10-4 М адреналин при 1-м тестировании повышал амплитуду вызванных сокращений до 2,6 ± 0,3 мН, или до 112,3 ± 7,4% от фона, при 2-м тестировании, т. е. совместно с триптофаном — до 2,09 ± 0,2 мН, или до 92,2 ± 4,2% от фона, или до 83,4 ± 7,7% от
амплитуды сокращений, наблюдаемой при 1-м тестировании. Эти данные указывают на то, что различия между 1-м и 2-м тестированием адреналина носят недостоверный характер (р < 0,1).
сыв 100
1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1234
Рис. 3. Амплитуда вызванных сокращений миокарда человека (в мН) при трех тестированиях адреналином в концентрации 5,5 • 10-8 М (или 5,5 • 10-6 М в опытах с милдронатом) — до (2), на фоне (3) и после удаления (4) аминокислоты в концентрациях 10-5 М (тир 5, гис 5, трип 5) и 10-4 М (тир 4, гис 4, трип 4) или милдроната — (6,9 • 10-6 М; милд 6), или сыворотки крови в разведениях 1:500 и 1:100 (сыв 500, сыв 100):
1 — фоновая амплитуда сокращений при воздействии раствором Кребса; * — различие с фоновым уровнем достоверно (р < 0,05) по критерию Уилкоксона; цифры 2 и/или 3 над столбиками означают, что различие со 2-м и/или 3-м тестированиями адреналином достоверно (р < 0,05) по критерию Уилкоксона.
При исследовании сыворотки крови небеременных женщин установлено, что ее 10 000-, 1000-, 50- и 10-кратные разведения, подобно аминокислотам, не изменяют ино-тропный эффект адреналина, в то время как 500- и 100-кратные разведения повышали его (рис. 1, г; см. рис. 3). Так, в опытах с 500-кратным разведением сыворотки крови при 1-м тестировании адреналин повышал амплитуду вызванных сокращений до 1,24 ± 0,12мН или до 105,2 ± 9,0% от фона, а при 2-м тестировании, т. е. совместно с сывороткой крови, до 1,53 ± 0,15 мН, или до 155,0 ± 14,0% от фона, или до 125,4, ± 9,0% от 1-го тестирования. При этом все различия между 1-м и 2-м тестированиями носили достоверный характер (р < 0,05). Аналогично, в опытах со 100-кратным разведением адреналин при 1-м тестировании повышал амплитуду вызванных сокращений до 1,12 ± 0,12 мН, или до 108,2 ± 8,9% от фона, а при 2-м тестировании, т. е. совместно с сывороткой крови — до 1,29 ± 0,11 мН, или до 127,5 ± 5,7% от фона, или до 119,9 ± 7,7% от 1-го тестирования. При этом различия между 1-м и 2-м тестированиями носили достоверный характер (р < 0,05) для двух последних способов расчетов.
Таким образом, нами установлено, что в опытах с миокардом пациентов с сердечной недостаточностью тирозин, гистидин и триптофан не усиливают положительный ино-тропный эффект адреналина (как это ранее было отмечено в опытах с гладкими мышцами и миокардом животных), в то время как сыворотка крови проявляет выявленную ранее на этих объектах бета-адреносенсибилизирующую активность.
Обсуждение результатов исследования
Влияние аминокислот на сократимость кардиомиоцитов. Нами установлено, что тирозин (5,5 • 10-5 и 5,5 • 10-4 М), гистидин (6,5 • 10-5 М) и триптофан (4,9 • 10-4 М) проявляют положительный инотропный эффект, сравнимый с эффектом адреналина (5,5 • 10-8 М). Он особенно выражен у тирозина, и в меньшей степени — у триптофана. Ранее в опытах с миометрием крысы было показано [16], что эти аминокислоты снижают амплитуду и суммарную сократительную активность миоцитов матки, т. е. действуют подобно адреналину при активации бета-АР. В опытах с миокардом лягушки было отмечено [11], что гистидин (2 • 10-4 М) не влияет на амплитуду вызванных электростимулами сокращений (триптофан и тирозин в этих опытах не исследовались). В то же время в опытах с миокардом правого желудочка крысы было выявлено [4], что гистидин (6,5 • 10-4 и 6,5 • 10-3 М) повышает амплитуду вызванных электростимулами сокращений, а тирозин (5,5 • 10-6-5,5 • 10-4 М) и триптофан (5 • 10-6-5 • 10-4 М) не влияют на нее. Таким образом, нами подтверждена способность гистидина проявлять положительный инотропный эффект в отношении миокарда теплокровных организмов и впервые установлена способность тирозина и триптофана оказывать подобный эффект в отношении миокарда пациентов, имеющих выраженную сердечную недостаточность. Хотя в нашем исследовании не изучался механизм, лежащий в основе инотропного эффекта тирозина, гистидина и триптофана, однако, с учетом данных Т. В. Тумановой [16] о снижении амплитуды сокращений миометрия крысы под влиянием аминокислот, мы можем предположить, что рост сократимости кардиомиоцитов под влиянием исследуемых аминокислот обусловлен тем, что они активируют бета-АР за счет присоединения к сайту рецептора, обладающему высоким сродством к этим трем аминокислотам. Гипотеза о наличии такого сайта была высказана ранее для объяснения бета-адреносенсибилизирующей активности этих трех аминокислот [6].
В литературе уже сообщалось, что ряд веществ, не являющихся агонистами бета-АР, могут в определенных случаях активировать эти рецепторы. В частности, это установлено в отношении антител к бета-АР, которые при взаимодействии со второй экстра-клеточной петлей бета1-АР приводят к активизации этого рецептора, что вызывает в опытах на сердце крысы такой же положительный хронотропный эффект, как агонисты бета1-АР [17, 18]. Мы не исключаем, что у пациентов с сердечной недостаточностью чувствительность бета-АР к тирозину, гистидину и триптофану выше, чем у здоровых людей или у лабораторных животных (крысы), поэтому у таких людей эти аминокислоты вызывают выраженный положительный инотропный эффект, сравнимый с эффектом адреналина. Это позволяет говорить о перспективности применения гистидина, триптофана и, особенно, тирозина для повышения силы сокращений у пациентов с сердечной недостаточностью.
Адренореактивность миокарда пациентов с сердечной недостаточностью. Нам
не удалось статистически подтвердить предположение о снижении чувствительности изолированного миокарда человека к адреналину при формировании сердечной недостаточности. Однако мы можем говорить о наличии такой зависимости, так как изолированный миокард пациентов с сердечной недостаточностью в одних опытах повышал амплитуду вызванных сокращений в ответ на воздействие адреналина в концентрации
5,5 • 10-8 М, а в других — не изменял ее. Это согласуется и с представлением ряда авторов о том, что при сердечной недостаточности снижается эффективность активации
бета-АР [17, 19]. Это снижение авторы объясняют повышением активности киназы бета-АР и накоплением ЛФХ. Мы также не исключаем, что в основе снижения бета-адреноре-активности миокарда лежит уменьшение экспрессии бета1-АР при хронической сердечной недостаточности.
Влияние аминокислот на бета-адренореактивность кардиомиоцитов. Как уже отмечалось выше, тирозин, гистидин и триптофан повышают эффективность активации бета-АР гладких мышц матки крысы [20], коронарной артерии свиньи и трахеи коровы [6], т. е. проявляют бета-адреносенсибилизирующую активность. В опытах с миокардом лягушки было показано, что инотропный эффект адреналина повышают гистидин [4, 11], а также триптофан и тирозин [4]. В опытах с миокардом крысы было установлено [4], что эти три аминокислоты не усиливают положительный инотропный эффект адреналина при его воздействии на интактный миокард, но существенно повышают инотропный эффект адреналина после обработки миокарда лизофосфатидилхолином (10-5 М), т. е. тирозин, гистидин и триптофан проявляют бета-адреносенсибилизирующую активность в условиях искусственно сниженной бета-адренореактивности. В наших исследованиях, проведенных с биоптатами ушка сердца пациентов с сердечной недостаточностью, было установлено, что тирозин, гистидин и триптофан, повышая амплитуду вызванных электростимулами сокращений, не усиливали достоверно положительный инотропный эффект адреналина. Более того, тирозин (5,5 • 10-4 М) и триптофан (4,9 • 10-4 М) даже снижали этот эффект. Мы полагаем, что эти аминокислоты не проявляют типичную для них бета-адреносенсибилизирующую активность, как минимум, по двум причинам. Первая причина заключается в том, что исходно, присоединяясь к сайту бета-АР, эти аминокислоты активируют бета-АР и тем самым вызывают положительный инотропный эффект. Поэтому последующая активация бета-АР адреналином не приводит к повышению силы сокращения. Не исключено также, что активация бета-АР аминокислотой вызывает процесс десенситизации (за счет их фосфорилирования киназой бета-АР). Вторая причина заключается, вероятно, в том, что при сердечной недостаточности изменяются свойства бета-АР и системы передачи сигнала от этого рецептора внутрь кардиомиоци-тов, в связи с чем аминокислоты не могут в полной мере проявить присущую им бета-адреносенсибилизирующую активность. Выше мы уже приводили данные литературы, свидетельствующие о снижении эффективности активации бета-АР у пациентов с сердечной недостаточностью [17, 19]. Таким образом, результаты наших исследований, с одной стороны, подтверждают представление об изменении в системе передачи сигнала от бета-АР внутрь кардиомиоцитов, а с другой — демонстрируют новый методический прием, позволяющий оценить реальное состояние бета-адренергического сигнального пути в кардиомиоцитах.
Влияние милдроната на сократимость. Милдронат, как известно [21, 22], достаточно широко применяется в кардиологии, в том числе при сердечной недостаточности. Это связано с тем, что он оказывает цитопротекторное действие [23, 24, 25]. Как указывают авторы, в основе механизма действия милдроната как цитопротектора лежит его свойство увеличивать жизнеспособность миокарда в условиях ишемии, в том числе способность ресинтезировать АТФ преимущественно за счет анаэробного гликолиза, затормаживая аэробное бета-окисление жирных кислот. В итоге, это переводит миокард на более кислородсберегающий путь ресинтеза АТФ и в целом обеспечивает создание оптимальной внутриклеточной концентрации ионов Са2+, в том числе за счет обеспечения энергией АТФ Са-насоса саркоплазматического ретикулума. Кроме того, в нашей
лаборатории было показано, что милдронат, подобно тирозину, гистидину и триптофану, в опытах с гладкими мышцами проявляет и бета-адреносенсибилизирующую активность [10]. В опытах с миокардом крысы милдронат в концентрациях 7 • 10-9-7 • 10-5 М повышает амплитуду вызванных электростимулами сокращений [4]. Авторы полагают, что этот эффект связан с повышением интенсивности ресинтеза АТФ в миокарде крысы. Мы ожидали, что в опытах с миокардом пациентов с сердечной недостаточностью мил-дронат также будет оказывать положительный инотропный эффект за счет активации бета-АР при воздействии на его сайт, чувствительный к аминокислотам. Однако выявить этот эффект нам не удалось — милдронат не влиял на амплитуду сокращений. Это может быть связано с тем, что, с одной стороны, сродство этого сайта к милдронату ниже, чем к тирозину, гистидину или триптофану, в связи с чем милдронат не активирует бета-АР. С другой стороны, не исключено, что милдронат не способен повышать интенсивность ресинтеза АТФ в изолированном миокарде пациентов с сердечной недостаточностью.
Ранее было показано, что милдронат подобно гистидину, триптофану и тирозину повышает эффективность активации бета-АР в гладких мышцах матки крысы [10], коронарной артерии свиньи [8] и трахеи коровы [10]. По данным Ю. А. Пенкиной и соавторов [4], в опытах с миокардом лягушки милдронат снижал положительный инотропный эффект адреналина, а в опытах с миокардом крысы — не влиял на него. По нашим данным, полученным в опытах с адреналином в высокой концентрации (5,5 • 10-6 М), мил-дронат не повышал положительный инотропный эффект адреналина. Косвенно эти данные позволяют утверждать, что, вероятнее всего, милдронат повышает эффективность активации бета2-АР, и не оказывает подобного эффекта в отношении бета1-АР.
В целом результаты наших исследований указывают на то, что милдронат не влияет существенно на сократимость и бета-адренореактивность кардиомиоцитов пациентов с сердечной недостаточностью, а его клинический эффект обусловлен, главным образом, изменением процессов ресинтеза АТФ под влиянием этого препарата.
Влияние сыворотки крови на сократимость и адренореактивность миокарда. Ранее было показано, что сыворотка крови человека в небольших разведениях (1:50, 1:10) повышает тонус гладких мышц матки крысы [26] и желудка крысы [27], а также амплитуду вызванных сокращений миокарда крысы [4, 28]. По данным Ю. А. Пенкиной и соавторов [4], этот эффект на миокарде крысы сыворотка крови вызывала в разведениях 1:100, 1:500 и даже 1:1000. В опытах с миокардом у пациентов с выраженной сердечной недостаточностью нами выявлено, что сыворотка крови в больших разведениях (1:10 000, 1:1000, 1:500, 1:100 и 1:50) не изменяет амплитуду сокращений, а в небольших (1:10 и 1:5) разведениях повышает ее. Ранее в опытах с миокардом крысы также было показано [29], что положительный инотропный эффект сыворотка крови человека оказывает лишь в разведениях 1:10 и 1:5. По мнению ряда авторов [4, 26, 27], способность сыворотки крови вызывать рост сократимости связана с наличием в ней эндогенного активатора сократимости миоцитов (ЭАСМ). Авторы полагают, что по своей природе ЭАСМ отличается от известных в настоящее время факторов, повышающих сократимость гладких мышц и миокарда, в том числе ЭАСМ отличается и от ангиотензина II. Ранее в опытах с миокардом крысы было подтверждено [29], что ЭАСМ не воздействует через ангиотензиновые рецепторы, так как блокатор этих рецепторов лозап (2,2 • 10-6 и
2,2 • 10-4 М) не препятствовал проявлению ЭАСМ-активности сыворотки крови человека. В то же время мы можем утверждать, что ЭАСМ оказывает свой эффект за счет повышения входа ионов Са2+ внутрь кардиомиоцитов, так как в опытах с миокардом
крысы верапамил (2 • 10-6 М) снижал положительный инотропный эффект пятикратного разведения сыворотки крови [29]. Полагаем, что положительный инотропный эффект сыворотки крови в опытах с миокардом человека может быть, как это и предполагали указанные выше авторы [26, 27], следствием наличия в крови ЭАСМ, который действует через специфические рецепторы. Кроме того, считаем, что сыворотка может оказывать положительный инотропный эффект и за счет наличия в ней ЭСБАР, который, как и аминокислоты, взаимодействуя с бета-АР кардиомиоцитов, вызывает их активацию и повышение амплитуды сокращения. Дальнейшее изучение положительного инотропно-го эффекта сыворотки крови является весьма перспективным, так как, с нашей точки зрения, позволит более детально изучить физиологическую роль ЭАСМ, в том числе его участие в регуляции деятельности сердца. В этом аспекте интерес представляют данные
Н. Л. Деминой и соавторов [1] о значительном повышении ЭАСМ-активности сыворотки крови у пациентов с артериальной гипертонией II степени тяжести и снижении ее при III степени тяжести. Это говорит о возможном участии ЭАСМ в патогенезе гипертонической болезни, в том числе за счет повышения сократимости миокарда.
Ранее было показано, что сыворотка крови человека (в разведениях 1:1000, 1:500, 1:100, 1:50 и 1:10) повышает эффективность активации бета-АР гладких мышц матки крысы [6], коронарной артерии свиньи [14] и трахеи коровы [26, 31], в том числе в условиях ее снижения под влиянием озона [8]. Этот эффект объяснялся наличием в крови ЭСБАР. В опытах с миокардом лягушки А. Н. Трухиным [11] было показано, что сыворотка пуповинной крови в разведении 1:100 повышает положительный инотроп-ный эффект адреналина, т. е. проявляет бета-адреносенсибилизирующую активность. Ю. А. Пенкиной [4] в опытах на сердце лягушки и на миокарде крысы показано, что ЭСБАР-активность проявляет только 500-кратное разведение сыворотки крови небеременных женщин. В целом эти авторы считали, что ЭСБАР активен не только в отношении бета-АР гладких мышц, но и бета-АР кардиомиоцитов. Нами в опытах с миокардом пациентов с выраженной сердечной недостаточностью впервые показано, что сыворотка крови небеременных женщин проявляет ЭСБАР-активность в разведениях 1:500 и 1:100. Это означает, что ЭСБАР в отличие от аминокислот и милдроната способен повысить эффективность активации бета1-АР и бета2-АР кардиомиоцитов пациентов с сердечной недостаточностью. С одной стороны, эти данные указывают на то, что по своей природе ЭСБАР отличается от гистидина, тирозина и триптофана. С другой стороны, они указывают на способность организма повышать эффективность активации бета-АР за счет наличия в крови специального фактора, т. е. ЭСБАР. Наиболее вероятно, что этот фактор повышает сродство бета-АР к катехоламинам, а также восстанавливает эффективность передачи сигнала от бета-АР к внутриклеточным рецепторам при условии, что она была нарушена под влиянием того или иного воздействия. Важно подчеркнуть, что даже при сердечной недостаточности, т. е. при снижении эффективности активации бета-АР эндогенный сенсибилизатор бета-АР, т. е. ЭСБАР, в отличие от гистидина, триптофана и тирозина, проявляет бета-адреносенсибилизирующую активность. Это указывает на ту большую роль, которую, очевидно, выполняет этот фактор, поддерживая способность катехоламинов регулировать деятельность сердца, в том числе на фоне сердечной недостаточности. Результаты наших исследований указывают на перспективность дальнейшего изучения природы и механизма действия ЭСБАР.
Заключение
1. Аминокислоты тирозин (5,5 • 10-5 М и 5,5 • 10-4 М), гистидин (6,5 • 10-5 М) и триптофан (4,9 • 10-4 М) в опытах с миокардом правого ушка сердца пациентов с сердечной недостаточностью оказывают положительный инотропный эффект, сравнимый с эффектом адреналина (5,5 • 10-8 М). В то же время эти аминокислоты не проявляют бета-адреносен-сибилизирующую активность в этих условиях.
2. Милдронат не изменяет сократимость и бета-адренореактивность миокарда правого ушка сердца человека.
3. Сыворотка крови человека в разведениях 1:10 и 1:5 повышает сократимость миокарда правого ушка сердца, а в разведениях 1:500 и 1:100 проявляет бета-адреносенсиби-лизирующую активность, т. е. повышает инотропный эффект адреналина.
* * *
Авторы выражают признательность за помощь в работе доктору медицинских наук, заведующему лабораторией консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России». А. А. Костяеву.
Литература
1. Демина Н.Л., Циркин В. И., Тарловская Е. И. и др. а и ß-адрено-, М-холиномодулирующая активность сыворотки крови при артериальной гипертензии // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2008. № 2. С. 16.
2. Циркин В. И., Кононова Т. Н., Сизова Е. Н. и др. Изменение ß-адрено- и М-холиномодулирую-щей активности сыворотки крови и мочи при бронхиальной астме // Физиология человека. 2008. Т. 34, № 3. С. 137-140.
3. Сизова Е. Н., Циркин В. И., Дворянский С. А. Изучение роли эндогенных модуляторов хемореактивности в регуляции коронарного кровотока // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2002. Т. 88, № 7. С. 856-864.
4. Пенкина Ю. А., Ноздрачёв А. Д., Циркин В. И. Влияние сыворотки крови человека, гистидина, триптофана, тирозина, милдроната и лизофосфатидилхолина на инотропный эффект адреналина в опытах с миокардом лягушки и крысы // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2008. Вып. 1. С. 55-68.
5. Циркин В. И., Ноздрачёв А. Д., Трухин А. Н. и др. Влияние эндогенных модуляторов ß-адрено-и М-холинореактивности на вариабельность сердечного ритма // Докл. РАН. 2004. Т. 394, №4. С. 562.
6. Сизова Е. Н., Циркин В. И. Физиологическая характеристика эндогенных модуляторов ß-адрено- и М-холинореактивности. Киров: Изд-во ВСЭИ, 2006. 183 с.
7. Ноздрачёв А. Д., Туманова Т. В., Дворянский С. А. и др. Активность ряда аминокислот как возможных сенсибилизаторов ß-адренорецепторов гладкой мышцы // Докл. РАН. 1998. Т. 363, № 1. С. 133.
8. Сизова Е. Н., Циркин В. И., Туманова Т. В. и др. Способность гистидина, триптофана, тирозина, триметазидина, милдроната и сыворотки крови уменьшать ß-адреноблокирующий эффект озона // Современные наукоемкие технологии. 2004. № 3. С. 21-26.
9. Циркин В. И., Сизова Е. Н., Подтетенев А. Д., Братчикова Т. В. и др. Триметазидин и милдронат как ß2-адреносенсибилизаторы прямого действия (экспериментальные доказательства) // Рос. кардиол. журнал. 2002. № 1 (33). С. 45-52.
10. Сизова Е. Н., Циркин В. И., Подтетенев А. Д. и др. Способность триметазидина (предукта-ла) и милдроната оказывать прямое в-адреносенсибилизирующее действие на гладкие мышцы. Сообщение 2 // Рос. кардиол. журн. 2002. № 2 (34). С. 50-56.
11. Трухин А. Н., Циркин В. И., Сизова Е. Н. Повышение в-адренореактивности миокарда лягушки под влиянием гистидина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. Т. 138, № 8. С. 144-147.
12. Бураковский В. И., Бокерия Л. А., Алекси-Месхишвили В. В. и др. Сердечно-сосудистая хирургия: руководство / под ред. акад. В. И. Бураковского. М.: Медицина. 1989. 752 с.
13. Поздняков Ю. М., Красницкий В. Б. Практическая кардиология. 3-е изд., испр. и доп. М.: БИНОМ, 2007. 776 с.
14. Циркин В. И., Дворянский С. А., Ноздрачёв А. Д. и др. Повышение в-адренореактивности коронарных артерий под влиянием сыворотки крови // Докл. Акад. наук. 1996. Т. 351, № 4. C. 565566.
15. Гланц С. Медико-биологическая статистика / пер. с англ. М.: Практика, 1998. 459 с.
16. Туманова Т. В. Изучение природы эндогенного сенсибилизатора в-адренорецепторов и других факторов, регулирующих сократимость и адренореактивность гладкой мускулатуры: дис. ... канд. биол. наук. Киров, 1998. 236 с.
17. Красникова Т.Л., Габрусенко С. А. в-адренергические рецепторы сердца в норме и при сердечной недостаточности // Успехи физиол. наук. 2000. Т. 31, № 2. С. 35-50.
18. Magnusson Y., Wallukat G., Waagstein F. et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy // Circulation. 1994. Vol. 89. P. 2760-2767.
19. Brodde O., Bruck H., Leineweber K. Cardiac adrenoceptors: physiological and pathophysiological relevance // J. Pharmacol. Sci. 2006. Vol. 100, N 5. P. 323-337.
20. Сизова Е. Н., Циркин В. И., Туманова Т. В. Влияние пищевых аминокислот на сократительную способность, в-адрено- и М-холинореактивность гладких мышц крыс // Вопросы питания.
2008. Т. 77, № 5. С. 26-32.
21. Гордеев И. Г., Лучинкина Е. Е., Люсов В. А. Антиоксидантный эффект кардиопротектора милдроната у пациентов, подвергшихся коронарной реваскуляризации // Рос. кардиол. журн. 2009. Т. 75, № 1. С. 31-36.
22. Стаценко М. Е., Туркина С. В., Беленкова С. В. Возможности применения милдроната у больных хронической сердечной недостаточностью с сахарным диабетом 2-го типа и автономной кардиальной нейропатией // Рос. кардиол. журн. 2009. Т. 77, № 3. С. 69-75.
23. Александров А. А. Диабетическое сердце: схватка за митохондрии // Consikium medicum. 2003. Т. 05, № 9. С. 509-513.
24. Михин В. П., Савельева В. В. Роль кардиопротекторов в терапии хронической сердечной недостаточности ишемического генеза // Рос. кардиол. журн. 2009. Т. 75, № 1. С. 49-56.
25. Стаценко М. Е., Туркина С. В., Беленкова С. В. и др. Влияние милдроната в составе комбинированной терапии хронической сердечной недостаточности у больных сахарным диабетом 2-го типа на углеводный, липидный обмен и показатели оксидативного стресса // Рос. кардиол. журн. 2010. Т. 82, № 2. С. 45-51.
26. Циркин В. И., Демина Н. Л., Сизова Е. Н. и др. Эндогенный активатор сократимости мио-цитов и артериальная гипертензия // Вятский медицинский вестник. Киров. 2008. № 1. С. 55-66.
27. Куншин А. А., Ноздрачёв А.Д., Циркин В. И. и др. Влияние сыворотки крови человека на М-холино- и а-, в-адренореактивность гладких мышц желудка крысы // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3: Биология. 2007. № 3. С. 40.
28. Mocanu M., Botea S., Dragomir C. Proofs concerning the existence, in the blood of hypertensive patients, of some serum factors influencing the vascular smooth muscle and the myocardium physiology // Rev. Roum-morphol. et Embriol. 1991. Vol. 37, N 1-2. P. 75-80.
29. Коротаева К. Н. Миоцитстимулирующая активность сыворотки крови человека в опытах с миокардом крысы и человека // Тез. «Фундаментальная наука и клиническая медицина». СПб.,
2009. С. 181-182.
3G. Демина Н. Л., Циркин В. И., Тарловская Е. И. и др. Альфа-адреномодулирующая активность сыворотки крови при артериальной гипертензии // Pос. кардиол. журн. 2GG8. № 1 (69). С. 63-7G.
31. Кононова Т. Н. Pоль эндогенных ß-адрено- и М-холиномодуляторов в регуляции деятельности систем организма человека: дис. ... канд. биол. наук. Киров, 2GG4. 173 с.
Статья поступила в редакцию 2G декабря 2G1G г.
