Научная статья на тему 'Влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой'

Влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
108
58
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЙ ГЕМОГЛОБИН / НАРУШЕНИЕ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА / РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА / АФФИННЫЙ СОРБЕНТ / ПОЛИАКРИЛАМИДНЫЙ ГЕЛЬ / МЕТА-АМИНОФЕНИЛБОРОНОВАЯ КИСЛОТА / GLYCOSYLATED HEMOGLOBIN / DISTURBANCE OF CARBOHYDRATE METABOLISM / EARLY DIAGNOSIS / AFFINITY SORBENT / POLYACRYLAMIDE GEL / META-AMINOPHENILBORONIC ACID

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Сулейманова М. Х., Басченко И. А., Монаков Ю. Б.

Разработан аффинный сорбент на основе модифицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой (м-АФБК), предназначенный для количественного определения гликозилированного гемоглобина (Hb Alc) в ранней диагностике нарушений углеводного обмена. Показано, что сорбент обеспечивает получение стабильных результатов в температурном интервале от 18 до 28 oC.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Сулейманова М. Х., Басченко И. А., Монаков Ю. Б.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

TEMPERATURE EFFECT ON SORPTION ACTIVITY OF AFFINITY SORBENT CONTAINING IMMOBILIZED m-AMINOPHENILBORONIC ACID

The affinity sorbent has been developed on the basis of modified polyacrylamide gel containing meta-aminophenilboronic acid (m-APhBA) for the quantitative determination of the level of glycosylated hemoglobin (HbA1c) during the early diagnosis of carbohydrate metabolism disturbance. It has been found, that the sorbent allow to obtain the stabile results in the temperature range from 18° to 28° C.

Текст научной работы на тему «Влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой»

М. Х. Сулейманова, И. А. Басченко, Ю. Б. Монаков 1

Влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента с иммобилизованной ж-аминофенилбороновой кислотой

Институт биологии УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 69; тел. (3472) 35-62-47 1 Институт органической химии УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71; тел. (3472) 35-60-66

Разработан аффинный сорбент на основе модифицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой (м-АФБК), предназначенный для количественного определения гликозилированно-го гемоглобина (НЬ • А1с) в ранней диагностике нарушений углеводного обмена. Показано, что сорбент обеспечивает получение стабильных результатов в температурном интервале от 18 до 28 0С.

Ключевые слова: гликозилированный гемоглобин, нарушение углеводного обмена, ранняя диагностика, аффинный сорбент, полиакриламидный гель, мета-аминофенилбороновая кислота.

Введение

Главное преимущество аффинного сорбента состоит в его высокой избирательности, позволяющей извлекать из смеси биологических веществ компоненты, представленные в ничтожно малых относительных количествах. Аффинные сорбенты с использованием иммобилизованной аминофенилбороновой кислоты (АФБК) позволяют выделять биополимеры, содержащие ^ис-диольные группы, например, нуклеозиды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, моносахариды, биологически активные вещества 1-4. Монослой производного АФБК на ферментном электроде применяют для определения глюкозы 5, в качестве сенсора моносахаридов 6.

Разработка методов ранней диагностики нарушений углеводного обмена сопряжена с использованием новых биомаркеров, одним из которых является гликозилированный гемоглобин (НЬА1С). Величина НЬА1С представляет собой интегральный показатель уровня гликемии 7 за период, определяемый временем полужизни эритроцита в кровотоке

(90—120 дней), не подверженный резким колебаниям в течение короткого промежутка времени, что характерно для уровня глюкозы в крови. В настоящее время интерес к применению показателя HbA1c для диагностики диабета возрос 8’ 9, однако широкое использование этого надежного параметра в клиниках сдерживается из-за сложности методов его определения. Например, диагностический набор на основе ионообменного сорбента, изготовленный в виде колонок для одноразового определения гликозилированного гемоглобина фирмы «Sigma» (США) обладает высокой чувствительностью к температурному фактору.

Целью нашей работы явилось создание аффинной тест-системы для многократного количественного определения гликозилиро-ванного гемоглобина, применяемой в ранней диагностике нарушений углеводного обмена, пригодной к эксплуатации при широком температурном диапазоне.

Экспериментальная часть

Выбор полиакриламидного геля (ПААГ) в качестве материала матрицы для нового аффинного сорбента обусловлен его свойствами: ПААГ стабилен в диапазоне рН 1—10; он не содержит заряженных групп, и поэтому ионообменные взаимодействия с хроматографируемыми веществами минимальны; биологически инертен и вследствие этого не подвержен микробной атаке.

Синтез аффинного сорбента состоит из 4 стадий (рис. 1). Гидразидные производные ПААГ (1) получали воздействием 6 М раствора гидразингидрата на ПААГ в течение 5—7 ч при 47 0С (рис. 1, а), затем отмывали дистиллированной водой до отрицательной реакции в смывах на альдегиды реактивом Несслера и

Дата поступления 04.08.06 22 Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. .№■ 4

,0

-г 47 °С

Г'хти + И2М-МЫ2 47 С

ыы2 2 2

г

о

чкы-кы2

+

ад

ПААГ Гидразингидрат

б)

^-г

кы-кы2

о

ч'

о

С—(СЫ2)зС _Ы2°,

ы

ы

<° ы

1-г' ы //•

кы—К=С—(Сы2)3Сч

о

ы

в)

глутаровыи альдегид

-с;

т

Н

р

ЫН-Ы= С— (СН2)з—Сч + Н

В

„он

'он

г)

.и-АФБК

О

С

ын-ы= с—(сн2)з—с=^+н2о н н

/

В.

он

он

4 оС

О

С

Азометиновые

связи

'ЫН-Ы=СН—(СН2)3-СН=Ы + Ыа[ВЩ] + 4И2О

1 борогидрид

4 оС

О

Он наприя

В

ОН

О

С

4ЫН—ЫН—СН2—(СН2)3—СН2—ЫН + Н3ВО3 + ЫаОН + 2Н2|

О

ОН

Аффинный сорбент

В

ОН

Рис. 1. Стадии синтеза аффинного сорбента: А — получение гидразидного производного ПААГ; Б — активация матрицы глутаровым альдегидом; В — иммобилизация лиганда; Г — стабилизация азометиновых связей в сорбенте.

1

+

2

уравновешивали 0.2 М натрий-фосфатным буфером (pH 7.4). Последующая активация 1 25%-ным раствором глутарового альдегида в течение 24 ч при температуре 37 оС способствовала тому, что в мягких условиях (pH 7.4—7.6) между 1 и молекулой глутарового альдегида образуется двойная связь, активированная соседством альдегидной группы (рис. 1, б). Модифицированную матрицу сорбента, активированную глутаровым альдегидом (2), отмывали 30—50 кратным объемом дистиллированной воды с последующим контролем смывов на отсутствие альдегидных групп реактивом Нессле-ра. Затем 2 помещали в натрий-фосфатный буфер (pH 9.3).

Для процесса иммобилизации лиганда (л-АФБК) на 2 (рис. 1, в) предварительно готовили раствор: 820 мг л-АФБК растворяли в смеси 1 мл 96%-го этилового спирта, 35 мл 0.1 н. карбонатного буфера (рН 9.3) и 5 мл 1 н. NaOH. Отбирали 40 мл из приготовленной смеси растворов и смешивали с 40 мл 2, после этого сосуд с сорбентом инкубировали в темном месте при температуре 20 оС в течение 17 ч.

Процесс иммобилизации лиганда завершали обработкой сорбента 2% раствором NaBH4 и выдержкой при температуре 4 оС в течение 2 ч для стабилизации азометиновых связей (рис. 1, г). Сорбент готов для биохимических исследований.

Результаты и их обсуждение

Проведенные нами исследования показали, что сорбент эффективно работает в течение 7 циклов определения HbA1c на одной микроколонке с вариабельностью показателя, не превышающей 5%. Результаты определения в одних и тех же пробах различаются между собой с коэффициентом вариабельности не более 5%, что говорит о хорошей стабильности сорбента 10-11.

Известно, что ионообменные колонки, например, для определения гликозилированного гемоглобина в диагностических целях фирмы «Sigma» (США), предназначены для работы в узком температурном диапазоне, и в формуле расчета требуется использовать коэффициент поправки на температуру.

Нами было исследовано влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента на основе модифицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной л-АФБК при нагрузке его гликозилирован-ным гемоглобином.

Для исследований брались образцы гемолизата крови здорового человека и больного сахарным диабетом в стадии декомпенсации. Использовали аффинную тест-систему на основе ПААГ с иммобилизованной л-АФБК и тест-систему с сорбентом по типу катионо-обменника «Sigma» (США).

При определении показателя HbA1c большое значение имеет объем наносимого на сорбент гемолизата, который отражает максимальную емкость сорбента.

При изучении динамики изменения емкости сорбента на основе ПААГ с изменением нагрузки гемоглобином было установлено, что оптимальный объем гемолизата, наносимый на колонку, равен 0.2 мл. На рис. 2 дана картина изменения максимальной емкости аффинного сорбента при нагрузке гемолизатом от 0.2 до 1.0 мл двух образцов крови (здорового человека и больного сахарным диабетом в стадии декомпенсации).

Рис. 2. Определение максимальной емкости сорбента по нагрузке гемоглобином

Исследование зависимости соотношений емкости сорбента по нагрузке HbAlc от значения pH буфера на примере образцов гемолизата здорового человека и больных СД показало, что максимальная сорбция HbAlc аффинным сорбентом на основе полиакриламидного геля осуществляется в калий-фосфатном буфере при pH 8.5.

Исследования влияния температуры на сорбционную активность аффинного сорбента на основе модифицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной л-АФБК при нагрузке гликозилированным гемоглобином (рис. 3) показали, что аффинная тест-система на основе ПААГ работает стабильно в широком температурном диапазоне, в отличие от тест-системы фирмы «Sigma» (США), изготовленной на основе сорбента по типу катионообменника.

Таким образом, нами разработана тест-система, синтезированная на основе моди-

фицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной л-АФБК, пригодная к многократному (7 циклов) определению гли-козилированного гемоглобина и позволяющая получать стабильные результаты анализа в помещениях с температурой от 18 до 28 оС.

В то же время, диагностические колонки фирмы «Sigma» (США) с сорбентом для ка-

тионообменной хроматографии пригодны только для одноразового использования. При этом они строго приспособлены к работе в режиме узкого температурного диапазона в помещении лаборатории, а при расчетах показателя ИБЛ1С по формуле требуется дополнительно рассчитывать коэффициент на температурную поправку.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Рис. 3. Влияние температуры на сорбционную активность при нагрузке НЬА1с сорбента на основе ПААГ с иммобилизованной л-АФБК и сорбента по типу катионообменника

Литература

1. Остерман Л. А. Методы исследования белков 7.

и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультра-центрифцгирование.— М.: Наука, 1981.— 242 с.

2. Аффинная хроматография: Методы. / Под ред.

Дин П., Джонсон У., Мидл Ф.— М.: Мир, 8.

1988.- 278 с.

3. Остерман Л. А., Хроматография белков и нук- 9.

леиновых кислот.- М.: Наука, 1985.- 536 с.

4. Zayats M. and Katz E., Willner L. // J. Am. 10.

Chem. Soc. - 2002.- Dec 11; 124(49).- 14724.

5. Lee M., Kim T. I., Kim K. H., Kim J. H,

Choi M. S., Choi H. J., Koh K. // Anal. Biochem.- 2002. — Nov. 15; 310(2).- 163. 11.

6. Рабинович С. Э., Платонова Л. В., Дюжева Т. Г. // Вопр. мед. химии.- 1993.- Т.

39, № 5.- С. 58.

Галенок В. А., Боднар П. Н., Диккер В. Е., Ромашкан С. В. Гликозилированные протеины.— Новосибирск: Наука, Сиб. отделение,

1989.- 258 с.

Торосян А. Г., Титов В. Н., Мазовецкий А. Г., Завадский П. С.//Лаб. дело.- 1988, № 8.-С. 5. Корягина И. Ю. // Клин. лаб. диагностика.-2002.- № 5.- С. 25.

Басченко И. А., Гарипова М. И., Сулейманова М. Х., Монаков Ю. Б., Зарудий Ф. С., Давлетов Э. Г. // Здравоохр. Башкортостана.-1997.- № 6.- С. 54.

Сулейманова М. Х., Басченко И. А., Зару-дий Ф. С., Давлетов Э. Г., Монаков Ю. Б. / Актуальные проблемы прикладной биохимии и биотехнологии: Тез. докл.- Уфа, 1998.-С. 240.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.