CC BY
58
М. Х. Сулейманова, И. А. Басченко, Ю. Б. Монаков 1
Влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента с иммобилизованной ж-аминофенилбороновой кислотой
Институт биологии УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 69; тел. (3472) 35-62-47 1 Институт органической химии УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71; тел. (3472) 35-60-66
Разработан аффинный сорбент на основе модифицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой (м-АФБК), предназначенный для количественного определения гликозилированно-го гемоглобина (НЬ • А1с) в ранней диагностике нарушений углеводного обмена. Показано, что сорбент обеспечивает получение стабильных результатов в температурном интервале от 18 до 28 0С.
Ключевые слова: гликозилированный гемоглобин, нарушение углеводного обмена, ранняя диагностика, аффинный сорбент, полиакриламидный гель, мета-аминофенилбороновая кислота.
Введение
Главное преимущество аффинного сорбента состоит в его высокой избирательности, позволяющей извлекать из смеси биологических веществ компоненты, представленные в ничтожно малых относительных количествах. Аффинные сорбенты с использованием иммобилизованной аминофенилбороновой кислоты (АФБК) позволяют выделять биополимеры, содержащие ^ис-диольные группы, например, нуклеозиды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, моносахариды, биологически активные вещества 1-4. Монослой производного АФБК на ферментном электроде применяют для определения глюкозы 5, в качестве сенсора моносахаридов 6.
Разработка методов ранней диагностики нарушений углеводного обмена сопряжена с использованием новых биомаркеров, одним из которых является гликозилированный гемоглобин (НЬА1С). Величина НЬА1С представляет собой интегральный показатель уровня гликемии 7 за период, определяемый временем полужизни эритроцита в кровотоке
(90—120 дней), не подверженный резким колебаниям в течение короткого промежутка времени, что характерно для уровня глюкозы в крови. В настоящее время интерес к применению показателя HbA1c для диагностики диабета возрос 8’ 9, однако широкое использование этого надежного параметра в клиниках сдерживается из-за сложности методов его определения. Например, диагностический набор на основе ионообменного сорбента, изготовленный в виде колонок для одноразового определения гликозилированного гемоглобина фирмы «Sigma» (США) обладает высокой чувствительностью к температурному фактору.
Целью нашей работы явилось создание аффинной тест-системы для многократного количественного определения гликозилиро-ванного гемоглобина, применяемой в ранней диагностике нарушений углеводного обмена, пригодной к эксплуатации при широком температурном диапазоне.
Экспериментальная часть
Выбор полиакриламидного геля (ПААГ) в качестве материала матрицы для нового аффинного сорбента обусловлен его свойствами: ПААГ стабилен в диапазоне рН 1—10; он не содержит заряженных групп, и поэтому ионообменные взаимодействия с хроматографируемыми веществами минимальны; биологически инертен и вследствие этого не подвержен микробной атаке.
Синтез аффинного сорбента состоит из 4 стадий (рис. 1). Гидразидные производные ПААГ (1) получали воздействием 6 М раствора гидразингидрата на ПААГ в течение 5—7 ч при 47 0С (рис. 1, а), затем отмывали дистиллированной водой до отрицательной реакции в смывах на альдегиды реактивом Несслера и
Дата поступления 04.08.06 22 Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. .№■ 4
,0
-г 47 °С
Г'хти + И2М-МЫ2 47 С
ыы2 2 2
г
о
чкы-кы2
+
ад
ПААГ Гидразингидрат
б)
^-г
,о
кы-кы2
о
ч'
о
С—(СЫ2)зС _Ы2°,
ы
ы
<° ы
1-г' ы //•
кы—К=С—(Сы2)3Сч
о
ы
в)
глутаровыи альдегид
.О
№
-с;
т
Н
р
ЫН-Ы= С— (СН2)з—Сч + Н
В
„он
'он
г)
.и-АФБК
О
С
ын-ы= с—(сн2)з—с=^+н2о н н
/
В.
он
он
4 оС
О
С
Азометиновые
связи
'ЫН-Ы=СН—(СН2)3-СН=Ы + Ыа[ВЩ] + 4И2О
1 борогидрид
4 оС
О
Он наприя
В
ОН
О
С
4ЫН—ЫН—СН2—(СН2)3—СН2—ЫН + Н3ВО3 + ЫаОН + 2Н2|
О
ОН
Аффинный сорбент
В
ОН
Рис. 1. Стадии синтеза аффинного сорбента: А — получение гидразидного производного ПААГ; Б — активация матрицы глутаровым альдегидом; В — иммобилизация лиганда; Г — стабилизация азометиновых связей в сорбенте.
1
+
2
уравновешивали 0.2 М натрий-фосфатным буфером (pH 7.4). Последующая активация 1 25%-ным раствором глутарового альдегида в течение 24 ч при температуре 37 оС способствовала тому, что в мягких условиях (pH 7.4—7.6) между 1 и молекулой глутарового альдегида образуется двойная связь, активированная соседством альдегидной группы (рис. 1, б). Модифицированную матрицу сорбента, активированную глутаровым альдегидом (2), отмывали 30—50 кратным объемом дистиллированной воды с последующим контролем смывов на отсутствие альдегидных групп реактивом Нессле-ра. Затем 2 помещали в натрий-фосфатный буфер (pH 9.3).
Для процесса иммобилизации лиганда (л-АФБК) на 2 (рис. 1, в) предварительно готовили раствор: 820 мг л-АФБК растворяли в смеси 1 мл 96%-го этилового спирта, 35 мл 0.1 н. карбонатного буфера (рН 9.3) и 5 мл 1 н. NaOH. Отбирали 40 мл из приготовленной смеси растворов и смешивали с 40 мл 2, после этого сосуд с сорбентом инкубировали в темном месте при температуре 20 оС в течение 17 ч.
Процесс иммобилизации лиганда завершали обработкой сорбента 2% раствором NaBH4 и выдержкой при температуре 4 оС в течение 2 ч для стабилизации азометиновых связей (рис. 1, г). Сорбент готов для биохимических исследований.
Результаты и их обсуждение
Проведенные нами исследования показали, что сорбент эффективно работает в течение 7 циклов определения HbA1c на одной микроколонке с вариабельностью показателя, не превышающей 5%. Результаты определения в одних и тех же пробах различаются между собой с коэффициентом вариабельности не более 5%, что говорит о хорошей стабильности сорбента 10-11.
Известно, что ионообменные колонки, например, для определения гликозилированного гемоглобина в диагностических целях фирмы «Sigma» (США), предназначены для работы в узком температурном диапазоне, и в формуле расчета требуется использовать коэффициент поправки на температуру.
Нами было исследовано влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента на основе модифицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной л-АФБК при нагрузке его гликозилирован-ным гемоглобином.
Для исследований брались образцы гемолизата крови здорового человека и больного сахарным диабетом в стадии декомпенсации. Использовали аффинную тест-систему на основе ПААГ с иммобилизованной л-АФБК и тест-систему с сорбентом по типу катионо-обменника «Sigma» (США).
При определении показателя HbA1c большое значение имеет объем наносимого на сорбент гемолизата, который отражает максимальную емкость сорбента.
При изучении динамики изменения емкости сорбента на основе ПААГ с изменением нагрузки гемоглобином было установлено, что оптимальный объем гемолизата, наносимый на колонку, равен 0.2 мл. На рис. 2 дана картина изменения максимальной емкости аффинного сорбента при нагрузке гемолизатом от 0.2 до 1.0 мл двух образцов крови (здорового человека и больного сахарным диабетом в стадии декомпенсации).
Рис. 2. Определение максимальной емкости сорбента по нагрузке гемоглобином
Исследование зависимости соотношений емкости сорбента по нагрузке HbAlc от значения pH буфера на примере образцов гемолизата здорового человека и больных СД показало, что максимальная сорбция HbAlc аффинным сорбентом на основе полиакриламидного геля осуществляется в калий-фосфатном буфере при pH 8.5.
Исследования влияния температуры на сорбционную активность аффинного сорбента на основе модифицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной л-АФБК при нагрузке гликозилированным гемоглобином (рис. 3) показали, что аффинная тест-система на основе ПААГ работает стабильно в широком температурном диапазоне, в отличие от тест-системы фирмы «Sigma» (США), изготовленной на основе сорбента по типу катионообменника.
Таким образом, нами разработана тест-система, синтезированная на основе моди-
фицированного полиакриламидного геля с иммобилизованной л-АФБК, пригодная к многократному (7 циклов) определению гли-козилированного гемоглобина и позволяющая получать стабильные результаты анализа в помещениях с температурой от 18 до 28 оС.
В то же время, диагностические колонки фирмы «Sigma» (США) с сорбентом для ка-
тионообменной хроматографии пригодны только для одноразового использования. При этом они строго приспособлены к работе в режиме узкого температурного диапазона в помещении лаборатории, а при расчетах показателя ИБЛ1С по формуле требуется дополнительно рассчитывать коэффициент на температурную поправку.
Рис. 3. Влияние температуры на сорбционную активность при нагрузке НЬА1с сорбента на основе ПААГ с иммобилизованной л-АФБК и сорбента по типу катионообменника
Литература
1. Остерман Л. А. Методы исследования белков 7.
и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультра-центрифцгирование.— М.: Наука, 1981.— 242 с.
2. Аффинная хроматография: Методы. / Под ред.
Дин П., Джонсон У., Мидл Ф.— М.: Мир, 8.
1988.- 278 с.
3. Остерман Л. А., Хроматография белков и нук- 9.
леиновых кислот.- М.: Наука, 1985.- 536 с.
4. Zayats M. and Katz E., Willner L. // J. Am. 10.
Chem. Soc. - 2002.- Dec 11; 124(49).- 14724.
5. Lee M., Kim T. I., Kim K. H., Kim J. H,
Choi M. S., Choi H. J., Koh K. // Anal. Biochem.- 2002. — Nov. 15; 310(2).- 163. 11.
6. Рабинович С. Э., Платонова Л. В., Дюжева Т. Г. // Вопр. мед. химии.- 1993.- Т.
39, № 5.- С. 58.
Галенок В. А., Боднар П. Н., Диккер В. Е., Ромашкан С. В. Гликозилированные протеины.— Новосибирск: Наука, Сиб. отделение,
1989.- 258 с.
Торосян А. Г., Титов В. Н., Мазовецкий А. Г., Завадский П. С.//Лаб. дело.- 1988, № 8.-С. 5. Корягина И. Ю. // Клин. лаб. диагностика.-2002.- № 5.- С. 25.
Басченко И. А., Гарипова М. И., Сулейманова М. Х., Монаков Ю. Б., Зарудий Ф. С., Давлетов Э. Г. // Здравоохр. Башкортостана.-1997.- № 6.- С. 54.
Сулейманова М. Х., Басченко И. А., Зару-дий Ф. С., Давлетов Э. Г., Монаков Ю. Б. / Актуальные проблемы прикладной биохимии и биотехнологии: Тез. докл.- Уфа, 1998.-С. 240.
