CC BY
182
УДК 615:665.527.92
ВЛИЯНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭКСТРАГИРОВАНИЯ ФЛАВОНОИДОВ ИЗ ТРАВЫ ДЕВЯСИЛА БРИТАНСКОГО WU£A BBITANNICAU
В статье представлены результаты изучения влияния различных технологических факторов на эффективность экстрагирования флавоноидов из травы девясила британского (Inula britannica L.), произрастающего в Волгоградской области.
На основании проведенных исследований, подобраны оптимальные условия извлечения флавоноидов из сырья девясила британского с применением в качестве экстрагента спирта этилового 70%: степень измельчения 1 мм; соотношение сырьё - экстрагент 1:200, трёхкратная экстракция по 15 минут. Разработан режим экстрагирования, обеспечивающий максимальный выход максимальный выход данной фракции биологически активных соединений (1,64% ± 0,009% (в пересчете на рутин) из травы девясила британского.
Ключевые слова: девясил британский, флавоноиды, экстракция.
Не теряет своей актуальности вопрос о расширении сырьевой базы для производства лекарственных средств. Перспективным источником растительного сырья, на основе которого возможно получение отечественных конкурентоспособных эффективных лекарственных препаратов, являются виды рода Девясил - Inula L.
В настоящее время в Государственный реестр лекарственных средств Российской Федерации включено лекарственное растительное сырье (корневища и корни) только 1 вида - девясила высокого (Inula helenium L.) Тогда как, близкие по систематическому положению и морфологическим признакам к официнальному виды девясила, на протяжении длительного времени успешно применяемые в народной медицине для лечения различных заболеваний, до сих пор не используются в медицинской практике.
Проведёнными ранее исследованиями установлено, разнообразие химического состава травы девясила британского (Inula britannica L.) [14], одного из широко распространенных и являющегося ценозообразующим растением на территории Волгоградской области. Наличие в составе девясила британского флавоноидов и гидроксикоричных кислот позволяют прогнозировать антиоксидантную [20], гепатопротекторную, противовоспалительную активности его сырья. Однако в нашей стране из-за отсутствия соответствующих нормативных документов девясил британский не является официнальным растением и не используется в достаточной мере, что делает его приоритетным для фармакогностического изучения и включения в число офи-цинальных лекарственных растений. В связи этим представляется актуальным оптимизация процесса экстрагирования сырья девясила британского, обеспечивающая максимальный выход данной фракции.
Поэтому целью исследований являлась разработка оптимального режима экстрагирования, обеспечивающего максимальный выход флавоноидов из травы девясила британского, произрастающего на территории Волгоградской области.
Материалы и методы. Объектом исследования служило воздушно-сухое сырье (трава) девясила британского, собранное в фазу полного цветения от дикорастущих популяций на территории Волгоградской области в июле-августе 2012 г. Сырье для исследования было заготовлено в естественных местах произрастания растительных объектов в различных районах Волгоградской области.
Ранее проведенными исследованиями нами установлено, что максимальное извлечение экстрактивных веществ наблюдалось при использовании спирта этилового в концентрации 70% (41,86±0,35%) [13].
Современные способы переработки и использования лекарственного растительного сырья основываются на извлечении ценных компонентов, их переходе в нейтральный носитель. Основными факторами, влияющими на скорость и полноту экстракции биологически активных веществ из растительного сырья, являются тип экстрагента, температура, степень измельчения сырья, модуль и кратность экстракции, а также продолжительность экстрагирования.
Для оптимизации процесса экстрагирования флавоноидной фракции применяли метод математического планирования эксперимента - метод крутого восхождения по Боксу-Уилсону
И.Ю. МИТРОФАНОВА
A.В. ЯНИЦКАЯ
B.В. ГУКАСОВА
Волгоградский государственный медицинский университет
e-mail: [email protected]
[1, 12]. Для изучения зависимости содержания флавоноидов и полноты их экстракции из сырья получали спиртовые извлечения при следующих значениях факторов в различных комбинациях: модуль экстракции 1:10 и 1:200, степень измельчения частиц 1 мм и 5 мм, время настаивания 15 мин и 90 мин в режиме однократной и трехкратной экстракции [3, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18]. В зависимости от комбинаций значений факторов была составлена матрица дробного факторного эксперимента, в соответствии с которой реализовались опыты.
Оценку эффективности экстракции проводили по содержанию экстрактивных веществ и флавоноидов (табл. 2). Содержание экстрактивных веществ определяли в соответствии со статьей ГФ XI [7].
В качестве метода количественного определения флавоноидов в сырье девясила британского выбран метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на способности фла-воноидов образовывать окрашенные хелатные комплексы со спиртовым раствором алюминия хлорида в среде кислоты хлористоводородной разведённой. При этом максимум поглощения первой полосы по сравнению с исходным флавоноидом смещается на 35 - 50 нм к видимой области (батохромный сдвиг) [2].
Содержание флавоноидов в извлечениях из травы девясила британского определяли по следующей методике, предложенной Лесовой Ж.С. с соавт. [9, 10]: точную навеску 0,5 г (при модуле экстракции 1:200) и 5,0 г (при модуле экстракции 1:10), измельченную до размера частиц 1 и 5 мм, помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 90 мл 70% спирта этилового. Колбу соединяли с обратным холодильником. Содержимое нагревали на водяной бане в течение 30 минут. Затем колбу охлаждали в прохладном месте до комнатной температуры. Содержимое колбы фильтровали через двойной беззольный фильтр (ФБ-I по ГОСТ 12026-76) в мерный цилиндр вместимостью 100 мл. Объем фильтрата доводили 96% спиртом этиловым до метки. При трехкратной экстракции количество экстрагента делили на три равные части по 30 мл соответственно и эксперимент проводили выше изложенным способом. Далее 5 мл полученного спиртового извлечения из травы девясила британского помещали в мерный цилиндр на 25 мл, добавляли 2 капли кислоты хлористоводородной разведенной и 5 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида безводного. Объем раствора доводили 96% спиртом этиловым до метки. Полученный раствор ставили на 45 минут в защищенное от света место для протекания реакции комплексообразования.
Для приготовления раствора сравнения в мерный цилиндр на 25 мл помещали 5 мл полученного спиртового извлечения, прибавляли 2 капли кислоты хлористоводородной разведенной и доводили 96% спиртом этиловым до метки [10].
Определение процентного содержания суммы флавоноидов проводили в пересчете на тот флавоноид, к спектральным характеристикам которого был близок максимум поглощения полученного спиртового извлечения. У спиртовых извлечений из исследуемых образцов при модуле экстракции 1:200 максимум поглощения после взаимодействия с 1% спиртовым раствором алюминия хлорида в присутствии разбавленной кислоты хлористоводородной находился в области длин волн 408-420 нм, то есть близко к спектральным характеристикам рутина (максимум поглощения ГСО рутина 412 нм), поэтому при пересчете содержания сумы флавоноидов
Л1°%
использовали его удельный показатель поглощения ( ш = 191, при длине волны 410 нм) [5]. При модуле экстракции 1:10 максимум поглощения после взаимодействия с 1% спиртовым раствором алюминия хлорида в присутствии разбавленной кислоты хлористоводородной отмечался сдвиг в длинноволновую область 430-435 нм, что соответствует спектральным характеристикам кверцетина (максимум поглощения ГСО кверцетина 435 нм), поэтому удельный показатель
Л1°%
поглощения раствора ГСО кверцетина с алюминия хлоридом ( ш = 778, при длине волны 430 нм) соответственно.
Концентрации флавоноидов и содержание экстрактивных веществ в извлечениях, полученных при различных значениях условиях экстракции заносились в матрицу планирования эксперимента (табл. 1).
На основе полученных значений были составлены уравнения регрессии, в которых коэффициенты (Bi) отражают степень влияния каждого фактора на выход экстрактивных веществ и флавоноидов. Уравнения регрессии подвергались анализу на статистическую значимость и адекватность реальному процессу [1].
На следующем этапе исследования осуществляли определение значений факторов, обеспечивающих максимальный выход флавоноидов и экстрактивных веществ, путем крутого восхождения. По полученному уравнению регрессии была рассчитана серия мысленных опытов (табл. 2 и 3). Из всех полученных значений выбирались эксперименты, которые показывали максимальные значения параметров оптимизации, и подвергались эмпирической проверке [1].
Результаты и их обсуждение. Особое значение на извлечение действующих веществ из растительного материала оказывает степень его измельчения. Известно, что чем больше из-мельченность, тем полнее протекает диффузия, что обусловлено увеличением поверхности соприкосновения фаз [12]. В результате проведенных нами экспериментов установлено, что максимальный выход флавоноидов отмечался при при измельчении сырья до размеров частиц в пределах 1 мм (табл. 1), которое для получения спиртовых извлечений из травы девясила британского предложено считать оптимальным.
Изучение влияния на качество извлечений соотношения сырья и экстрагента показало, что с уменьшением модуля экстракции увеличивается максимальный выход как всей суммы веществ, так и действующей группы БАС (флавоноидов), с которой в большей мере связывают действие сырья девясила британского, наблюдался при соотношении 1:200 (табл. 1). Поэтому данный модуль экстракции был выбран нами как оптимальный.
Было выявлено, что с увеличением времени настаивания выход экстрактивных веществ и флавоноидов уменьшается (табл. 1). В тоже время выход флавоноидов при времени настаивания 15 мин (содержание флавоноидов (в пересчете на рутин) составило 1,64 ±0,02%) был незначительно меньше по сравнению с настаиванием в течение 90 минут (содержание флавоноидов (в пересчете на рутин) составило 1,83±0,3%). Поскольку длительная экстракция приводит к загрязнению вытяжек сопутствующими веществами, снижающими скорость диффузии основной группы веществ [2], а одним из требований к процессу экстрагирования при масштабировании является экономическая рентабельность, то предпочтение было отдано последней комбинации как технологически и экономически более целесообразной. Поэтому, оптимальное время настаивания для травы девясила британского составляет не более 15 минут.
Таблица 1
Матрица планирования и результаты определения выхода экстрактивных веществ
травы девясила британского
№ п/ п Хі из-мельчен-ность Х2 модуль экс- трак- ции хз время настаи- вания х4 крат- ность Х о Выход экстрактивных веществ, % Выход флавоноидов, %
У1 У2 У3 уср У1 У2 У3 Уср
1 1 1 -1 -1 + 17,29 00 21,370 0 00 о 26 21,17 33 0,15 24 0,14 74 0,14 85 0,14 94
2 -1 -1 -1 -1 + 26,1 637 26,163 7 26,16 37 26,1 637 1,62 39 1,55 06 1,54 19 1,57 21
3 1 -1 -1 1 + 26,1 637 26,163 7 26,16 37 26,1 637 1,62 42 1,63 98 1,64 63 1,63 68
4 -1 1 -1 1 + 23,5 474 7 4 3, 2 23,54 74 23,5 474 0,16 27 0,16 23 0,16 16 0,16 22
5 1 1 1 1 + 22,2 392 22,675 2 22,45 28 ,4 7 25 0,14 55 0,14 64 0,14 58 0,14 59
6 -1 -1 1 1 + 26,1 637 26,163 7 26,16 37 26,1 637 1,96 34 1,66 66 1,86 39 1,83 13
7 1 -1 1 -1 + 17,44 25 21,803 100 18,45 89 ,2 8 13 1,20 21 1,38 64 1,26 91 1,28 59
8 -1 1 1 -1 + 22,6 752 21,798 4 21,96 58 22,1 465 0,00 00 0,00 00 0,00 00 0,00 00
Коэффициенты регрессии
В10 В11 В12 В13 В14
23,3811 -1,124208333 -1,050375 -0,880925 1,201525
В11 А.11 2 ю В13 А13 В14 Х14
-2,2484 -0,0551 -33,0347 1,2015
В20 В21 В22 В23 В24
0,8480 -0,043458333 -0,733566667 -0,032183333 0,0960917
ю 2 л а 2 СО В23 А23 В24 А24
-0,0869 -0,0385 -1,2069 0,0961
Таблица 2
Расчет и реализация крутого восхождения
№ опыта xi измельченность Х2 ЛРС: экстрагент х3 время настаивания х4 кратность Выход экстракт. в-в, %
натур.з нач. кодов. знач. натур.з нач. кодов. знач. натур.з нач. кодов. знач. натур. знач. кодов. знач.
Мысленные опыты
1 1 -1,0000 0,005 -0,8095 15 -1,0000 3 1,0000 27,4381
2 1 -1,0000 0,010 -0,7143 15 -1,0000 3 1,0000 27,3380
3 1 -1,0000 0,005 -0,8095 30 -0,6000 3 1,0000 27,0857
4 1 -1,0000 0,005 -0,8095 45 -0,2000 3 1,0000 26,7333
5 1 -1,0000 0,005 -0,8095 90 1,0000 3 1,0000 25,6762
Реализованные опыты
1 1 -1,0000 0,005 -0,8095 15 -1,0000 3 1,0000 26,1637
2 1 -1,0000 0,010 -0,7143 15 -1,0000 3 1,0000 26,1637
3 1 -1,0000 0,005 -0,8095 30 -0,6000 3 1,0000 26,1637
4 1 -1,0000 0,005 -0,8095 45 -0,2000 3 1,0000 26,1637
5 1 -1,0000 0,005 -0,8095 90 1,0000 3 1,0000 26,1637
Таблица 3
Расчет и реализация крутого восхождения
№ опыта Х1 измельченность Х2 ЛРС: экстрагент х3 время настаивания х4 кратность Выход флавоно-идов, %
натур.з нач. кодов. знач. натур.з нач. кодов. знач. натур.з нач. кодов. знач. натур.з нач. кодов. знач.
Мысленные опыты
1 1 -1,0000 0,005 -0,8095 15 -1,0000 1 -1,0000 1,4213
2 1 -1,0000 0,005 -0,8095 15 -1,0000 3 1,0000 1,6135
3 1 -1,0000 0,005 -0,8095 30 -0,6000 3 1,0000 1,6006
4 1 -1,0000 0,010 -0,7143 15 -1,0000 3 1,0000 1,5437
5 3 0,0000 0,005 -0,8095 15 -1,0000 3 1,0000 1,5701
Реализованные опыты
1 1 -1,0000 0,005 -0,8095 15 -1,0000 1 -1,0000 1,3131
2 1 -1,0000 0,005 -0,8095 15 -1,0000 3 1,0000 1,6391
3 1 -1,0000 0,005 -0,8095 30 -0,6000 3 1,0000 1,406
4 1 -1,0000 0,010 -0,7143 15 -1,0000 3 1,0000 1,2525
5 3 0,0000 0,005 -0,8095 15 -1,0000 3 1,0000 1.2764
Экспериментальные данные свидетельствуют, что однократная экстракция не позволяет полностью истощить сырье и отличается более низким выходом флавоноидов и экстрактивных веществ по сравнению с трехкратной (табл. 1), которая обеспечивает максимальное значение обоих параметров оптимизации. Таким образом, представляется целесообразным использование трехкратной экстракции.
Наиболее значимое влияние на выход флавоноидов травы девясила британского оказывает время настаивания, в меньшей степени на процесс экстрагирования влияют - кратность
экстракции и степень измельчения сырья, и незначительное влияние - модуль экстракции (В23 А.23> В24 А.24> В21 Л21 >В 22 Х22).
В результате реализации мысленных опытов показано, что максимальный выход фла-воноидов при экстрагировании травы девясила британского наблюдается при комбинации факторов:
- степень измельчения 1 мм;
- модуль экстракции 1:200;
- время настаивания 15 минут;
- трехкратная экстракция.
Выводы. В результате исследований установлено, что ведущим фактором, влияющим как на выход экстрактивных веществ, так и на выход флавоноидов является время настаивания. В меньшей степени оказывают влияние степень измельчения сырья и кратность экстракции, незначительно влияет модуль экстракции.
Таким образом, подобраны оптимальные условия извлечения флавоноидов из сырья девясила британского с применением в качестве экстрагента спирта этилового 70%: степень измельчения 1 мм; соотношение сырьё - экстрагент 1:200, трёхкратная экстракция по 15 минут, которые положены в основу разработки технологической схемы получения сухого экстракта из травы девясила британского.
Литература
1. Адлер Ю.П. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий / Ю.П. Адлер, Е.В. Маркова, Ю.В. Грановский - изд. второе, перераб. и доп. - М.: Наука, 1976. - 280 с.
2. Беликов В. Г.Фармацевтическая химия. В 2 ч: Учеб. пособие / В.Г. Беликов - 4 изд., перераб. и доп., М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 624 с.
3. Блинова О.А. Теоретические и экспериментальные аспекты создания лекарственных средств на основе сырья природного происхождения: автореф. дис. д-ра. фарм. наук: 15.00.01 /О.А. Блинова. -Пермь, 2009. - 44 с.
4. Бубенчиков Р.А. Фармакогностическое изучение растений рода фиалка и спектр их фармакологической активности: автореф. дис. д-р. фарм. наук: 14.04.02/ Р.А. Бубенчиков. - Пятигорск, 2011. - 48 с.
5. Буланкин Д.Г. Исследование по стандартизации и разработке лекарственных средств на основе листьев гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L.): автореф. дис. ...канд. фарм. наук: 14.04.02/ Д.Г. Буланкин.
- Самара, 2011. - 23 с.
6. Высочина Г.И. Флавоноиды Мари белой (Chenopodium album L.), произрастающей в Сибири / Г.И. Высочина, Т.М. Шалдаева, О.В. Коцупий, Е.П. Храмова // Химия растительного сырья. - 2009. - № 4.
- С. 107-112.
7. Государственная фармакопея СССР: Общие методы анализа / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М. Медицина, 1987. - Вып. 1. - С. 336.
8. Евдокимова О.В. Разработка и валидация методики количественного определения суммы фла-воноидов в траве тысячелистника / О.В. Евдокимова // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация, 2007. - №2. - С. 155-160.
9. Лесовая Ж.С. Разработка методики количественного определения флавоноидов в траве манжетки обыкновенной/ Ж.С. Лесовая, Д.И. Писарев, О.О. Новиков, Т.А. Романова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина и фармация. - 2010. - № 12/2. -С. 145-149.
10. Лесовая Ж.С. Разработка методики стандартизации травы репешка обыкновенного по флаво-ноидам/ Ж.С. Лесовая, Д.И. Писарев, О.О. Новиков//Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина и фармация. - 2010. -№ 12/2. С. 150-154.
11. Мелентьева А.Н. Технология и фармакологические эффекты экстракта солянки холмовой (лохеина - Н): автореф. дис. канд. фарм. наук: 15.00.02, 14.00.25 / А.Н. Мелентьева. - Тюмень, 2007. -23 с.
12. Минина С.А. Химия и технология фитопрепаратов: учебное пособие для вузов / С.А. Минина, И.Е. Каухова - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004 - 548 с.
13. Митрофанова И.Ю. Исследование по выбору оптимального экстрагента для извлечения биологически активных веществ травы девясила британского / И.Ю. Митрофанова, Д.М. Талалай//Открытая научно-практическая конференция молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (70; Волгоград; 2012): Материалы. - Волгоград, 2012. - С. 515-516.
14. Митрофанова И.Ю. Фитохимический анализ сырья девясила британского, произрастающего в Волгоградской области / И.Ю. Митрофанова // IV Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения 2011» (Санкт-Петербург; 2011 г): Материалы. - СПб, 2011. - С. 369.
15. Онегин С.В. Фармакогностическое изучение вереска обыкновенного (Calluna vulgaris (I.) Hull.): автореф. дис. канд. фарм. наук. Пермь, 2008.
16. Правдивцева O.E. Новые подходы к созданию и стандартизации лекарственных средств на основе видов рода Hypericum L.: автореф. дис. ...д-ра. фарм. наук: l4.04.02 / O.E. Правдивцева. - Самара -2011. - 50 с.
17. Пупыкина К.А. Исследования по разработке и стандартизации лекарственных растительных средств для профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения: автореф. дис. . д-ра. фарм. наук: l5.00.02 / К.А. Пупыкина. - Москва, 2008. - 5l с.
18. Чуешов В.И. Промышленная технология лекарств: учебник в 2-х т. Том 2 / В.И. Чуешов, М.Ю. Чернов, Л.М. Хохлова и др.; под ред. проф. В.И. Чуешова.- Х: МТК-Книга; Издательство НФАУ, 2002. - 7l6 с.
19. Шарова O.B. Флавоноиды цветков календулы лекарственной / O.B. Шарова, В.А. Куркин // Химия растительного сырья. - 2007. - №l. - с. 65-бВ.
20. Zhao Y.M. Chemical constituents of plants from the genus Inula. / Y.M. Zhao, M.L. Zhang, Q.W. Shi, H. Kiyota // J. Chem. Biod. 200б. - № 3. - р. 37і-зВ4.
THE DIFFERENT TECHNOLOGICAL FACTORS’ INFLUENCE ON THE EXTRACTION EFFICIENCY OF THE FLAVONOIDS FROM INULA BRITANNICA HERB
Volgograd State Medical University
I.YU. MITROFANOVA A.V. YANITSKAYA V.V. GUKASOVA
The article presents the research results of the different technological factors effects on the extraction efficiency of on flavonoids from Inula britannica herb, growing in the Volgograd region. As a result the optimal extraction conditions were chosen. They included 70% ethyl alcohol, fineness factor 1 mm; plant raw materials to extracting medium ratio 1:200, three stage extraction during 15 minutes. So, it was developed the technology of raw materials extraction, providing the maximum output of this fraction of biologically active compounds (1,64 % ± 0,009 % (in ruti terms) from Inula britannica herb.
e-mail: [email protected]
Кєу words: Inula britannica L., flavonoids, eXtraction.
