CC BY
29
ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ТЕСКАЛЦИНА НА ОСТЕОГЕННУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ МУЛьТИПОТЕНТНЫХ
мезенхимальных стромальных клеток человека
В.В. Соловьева 1, К.Г. Колобынина1, М.О. Гомзикова1, Л.Г. Тазетдинова1, М.Н. Журавлева1, В.З. Слепак2, А.А. Ризванов 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Медицинская школа Миллера при Университете Майами, Майами, США
Effect of tescalcin overexpression on osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
V.V. Solovyeva 1, K.G. Kolobynina 1, M.O. Gomzikova 1, L.G. Tazetdinova 1, M.N. Zhuravleva 1, VZ. Slepak 2, A.A. Rizvanov1
1 Kazan (Volga region) Federal University, Russia, Kazan
2 University of Miami Miller School of Medicine, Miami, USA
Тескалцин играет важную роль в пролиферации и диф-ференцировке некоторых видов клеток . Было показано участие тескалцина в сигнальных путях митоген-активиру-емой протеинкиназы, а также его взаимодействие с субъединицей 4 сигналосомы СОР9 и белком 1МНЕ1. Поскольку тескалцин является одним из факторов, позволяющих из клеток-предшественниц одного вида получить в процессе дифференцировки различные специализированные виды клеток, это определяет интерес к его возможному использованию в генно-клеточной терапии для модуляции фенотипа клеток-мишеней . Мультипотентные мезенхи-мальные стромальные клетки из жировой ткани (ММСК-ЖТ) являются перспективным клеточным материалом для регенеративной медицины в связи со способностью к диф-ференцировке в остеогенном направлении . В нашей работе показано, что в культуре ММСК-ЖТ со сверхэкспрессией тескалцина наблюдалась значительно большая минерализация матрикса по сравнению с контрольными культурами Это может свидетельствовать о том, что эктопическая сверхэкспрессия тескалцина может влиять на процесс остеогенной дифференцировки ММСК-ЖТ .
Ключевые слова: тескалцин, мультипотентные ме-зенхимальные стромальные клетки, остеогенез, имму-нофенотип, рекомбинантные лентивирусы, остеогенная дифференцировка
Tescalcin plays an important role in the proliferation and differentiation of certain cell types . It is involved in the signaling pathways of mitogen-activated protein kinase and is reported to directly interact with subunit 4 of COP9 signalosome and Na/H exchanger NHE1. Since tescalcin is one of the factors that allow one type of progenitor cells differentiate into a variety of specialized cell types, it can be a potential molecular tool for modulation of phenotype of target cells The ability of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) to differentiate into osteogenic direction makes them a promising adult stem cell type for regenerative medicine and tissue engineering Here we show that ADSCs with tescalcin overexpression had a significantly higher level of matrix mineralization compared with control ADSCs This finding indicates that ectopic tescalcin overexpression might affect osteogenic differentiation of ADSCs
Keywords: tescalcin, mesenchymal stem cells, osteogenesis, immunophenotype, recombinant lentiviruses, osteogenic differentiation .
Введение
Тескалцин (гомологичный кальцинейрину В белок 3, Calcineurin B homologous protein 3, CHP3) принадлежит семейству EF-hand Са2+/Мд2+-связывающих белков, подсемейству кальцинейрина B, и представляет собой белок с молекулярной массой 24 кДа [1]. Тескалцин гомологичен трем Са2+-связывающим белкам: гомологичный кальцинейрину белок 1 (CHP1), гомологичный кальцинейрину белок 2 (CHP2) и кальцинейрин B (CnB), а также высококонсервативен у многих позвоночных организмов [2]. Исследования in vitro на клетках К562 показали, что сверхэкспрессия тескалцина вызывает фенотипические изменения, характерные для дифференцировки этих клеток по мегакариоцитарному пути Соответственно, нокдаун тескалцина путем РНК-интерференции значительно замедлял процесс дифференцировки Это позволило предположить, что тескалцин может непосредственно участвовать в регуляции экспрессии генов [3]
Описано взаимодействие тескалцина с субъединицей 4 сигналосомы COP9 [4], интегральным
e-mail: Albert . Rizvanov@kpfu . ru
белком NHE1 (англ . Na+/H+ exchanger 1) [5-6] и его участие в сигнальных путях митоген-активируе-мой протеинкиназы (англ Mitogen-activated protein kinase, МАРК) [3, 7]. Посредством взаимодействия с NHE1, тескалцин может оказывать влияние на важнейшие физиологические функции в организме: стабилизацию pH внутри клетки, активацию NHE1 в ответ на злокачественное перерождение клетки, обеспечение необходимого количества H+ в тканях сердца [8].
Каскады МАРК регулируют ряд ключевых внутриклеточных сигнальных событий, включая пролиферацию, дифференцировку, выживание и апоптоз клеток . Было показано, что тескалцин контролирует экспрессию факторов транскрипции семейства Ets через РМА-индуцированный сигнальный путь экстраклеточно-регулируемой протеинкиназы (англ . Extracellular signal-regulated kinase, ERK) [3, 4]. Путь ERK является одним из пяти каскадов МАРК, идентифицированных у млекопитающих . Этот путь регулирует пролиферацию и дифференцировку остеобластов и мультипотентных мезенхимальных стромальных
клеток (ММСК) в процессе остеогенной дифферен-цировки по Ras-зависимому пути передачи сигнала [9]. Одним из ключевых факторов транскрипции, контролирующих остеогенную дифференцировку клеток, является Ets1, который активирует экспрессию щелочной фосфатазы и остеопонтина, а также позитивно регулирует PthRI, который играет важную роль в контроле внутриклеточного уровня кальция остеобластов .
Жировая ткань является богатым источником ММСК [10]. Отдельный интерес представляет остеогенный потенциал ММСк из жировой ткани (ММСК-ЖТ), так как именно дифференцировка в остеобласты находит применение в регенеративной медицине и тканевой инженерии [11, 12].
Целью данной работы явилось исследование влияния сверхэкспрессии или подавления экспрессии тескалцина на пролиферацию и способность к осте-огенной дифференцировке ММСк, выделенных из жировой ткани человека
Материал и методы
Получение рекомбинантных лентивирусов
Для получения рекомбинантных лентивирусов использовали следующие плазмиды: pMD2-VSV-G (оболочечная), pCMV-dR8 . 74 (упаковочная) и векторные pLenti-Tescalcin-GFP (кодирует кДНК гена те-скалцина человека и гена gfp), pLenti-GFP (кодирует кДНК гена gfp), pLenti-Tescalcin-Knock_Down-GFP (кодирует киРНК к мРНК гена тескалцина человека и ген gfp). Для получения рекомбинантных лентивирусов проводили ко-трансфекцию с использованием кальций-фосфатного метода тремя плазмидами (оболочечная, упаковочная и векторная) пакующей линии клеток HEK293T (ATCC, CRL-11268) согласно стандартному протоколу, описанному ранее [13].
Выделение и культивирование ММСК
из жировой ткани человека
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК-ЖТ) были выделены по ранее описанному протоколу с оригинальными изменениями [14, 15]. Образцы подкожной жировой клетчатки были получены в ходе плановой косметической операции (липосакции). В стерильных условиях ламинарного бокса проводили отмывку липоаспирата от крови Полученный гомогенный липоаспират ферментировали 0,2% раствором коллагеназы краба (159 ПЕ/мг, Биолот, Россия) . ММСК культивировали в среде aMEM (ПанЭко, Россия), к которой было добавлено 10% сыворотки крови плодов коровы (Invitrogen, США), 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия), смесь антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Био-лот, Россия) при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2 . Через 24 ч . проводили замену питательной среды . После 5—7 дней инкубации констатировали формирование монослоя из клеток Последующее пассирование и замену питательной среды проводили согласно стандартным протоколам Морфологию клеток оценивали с помощью инвертированного микроскопа AxyObserver . Z1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием программного обеспечения AxyoVision Rel . 4 . 8 .
Генетическая модификация ММСК
ММСК-ЖТ культивировали в 6-луночном культу-ральном планшете до полуконфлюэнтной плотности .
Клетки инфицировали рекомбинантными лентиви-русами с множественностью инфекции (MOI) 10 . Сортировку генетически модифицированных ММСК-ЖТ проводили по флуоресценции репортерного белка GFP с использованием прибора FACSAria (BD Biosciences, США) .
Оценка жизнеспособности ММСК
ММСК-ЖТ высевали в количестве 5х103 кл/ лунку 96-луночночного планшета и культивировали при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 . Жизнеспособность клеток через 48 ч . культивирования определяли с помощью реагента CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, США) на микропланшетном ридере Infinite M200Pro (Tecan) . Оптическую плотность в лунках измеряли в двухволновом режиме: основной фильтр — 490 нм, референс-фильтр — 700 нм . Эксперимент повторяли троекратно; для статистического анализа использовали метод t-критерия Стьюдента .
Определение иммунофенотипа ММСК
Экспрессию поверхностных антигенов ММСК-ЖТ оценивали методом проточной цитофлуориметрии . Клетки трипсинизировали и инкубировали в фос-фатно-солевом буфере в течение 45 мин с антителами к CD90 (PE-Cy5) (#328112, BioLegend), CD44 (PE), CD73 (APC), и негативным коктейлем (PE) (BD Stemflow™ Human MSC Analysis Kit, BD Biosciences, США) . Негативный коктейль включал антитела к CD34, CD11b, CD19, CD45, HLA-DR. Анализ клеток проводили на проточном цитометре Guava easyCyte 8HT (Millipore, США) согласно инструкциям производителя
Остеогенная дифференцировка ММСК
Для оценки влияния генетической модификации на процесс дифференцировки клеток в остеогенном направлении ММСК-ЖТ культивировали на полной среде аМЕМ в 24-луночном культуральном планшете до плотности клеточного монослоя 100%, после чего использовали среду для остеогенной диффе-ренцировки StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco, США) Клетки поддерживали на среде для дифференцировки в течение 18 сут . , меняя питательную среду раз в три дня . В качестве отрицательного контроля использовали ММСК-ЖТ, культивируемые на полной среде аМЕМ . Для определения минерализации, являющейся признаком остеогенной диф-ференцировки, ММСК-ЖТ окрашивали по von Kossa . Маркером остеогенной дифференцировки являлась продукция кальций-содержащего матрикса, окрашиваемого нитратом серебра в черный цвет . Результаты анализировали на инвертированном микроскопе AxyObserver . Z1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием программного обеспечения AxyoVision Rel . 4 . 8 .
Результаты и обсуждение
ММСК, выделенные из жировой ткани человека характеризуются фибробластоподобной морфологией . Иммуноцитофлуориметрический анализ показал, что большинство выделенных ММСК-ЖТ экс-прессируют поверхностные антигены (CD-маркеры), характерные для ММСК человека: CD90, CD44, CD73 (рис . 1А—В). В то же время ММСК-ЖТ не экс-прессировали антигены CD34, CD11b, CD19, CD45, HLA-DR (негативный коктейль) (рис . 1Г) .
А
Б
И1 10! ID1 Id4 10s 1 if 101 10г 101 Iff* 10s
CD73APC Негативный коктейль РЕ
Рис. 1. Иммуноцитофлуориметрическая характеристика поверхностных антигенов (CD-маркеров) ММСК-ЖТ: зеленая диаграмма — нативные ММСК-ЖТ (контроль фоновой флуоресценции); красная диаграмма — ММСК-ЖТ, позитивные по А — CD90 (95,25% позитивных клеток); Б — CD44 (99,44% позитивных клеток); В — CD73 (97,15% позитивных клеток); Г — негативный коктейль: CD34, CD11b, CD19, CD45, HLA-DR (0,36% позитивных клеток)
Рис. 2. Жизнеспособность нативных (контроль) и генетически модифицированных МСК-ЖТ (Ц^^Р, LV-Tescalcin-GFP, LV-Tescalcin Knock_Down-GFP); результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (п = 3)
ММСК-ЖТ были модифицированы рекомби-нантными лентивирусами LV-GFP, LV-Tescalcin-GFP, LV-Tescalcin-Knock_Down-GFP . Генетически модифицированные ММСК-ЖТ были отобраны путем сортировки с использованием прибора FACSAria (BD Biosciences) по флуоресценции репортерного белка GFP
С помощью MTS-теста была проведена оценка жизнеспособности генетически модифицированных и нативных ММСК-ЖТ . Жизнеспособность нативных ММСК-ЖТ была принята за 100% . Жизнеспособность клеток после генетической модификации снижалась в среднем на 15% и составила: для ММСК-ЖТ, трансдуцированных LV-GFP, - 85,6%, LV-Tescalcin-GFP - 84,8%, LV-Tescalcin-Knock_Down-GFP — 86,5% (рис . 2). Основываясь на полученных данных можно сделать вывод, что генетическая модификация не оказывает существенного влияния на жизнеспособность ММСК-ЖТ .
В обычных условиях ММСК-ЖТ не экспрессиру-ют тескалцин, его экспрессия показана лишь в некоторых опухолевых культурах клеток (HeLa, HL-60), а также в тканях сердца, слюнных и половых железах [16]. Однако эктопическая экспрессия тескалцина ММСК-ЖТ может оказывать влияние на различные сигнальные системы клетки
При культивировании нативных и генетически модифицированных ММСК-ЖТ в среде для осте-огенной дифференцировки наблюдали изменение формы клеток с веретеновидной на кубоидальную и полигональную, свойственную остеобластам
Реакция von Kossa выявила наличие минеральных депозитов в культурах ММСК-ЖТ, подвергнутых остеогенной дифференцировке, в то время как в культурах, инкубировавшихся в контрольной среде, таковых не наблюдалось (рис . 3) . В культуре ММСК-ЖТ со сверхэкспрессией тескалцина наблюдалась значительно большая минерализация матрик-са, по сравнению с другими культурами ММСК-ЖТ . Этот результат может свидетельствовать о том, что сверхэкспрессия тескалцина усиливает процесс остеогенной дифференцировки ММСК-ЖТ .
Для изменения фенотипа клетка должна пройти пролиферативные и дифференцировочные изменения Одним из основных сигнальных путей, принимающих участие в регуляции пролиферации и дифференцировки мезенхимных стволовых клеток, является путь митоген-активируемой протеинки-назы (MAPK). Также показано, что активация MAPK способствует дифференцировке других типов клеток, таких как нервные клетки, адипоциты, Т-клетки и клетки мышечной ткани [17].
Контроль
LV-GFP
LV-Tescalcin Knock_ Down-GFP
LV-Tescalcin-GFP
« . : J Hf
д ■ ■ • щ Е 1ЙШ ■ ж Щ [ у. '-'а • '"ЩШ ' * l-^JP 1 №
Рис. 3.
ММСК-ЖТ после индукции остеогенной дифференцировки в течение 18 сут.: А-Г - ММСК-ЖТ, культивируемые в остеогенной среде; Д-З - ММСК-ЖТ, культивируемые в среде аМЕМ.
Цитохимическая реакция. Масштабный отрезок -200 мкм
оригинальные исследования
93
Известно, что тескалцин участвует в сигнальных путях MAPK . Таким образом, эктопическая экспрессия тескалцина может быть использована для модуляции процесса дифференцировки клеток .
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №15-44-02509. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии,
выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки России (Ю RFMEFI59414X0003) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Perera E . М ., Martin H ., Seeherunvong T . et al . Tescalcin, a novel gene encoding a putative EF-hand Ca(2+)-binding protein, Col9a3, and renin are expressed in the mouse testis during the early stages of gonadal differentiation . Endocrinology 2001; 142(1): 455-63 .
2 . Perera E . M ., Bao Y ., Kos L . et al . Structural and functional characterization of the mouse tescalcin promoter . Gene 2010; 464(1-2): 50-62 .
3 . Levay K ., Slepak V . Z . Tescalcin is an essential factor in megakaryocyte differentiation associated with Ets family gene expression . J . Clin . Invest . 2007; 117(9): 2672-83 .
4 . Levay K ., Slepak V . Z . Regulation of Cop9 signalosome activity by the EF-hand Ca2+-binding protein tescalcin . J . Cell . Sci . 2014; 127(Pt 11): 2448-59
5 . Mailänder J ., Müller-Esterl W ., Dedio J . Human homolog of mouse tescalcin associates with Na(+)/H(+) exchanger type-1. FEBS Lett . 2001; 507(3): 331-5 .
6 . Li X ., Liu Y ., Kay C . M . et al . The Na+/H+ exchanger cytoplasmic tail: structure, function, and interactions with tescalcin . Biochem . 2003; 42(24): 7448-56
7 . Kato J .Y., Yoneda-Kato N . Mammalian COP9 signalosome . Genes Cells . 2009; 14(11): 1209-25 .
8 . Malo M . E ., Fliegel L. Physiological role and regulation of the Na+/H+ exchanger . Can . J . Physiol . Pharmacol . 2006; 84(11): 1081-195 .
9 . Xu C ., Zheng Z ., Fang L. et al . Phosphatidylserine enhances osteogenic differentiation in human mesenchymal stem cells via ERK signal pathways . Mater . Sci . Eng . C . Mater . Biol . Appl . 2013; 33(3): 1783-8 .
10 . Масгутов Р . Ф ., Богов А А ., Ризванов А .А . и др . Стволовые клетки из жировой ткани — биологические свойства и перспективы
клинического применения . Практическая медицина 2011; 7(55): 18-20 .
11. Масгутов Р . Ф ., Салихов Р . З ., Ризванов А .А . и др . Применение клеток стромальной васкулярной фракции жировой ткани при лечении полнослойного дефекта гиалинового хряща медиального мыщелка бедренной кости коленного сустава: клинический случай . Гены и клетки 2014; 9(3): 303-6 .
12 . Масгутов Р . Ф ., Салихов Р . З ., Плаксейчук Ю . А. и др . Применение клеток стромальной васкулярной фракции жировой ткани при ложном суставе бедренной кости: клинический случай . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; 8(3): 116-8 .
13 . Соловьева В . В ., Исаев А .А ., Генкин Д . Д . и др . Влияние рекомбинантного гистона Н1. 3 на эффективность лентивирусной трансдукции клеток человека in vitro . Клеточная трансплантология и тканевая инжененрия 2012; 7(3): 151-4 .
14 . Solovyeva V.V ., Salafutdinov I . I ., Tazetdinova L . G . et al . Genetic Modification of Adipose Derived Stem Cells with Recombinant Plasmid DNA pBud-VEGF-FGF2 Results in Increased of IL-8 and MCP-1 Secretion . J . pure and applied microbiol . 2014; 8(Spl . Edn . 2): 523-8
15 . Solovyeva V .V ., Salafutdinov I . I . , Martynova E .V . et al . Human adipose derived stem cells do not alter cytokine secretion in response to the genetic modification with pEGFP-N2 plasmid DNA . World Applied Sciences J . 2013; 26(7): 968-72 .
16 . Levay К ., Slepak V . Z . Up- or downregulation of tescalcin in HL-60 cells is associated with their differentiation to either granulocytic or macrophage-like lineage . Exp . Cell . Res . 2010; 316(7): 1254-62 .
17 Jaiswal R К , Jaiswa N , Bruder S P et al Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase J Biol Chem 2000; 275(13): 9645-52 .
Поступила: 21.09.2015
