CC BY
65
УДК 577.3
З.Х.-М. Хашасв, АФ. Кожокару, Т.З. Хашаев, Э.М.Шекшеев ВЛИЯНИЕ СУПЕРТОКСИКАНТОВ НА ОСВОБОЖДЕНИЕ КВАНТОВ МЕДИАТОРА ИЗ НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЙ
Настоящая работа посвящена поиску путей направленной модификации структурнофункционального состояния биологических мембран с целью повышения общей устойчивости клеточных систем и организма в целом к внешним воздействиям промышленных отходов. На основе общих биофизических подходов к проблеме исследуются модификации мембранных систем под воздействием мембранотропных соединений из различных классов токсических веществ, выбрасываемых в окружающую среду в связи с индустриальным возрастанием жизнедеятельности человека. Актуальность и практическое значение наших исследований связано в первую очередь с тем, что непрерывное увеличение нагрузки на окружающую среду, без учета воздействия на биосферу, может вызвать опасность экологической катастрофы. Только в США с 1971 по 1996 г.г. произошло свыше двухсот тысяч промышленных аварий, связанных с химическими веществами, унесших тысячи жизней, а десятки тысяч человек получили интоксикации различных степеней. Крупнейшие катастрофы произошли в 1976 г. в г.Севезо (Италия) и в г.Бхопале (Индия) в 1984 г. Так, катастрофа в небольшом городке Севезо на севере Италии, в 30 км от миллионного Милана, произошел взрыв на химическом заводе фирмы “Икмеза”, о продукции которого большинство работающих только знало, что здесь делают “сырье для выпуска дезодорантов”. Вырвавшееся при взрыве облако дыма покрыло окрестности предприятия “белой вуалью” одним из страшных ядов 2,3, 7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин (ТХДД). ТХДД примерно в 70 тысяч раз ядовитее цианистого калия и в 500 раз - стрихнина. Катастрофа в Индии была самой гигантской - более 3000 погибших, 20 000 ослепших, 200 000 пострадавших. Ядовитое облако висело над густонаселенным районом площадью 65 км2 (1).
Но и Россию не обходят стороной подобные катастрофы. Так, на 1997 г. в 86 городах уровень загрязнения воздуха превышает предельно допустимые нормы в 10 и более раз. Сенсацией мирового масштаба стало известие (1991 г.) о наличии в питьевой воде миллионной Уфы от 23 до 53 тысяч предельно допустимых концентраций (ПДК) диоксинов (2). По данным “Мединформа” на территории России разбросано более 100 крупных предприятий, имеющих диоксиногенные технологии (3).
Исходя из вышесказанного, в современных условиях важное значение приобретает проведение комплекса защитно-охранительных мероприятий от вредного воздействия диоксинов и диоксиноподобных токсикантов.
Однако, для более полного представления о механизме действия исследуемых веществ, недостаточно экспериментальное проведение непосредственно на биологических мембранах ввиду невозможности разделения эффектов взаимосвязанных факторов, определяющих взаимодействие, и во-вторых, отсутствие методов прямого изучения взаимодействия клеточных мембран в процессах секреции медиаторов, адгезии клеточных структур, транспорта токсических препаратов и ионов через слой клеток. Эти затруднения можно преодолеть методом моделирования взаимодействия клеточных мембран с помощью искусственных бислойных липидных мембран (БЛМ), с их обширным диапазоном вариаций состава, структуры и внешней среды.
Цель работы заключалась в поисках мер защиты человека от влияния загрязняющих окружающую среду токсикантов, путем комплексного изучения молекулярного механизма действия некоторых диоксиноподобных токсикантов (ДПТ) на биологические и модельные мембраны.
В соответствии с целью в данной работе определены и задачи исследований:
изучить освобождение медиатора из нервных окончаний скелетной мускулатуры холоднокровных и теплокровных животных в присутствии фенольных соединений и ДПТ.
Методика
Опыты по изучению механизма освобождения квантов медиатора из нервных окончаний проводились на нервно-мышечных препаратах кожной мышцы груди m.cutancuspectoris травяной лягушки Rana temporaria и диафрагмы белой крысы с помощью внутриклеточного отведения и регистрации спонтанных миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) по ранее описанной методике (4).
В данной работе приводятся только результаты тех опытов, в которых параметры МПКП (амплитуда в мВ и частота в имп/сек) измерялись до и после введения исследуемых веществ в раствор, омывающий нервно-мышечный препарат. Для получения статистически достоверных результатов определяли обычно среднее значение амплитуды для 100 МПКП, а при измерении частоты - время, за которое возникало 100 импульсов. Ошибка измерения была не выше 20%.
В опытах на изолированных нервно-мышечных препарат вышеназванных животных были использованы следующие токсиканты: карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон, 2,4-динитрофенол (ДНФ), 2,4-дихлорфенол (ДХФ), пентахлорфенол (ПХФ) и 2,4,5-трихлорфенол (ТХФ), относящиеся к разобщителям окислительного фосфорилирования (РОФ).
Результаты и обсуждение
Частота освобождения порций медиатора из нервных окончаний в нервно-мышечном синапсе зависит от присутствия ионов Са2+ в окружающем нервно-мышечный препарат растворе Рингера для холоднокровных животных или в растворе Рингера-Локка для теплокровных. У мышц, выдержанных длительное время в растворах без ионов Са2+, частота МПКП значительно понижается.
Согласно гипотезе Е.АЛимермана (5), частота МПКП зависит не от поляризации мембраны, а только от ее проницаемости для ионов Са2+ и от их концентрации внутри пресинаптических волокон. В тех условиях, где большое количество синаптических пузырьков находятся на расстоянии 10 А от мембраны должны возникать ван-дер-ваальсовы силы, которые стремятся свести пузырек с мембраной нервного окончания. Кроме ван-дер-ваальсовых сил существуют и силы отталкивания из-за наличия одноименных (отрицательных) зарядов на поверхности мембран синаптических пузырьков и мембран нервных окончаний. Увеличение концентрации ионов Са2+ приводит к экранизации поверхностного отрицательного заряда мембран и к увеличению секреции медиатора - ацетилхолина (АХ). Данная гипотеза дала объяснение и тому факту, который наблюдали Хаббард (6) и Катц (7), что вход ионов Са2+ в деполяризованное волокно, а не деполяризация дает резкое увеличение частоты МПКП, т.к. эти ионы повышают вероятность слияния синаптических пузырьков. Вскоре было показано, что деполяризация в среде без ионов кальция не приводит к увеличению частоты секреции АХ и синаптическая передача блокируется, хотя нервный импульс распространяется вдоль нервных окончаний. Прямой проверкой выдвинутой гипотезы было бы введение ионов Са2+ внутрь нервного окончания, однако осуществить внутриклеточную инъекцию ионов в нервно-мышечное соединение лягушки трудно из-за малых размеров нервных окончаний, имеющих диаметр менее одного микрона. Но кальций в нервных окончаниях всегда запасен внутри митохондрий (Мх) и в саркоплазме, где его держит электрическое поле (10-7М). Опыты, проведенные в нашей лаборатории (8) показали, что РОФ переносят протоны через БЛМ. Показано, что в результате переноса электронов от одних специфических белков к другим на мембране частиц появляется разность потенциалов положительно заряженные ионы двигались внутрь Мх, а отрицательные выбрасывались наружу. РОФ - переносчики протонов -снимали электрическое поле на мембране Мх. Таким вот оригинальным способом нам удалось ввести кальций внутрь нервного окончания, в результате чего резко повышалась частота
выделения квантов АХ (9). Таким образом, можно было ожидать и сильное увеличение параметров МПКП в присутствии исследуемых токсикантов.
Действительно, все исследованные токсиканты вызывали при введении в окружающую мышцу раствора Рингера резкое повышение частоты МПКП на 2 - 3 порядка. Потенциал покоя (ПП) при этом не изменялся. Эффективность действия исследованных токсикантов оказалась весьма различной. Удалось показать, что концентрация веществ, при которых наблюдалось одинаковое увеличение частоты МПКП, у разных токсикантов отличается на несколько порядков. По эффективности действия на освобождение квантов АХ из нервных окончаний исследованные токсиканты располагаются в следующий ряд: КХФ > ДНФ > ТХФ > ДХФ. Так, КХФ оказался более чем на два порядка эффективнее ДНФ и на три порядка эффективнее ДХФ и ТХФ.
Аналогичное действие на частоту МПКП, но при более высоких концентрациях, оказывает ДНФ. В его присутствии также резко повышается количество МПКП в единицу времени, намного превышающих число потенциалов в чистом растворе Рингера без примеси токсиканта.
Отмечено, что с момента смены раствора Рингера на раствор Рингера с токсикантом до повышения частоты МПКП происходит определенный “латентный” период, который длится от 5 до 15 минут. Чем больше концентрация токсиканта в растворе, тем скорее увеличивается частота МПКП. После достижения максимальной величины также более быстрое уменьшение частоты МПКП. Следует также отметить, что максимальная величина начальной частоты МПКП в растворах токсикантов зависела от начальной частоты в растворе Рингера; чем выше была начальная частота в растворе Рингера, тем большей она оказывалась в растворах токсикантов. Исходя из этого можно определить во сколько раз в среднем возрастает частота МПКП в растворах токсикантов, что и получило в выражение на приведенном графике зависимости частоты от концентрации и времени.
Если исходить из предположения о том, что увеличение частоты МПКП в присутствии РОФ происходит вследствие появления внутри нервного окончания больших количеств ионов Са2+, то этот эффект не должен зависеть от присутствия ионов кальция в наружном растворе. Наши ранние исследования влияния РОФ на частоту МПКП в бескальциевых растворах, у мышц, предварительно выдержанных в течение 30-90 мин. в растворе Рингера без ионов Са, показало, что эффект РОФ действительно не зависит от “наружных” ионов кальция. Относительное увеличение частоты МПКП в растворах, не содержащих ионов Са2+, оказывается даже более сильным по сравнению с кальциевыми растворами, по-видимому, из-за более низкого первоначального уровня частоты МПКП. “Латентный” период действия оказался в этом случае также более коротким.
На основании гипотезы о том, что ионы Са2+ вызывают слияние мембран, экранируя их поверхностный отрицательный заряд, можно было предположить, что резкое увеличение концентрации ионов Са2+ в протоплазме внутри нервного окончания в присутствии РОФ может не только увеличивать частоту слияния синаптических пузырьков с мембраной нервного окончания (что соответствует частоте появления МПКП), но может приводить и к склеиванию отдельных синаптических пузырьков друг с другом. При этом должны были бы увеличиваться и размеры выделяемых порций АХ.
Действительно, при изучении действия исследуемых токсикантов, как впрочем и большинства РОФ, мы заметили, что при увеличении частоты МПКП одновременно наблюдается заметный рост и их амплитуды (средняя величина), как в среде содержащих ионы Са2+, так и в бескальциевой среде. Увеличение амплитуды МПКП наблюдается уже в латентном периоде, а когда частота повышается более чем на порядок, их амплитуда увеличивается в 2-3 раза.
Максимум на кривых зависимости частоты МПКП от времени действия исследованных веществ определяется, по-видимому, количеством ионов Са2+, вышедших из Мх в протоплазму нервного окончания. Следующий за максимумом спад частоты МПКП может объясняться прежде всего уменьшением количества синаптических пузырьков, содержащих порции АХ. Именно с этим может быть связано резкое падение частоты МПКП в присутствии высоких
концентраций токсикантов, вызывающих первоначальное быстрое и очень сильное повышение частоты МПКП.
Постепенное падение частоты МПКП в присутствии токсикантов может, вероятно, в какой-то степени происходить вследствие поглощения выделившихся из Мх ионов Са2+ саркоплазматическим ретикулумом. По данным Карафоли (10) основная роль в поглощении кальция принадлежит митохондриям и гораздо меньшая - микросомам ретикулума. Однако, в присутствии ДНФ в концентрации, вызывающей разобщение окисления и фосфорилирования, количество Са2+ в Мх заметно падает, а количество Са2+, связанного с микросомами, напротив, несколько возрастает. Это может происходить как вследствие адсорбции, т.к. микросомальная кальциевая помпа мало чувствительна к действию РОФ.
Выводы
1. Изученные нами супертоксиканты, введенные в раствор, окружающий нервно-мышечный препарат, вызывают резкое временное повышение частоты МПКП (на 2-3 порядка).
2. По эффективности действия на частоту МПКП токсиканты располагаются в следующий ряд: КФХ>ДНФ>ТХФ>ДХФ.
3. В присутствии токсикантов, во время увеличения частоты МПКП, наблюдается возрастание средней амплитуды МПКП в 2-3 раза.
4. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что выход медиатора из нервных окончаний связан со слиянием синаптических пузырьков с мембраной нервного окончания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Хефлинг Г. //Тревога в 2000 году. М. Мысль. 1990.
2. Кудряшов С. //Не дышите диоксинами. М. Труд. № 41. С.2. 1997.
3. ’’Неделя”. № 13 С.29. 1997.
4. Хашаев З.Х-М. //Мат. ВИНИТИ. № 1147-84. М. 1984.
5. Либерман Е.А.Н Живая клетка. М., “Наука”, 1982.
6. Катц Б. Нерв, мышца, синапс. М., “Мир”, 1968.
7. Либерман Е.А., Топалы В.П. “Биофизика”, т.13, 6, 1025, 1968.
8. Глаголева И.М., Либерман Е.А., Хашаев З.Х.-М. “Биофизика”,т.15, 1, 76, 1970.
9. Карафоли Э., Пенистой Д.Т. Кальциевый сигнал. М., “Мир”, I, с.28, 1986.
