CC BY
8УДК 581.19:546
Б01: 10.21779/2542-0321-2017-32-1-75-80 Г.А. Абилова
Влияние сульфата и ацетата кадмия на некоторые физиологические процессы проростков тритикале (Triticosecale Шит.)
Дагестанский государственный университет; Россия, 367001, г. Махачкала, ул. М. Га-джиева, 43а; gulyaraabilova@mail.ru
Проведено исследование влияния солей кадмия на проростки тритикале (Triticosecale Wittm.) сорта ПРАГ-530. Для этого семена проращивали в чашках Петри при комнатной температуре и естественном освещении в течение 7 суток с периодическим поливом растворами сульфата и ацетата кадмия (концентрация соединений 10-4-10-3 М). Обе соли подавляли рост и накопление биомассы проростками тритикале. При концентрациях солей 5 10-4 и 5 10-3 М ин-гибирование роста в большей степени происходило под действием CdS04 по сравнению с С^СН3С00)2. Торможение роста рассматривается в качестве защитно-приспособительной реакции, в результате которой происходит снижение интенсивности клеточных делений и перестройка метаболизма.
Действие солей кадмия сопровождалось увеличением содержания в клетках проростков тритикале конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальде-гида (МДА). Характер изменения МДА соответствовал зависимости доза-эффект, когда по мере увеличения концентрации солей содержание МДА существенно увеличивалось. Выявленные изменения в интенсивности роста проростков и усилении интенсивности ПОЛ, по-видимому, явились результатом окислительного стресса и образованием активных форм кислорода (АФК). Оценку уровня антиоксидантных процессов осуществляли путем измерения активности фермента супероксиддисмутазы (СОД). При всех концентрациях солей кадмия активность СОД не отличалась от контрольных значений. Возможно, это связано с тем, что растения используют ферментативную составляющую антиоксидантной системы в первые часы действия стрессового фактора. На более поздних этапах адаптационного процесса, когда в результате работы фермента СОД накапливается пероксид водорода, являющийся ингибитором СОД, токсический эффект кадмия становится достаточным для подавления других антиоксидантных ферментов в листьях тритикале, происходит накопление АФК, которые усиливают ПОЛ мембранных систем. Устранение избыточных количеств АФК осуществляют также низкомолекулярные анти-оксиданты, в т. ч. и пролин. Вычисление коэффициента стойкости К (отношение концентрации свободного пролина для каждой концентрации соли к исходному содержанию его в условиях без засоления) показало, что пропорционально увеличению концентраций солей происходило увеличение содержания пролина. Выявленная зависимость свидетельствует о том, что при невысокой активности СОД основную роль в нейтрализации образующегося супероксидного радикала выполняет пролин.
Ключевые слова: кадмий; активные формы кислорода; пролин; супероксиддисмутаза; перекисное окисление липидов.
Введение
Кадмий относится к наиболее токсичным тяжелым металлам, оказывающим отрицательное влияние на растения, животных и человека. У растений он вызывает торможение роста и развития, снижение интенсивности фотосинтеза и дыхания, нарушение транспирации и минерального обмена [1]. Эти нарушения связаны с развитием в клетках и тканях растений окислительного стресса, основной причиной которого является образование чрезмерного количества активных форм кислорода (АФК). Устойчивость растений к окислительному стрессу обусловлена наличием у них достаточно эффективной антиоксидантной системы, представленной ферментами и низкомолекулярными соединениями [2, 3].
Так как кадмий в почве представлен в виде сульфатов, сульфидов, карбонатов и других солей, то реакция растений на действие металла зависит не только от биологических особенностей вида и сорта растений, условий выращивания, но и от состава соли. В связи с этим основная цель нашего исследования состояла в изучении влияния солей кадмия, отличающихся анионом, на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) как показателя интенсивности окислительного стресса, а также изучения активности супероксиддисмутазы (СОД) и содержания пролина как факторов, определяющих работу антиоксидантной системы.
Материалы и методика исследования
В качестве объекта исследования были выбраны растения тритикале (Triticosecale Wittm.) сорта ПРАГ-530. Семена тритикале проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге: в контроле - на дистиллированной воде, в опыте - на растворах CdSO4 и Cd(CH3COO)2 с концентрациями 10 -10-3М. Растения выращивали при комнатной температуре и естественном освещении. На 7-е сутки эксперимента действие солей кадмия на проростки оценивали биометрическим (высоте и массе надземной части проростков) и биохимическим (активность СОД, ПОЛ и содержание пролина в листьях проростков) показателям.
Определение активности СОД проводили по методу, основанному на способности фермента ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия, согласно [4].
Интенсивность ПОЛ в листьях растений определяли методом, основанном на образовании окрашенного комплекса малонового диальдегида (МДА) с тиобарбитуровой кислотой [5].
Экстракцию и определение свободного пролина проводили нингидриновым методом [6].
В таблицах представлены средние арифметические значения и их стандартные отклонения в трех независимых опытах, каждый из которых проведен в трехкратной биологической повторности. Обработку данных проводили методами математической статистики с использованием MS Excel 2003. Достоверность различий оценивали с помощью критерия Стьюдента при p < 0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Результаты опытов по изучению влияния солей кадмия на интенсивность ростовых процессов показали, что реакция растений тритикале на воздействие CdSO4 и Cd(CH3COO)2 однотипна - с увеличением концентрации солей наблюдалось снижение достигнутых показателей роста линейных размеров побегов и их биомассы (табл. 1). Ответная реакция проростков тритикале на обе соли при концентрации 10-4 М была примерно одинаковой. При увеличении концентрации амплитуда изменений параметров роста отличалась: при 10-3 М длина побега в присутствии CdSO4 была меньше, чем в контроле, в 3,7 раза, а масса - в 2,9 раза; а в присутствии Cd(CH3COO)2 - соответственно в 2,8 и 2,6 раза.
Таблица 1. Влияние CdSO4 и С^СНзСОО)2 на накопление биомассы и высоту побега 7-суточных проростков тритикале сорта ПРАГ-530
Концентрация солей (М) Сс! 1804 Са(СИ3С00)2
Длина побега (см) Масса побега (мг) Длина побега (см) Масса побега (мг)
Контроль 10-4 5-10-4 10-3 12,4±0,82 9,7±0,36* 4,6±0,27* 3,4±0,11* 97,1±5,80 73,6±3,11* 48,1±1,15* 33,3±0,98 * 12,4±0,82 9,8±1,35 6,9±0,96* 4,4±0,36* 97,1±5,80 68,2±2,11* 51,2±1,07* 37,1±0,73 *
Примечание: * - здесь и в таблицах 2 и 3 различия по отношению к контролю достоверны при р < 0,05.
Результаты, полученные в наших опытах, подтверждают многочисленные литературные данные о том, что токсическое действие кадмия проявляется в ингибировании роста, в уменьшении линейных размеров побегов и снижении накопления биомассы. Торможение роста можно рассматривать в качестве защитно-приспособительной реакции, в результате которой происходит как снижение интенсивности клеточных делений, так и перестройка метаболизма [7].
Различия в степени ингибирования роста в растворах сульфата и ацетата кадмия, по-видимому, связаны с разной кислотностью этих двух солей. Известно, что поглощающие свойства растений изменяются в зависимости от рН среды. Высокая кислотность увеличивает проницаемость мембран, подкисляет клеточный сок и ухудшает углеводный и фосфорный обмен [8, 9]. При концентрации 10-3 М раствор Сё804 является более кислой солью (рН 5,7) по сравнению с раствором Сё(СЫ3С00)2 (рН 6,5).
Одним из эффектов у растений, проявляющихся в условиях стресса, является ПОЛ, вызванное образованием АФК [1]. Результаты наших экспериментов показали, что общий характер изменений уровня МДА (конечного продукта ПОЛ) является сходным при действии обеих солей кадмия и соответствует зависимости доза-эффект, когда по мере увеличения концентрации солей существенно увеличивается содержание МДА (табл. 2).
Исследования действия СёБ04 и Сё(СЫ3С00)2 в концентрации 10-4 М на проростки тритикале дали близкие результаты по образованию продуктов ПОЛ, уровень которого оказался выше контрольных значений примерно на 27 %. С увеличением концентрации солей проявились различия в ответной реакции растений на действие сульфата и ацетата кадмия: образование МДА более интенсивно происходило в присутствии Сё(СЫ3С00)2 и превысило контрольные значения соответственно при концентрации 5-10-4 М и 10-3 М на 72 и 115 %, а в присутствии СёБ04 - только на 51 и 62 %.
Таким образом, с повышением концентрации ионов кадмия в среде выращивания проростков тритикале наблюдалось существенное нарастание процессов свободнора-дикального окисления в клетках. В условиях длительного воздействия тяжелого металла адаптационные ресурсы организма исчерпываются, возрастает концентрация АФК, которая может нарушать метаболические процессы путем окислительного повреждения белков, липидов и нуклеиновых кислот [1].
Таблица 2. Интенсивность ПОЛ в листьях 7-суточных проростков тритикале сорта ПРАГ-530 при действии CdSO4 и Cd(CHзCOO)2_
Концентрация солей кадмия (М)
Са804
МДА (нМоль/мг сырой массы)
Са(СИ3С00)2
Контроль 10-4 5-10-4 10-3
39±1,1 50±1,2* 59±2,6* 63±1,1*
39±1,1 49±2,7* 67±0,4* 84±4,3*
С другой стороны, растения содержат антиоксидантную систему, включающую в себя антиоксидантные ферменты и низкомолекулярные протекторные соединения. Ключевым антиоксидантным ферментом, осуществляющим реакцию дисмутации супероксид-радикала с образованием молекул кислорода и пероксида водорода, является СОД. Увеличение активности СОД наблюдали во многих растениях, обработанных тяжелыми металлами [10, 11]. Однако в данном исследовании при всех концентрациях солей кадмия активность СОД не отличалась от контрольных значений (табл. 3).
Таблица 3. Содержание пролина и активность СОД в листьях 7-суточных проростков тритикале сорта ПРАГ-530 при действии солей CdSO4 и С^СН3СОО)г
Концентрация солей кадмия (М) Пролин (мкМ/мг сырой массы) СОД (усл. ед./мг сырой массы)
са804 К са(си3с0 0)2 К са804 са(сн3с00)2
Контроль 10-4 5-10-4 10-3 1,10±0,07 1,29±0,05 2,99±0,76* 6,37±0,99* 1,17 2,72 5,79 1,10±0,07 1,51± ,07* 2,20± ,18* 3,69± ,96* 1,37 2,0 3,35 0,55±0,04 0,52±0,09 0,53±0,04 0,57±0,02 0,55±0,04 0,46±0,04 0,44±0,02 0,55±0,03
Возможно, это связано с тем, что растения используют ферментативную составляющую антиоксидантной системы в первые часы действия стрессового фактора. На более поздних этапах адаптационного процесса, когда в результате работы фермента СОД накапливается пероксид водорода, являющийся ингибитором СОД, токсический эффект кадмия становится достаточным для подавления других антиоксидантных ферментов в листьях тритикале, происходит накопление АФК, которые усиливают ПОЛ мембранных систем. В этих условиях в устранении избыточных количеств АФК наряду с антиоксидантными ферментами участвуют и низкомолекулярные соединения, такие, как пролин. Известно, что накопление свободного пролина у растений является одной из неспецифических реакций растений на действие стрессоров - высоких и низких температур, засоления, засухи, а также тяжелых металлов [12].
Биологические функции пролина многообразны. Он является осмопротектором, вовлекается в регуляцию рН клетки, обладает антиоксидантным действием, понижая количество АФК. В экстремальных условиях пролин поддерживает нативную структуру макромолекул и способствует сохранению их биологических функций, является дополнительным источником энергии и азота [8]. Ранее нами была показана аккумуляция пролина в листьях и корнях тритикале под действием сульфата кадмия и нитрата свинца [3].
Как показывают данные, представленные в табл. 3, при вычислении коэффициента стойкости К (отношение концентрации свободного пролина для каждой концентрации соли к исходному содержанию его в условиях без засоления) [13] было установлено, что под влиянием сёБ04 и Сё(СИ3СОО)2 в концентрации 10-4 М уровень пролина в листьях проростков тритикале лишь незначительно увеличивается. С увеличением концентраций солей пропорционально увеличивалось и содержание пролина. Выявленная зависимость свидетельствует о том, что при невысокой активности СОД основную роль в нейтрализации образующегося супероксидного радикала выполняет пролин.
Выводы
На основании сравнительного анализа действия сульфата кадмия и ацетата кадмия в возрастающих концентрациях на параметры роста и биохимические показатели проростков тритикале можно сделать следующие выводы:
1. Длительное (7 сут.) воздействие CdSO4 и Cd(CH3COO)2 с концентрациями 10-5-10-4 М сопровождалось заметным торможением роста и снижением биомассы надземной части побегов тритикале.
2. Повышение активности ПОЛ в этих условиях свидетельствует о развитии окислительного стресса в клетках тритикале. Более высокая скорость процессов ПОЛ может быть обусловлена более кислыми значениями рН CdSO4 по сравнению с Cd(CH3COO)2.
3. Предотвращение окислительного стресса, вызванного солями кадмия, в листьях проростков тритикале осуществляет пролин.
Литература
1. Shah R., Kumar R.G., Verma S., Dubey R.S. Effect of cadmium on lipid peroxidation, superoxide anion generationand activities of antioxidant enzymes in growing rise seedlings // Plant Science. - 2001. - Vol. 161, № 6. - P. 1135-1144.
2. Титов А.Ф., Казнина Н.М., Таланова В.В. Тяжелые металлы и растения. -Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2014. - 194 с.
3. Абилова Г.А. Влияние ионов кадмия и свинца на рост и содержание пролина в растениях тритикале (Triticosecale Wittm.) // Труды Карельского научного центра РАН. Сер. Экспериментальная биология. - 2016. - № 11. - С. 27-33.
4. Giannopolitis C.N., Ries S.K. Superoxide dismutase. 1. Occurrence in higher plants // Plant Physiology. - 1977. - Vol. 59, № 2. - P. 309-314.
5. Heath R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. 1. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation // Arch. Biochem. Biophys. - 1968. - Vol. 125, № 1. - P. 189-198.
6. Bates L.S. Rapid determination of free proline for stress studies // Plant Soil. -1973. - Vol. 39, № 1. - P. 205-207.
7. Серегин И.В. Распределение тяжелых металлов в растениях и их действие на рост: автореф. дис. ... д. биол. наук. - М., 2009. - 53 с.
8. LiangX., Zhang L., Natarajan S.K., Becker D.F. Proline mechanisms of stress survival // Antioxidants and Redox Signaling. - 2013. - Vol. 19, № 9. - Р. 998-1011.
9. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. Т. 2. - М.: Юрайт, 2016. - 259 с.
10. Miller A-F. Superoxide dismutases: ancient enzymes and new insights // FEBS Letters. - 2012. - Vol. 586. - Р. 585-595.
11. Gill S.S., Anjum N.A., Gill R., Yadav S., Hasanuzzaman M., Fujita M., Mishra P., Sabat S., Tuteja N. Superoxide dismutase - mentor of abiotic stress tolerance in crop plants // Environmental Science and Pollution Research. - 2015. - Vol. 22, № 14. - Р. 10375-10394.
12. Колупаев Ю.Е., Вайнер А.А., Ястреб Т.О. Пролин: физиологические функции и регуляция содержания в растениях в стрессовых условиях // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Сер. Биология. - 2014. - Вып. 2 (32). - С. 6-22.
13. Юркевич Л.Н, Потопальский А.И. Пролин как фактор устойчивости ржи к засолению субстрата // Физиология и биохимия культурных растений. - 1994. - Т. 26, № 6. - С. 600-604.
Поступила в редакцию 22 января 2017 г.
UDC 581.19:546
DOI: 10.21779/2542-0321-2017-32-1-75-80
The effect of cadmium sulphate and acetate on some physiological processes of seedlings triticale (Triticosecale Wittm.)
G.A. Abilova
Dagestan State University; Russia, 367001, Makhachkala, M. Gadzhiyev st., 43a; gulyaraabi-lova@mail.ru
A study of the effect of cadmium salts on the seedlings of triticale (Triticosecale Wittm.) PRAGgrade 530 has been carried out. For this purpose seeds were couched in Petri's cups at the room temperature and natural lighting within 7 days with periodic watering by solutions of sulfate and acetate of cadmium (concentration of connections 10-4-10-3M). Both salts inhibit the growth and accumulation of biomass triticale sprouts. At salt concentrations of 5 10-4 and 5 10-3 M the growth inhibition occurred to a greater extent by the action of CdSO4 compared to Cd(CH3COO)2.Inhibition of growth is regarded as protective and adaptive reaction, which resulted in a decrease in the intensity of cell division and restructuring of metabolism.
The effect of salts of cadmium is accompanied by an increase in the content of the cells of seedlings triticale of the end product of lipid peroxidation - malonic dialdehyde (MDA). The nature of MDA changes correspond to dose-effect when increasing salt concentration increased MDA content significantly. The observed changes in the intensity of the growth of seedlings and strengthening the intensity of lipid peroxidation, presumably, were the result of oxidative stress and the formation of reactive oxygen species (ROS). The evaluation of antioxidant processes was done by measuring the activity of SOD enzyme. At all concentrations of cadmium salts SOD the activity did not differ from the control values. Perhaps, this is due to the fact that plants use the enzyme component of the antioxidant system in the early hours of stress factor action. In the later stages of the adaptation process, as a result of the work of enzyme SOD, the hydrogen peroxide, which is an inhibitor of SOD, is accumulated and the toxic effect of cadmium becomes sufficient for the suppression of other antioxidant enzymes in leaves of triticale, as well as an accumulation of ROS takes place, which increase lipid peroxidation of membrane systems. The removal of excess quantities of the ROS is carried out by low-molecular antioxidants, including proline. The calculation of the resistance coefficient K (ratio of free proline for each salt concentration to its initial concentration without salinization) showed that the amount of proline increased proportionally to increasing salt concentrations. The observed dependence indicates that at low SOD activity proline plays the key role in the neutralization of the super-oxide radical.
Keywords: cadmium; reactive oxygen species; proline; superoxide dismutase; lipid peroxidation.
Received 22 January, 2017
